Das Zebrafish Tol2-System: Ein modularer und flexibler Gateway-basierter Transgenese-Ansatz
Summary
Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für das modulare Tol2-Transgenese-System, eine Gateway-basierte Klonierungsmethode zur Herstellung und Injektion transgener Konstrukte in Zebrafischembryonen.
Abstract
Fetale Alkoholspektrumstörungen (FASD) sind durch eine sehr variable Reihe von strukturellen Defekten und kognitiven Beeinträchtigungen gekennzeichnet, die aufgrund einer pränatalen Ethanolexposition auftreten. Aufgrund der komplexen Pathologie von FASD haben sich Tiermodelle als entscheidend für unser aktuelles Verständnis von Ethanol-induzierten Entwicklungsdefekten erwiesen. Zebrafische haben sich aufgrund des hohen Erhaltungsgrades sowohl der Genetik als auch der Entwicklung zwischen Zebrafisch und Mensch als leistungsfähiges Modell zur Untersuchung ethanolinduzierter Entwicklungsdefekte erwiesen. Als Modellsystem besitzen Zebrafische viele Eigenschaften, die sie ideal für Entwicklungsstudien machen, darunter eine große Anzahl von extern befruchteten Embryonen, die genetisch beherrschbar und durchscheinend sind. Dies ermöglicht es den Forschern, den Zeitpunkt und die Dosierung der Ethanolexposition in mehreren genetischen Kontexten genau zu steuern. Ein wichtiges genetisches Werkzeug, das im Zebrafisch zur Verfügung steht, ist die Transgenese. Die Generierung transgener Konstrukte und die Etablierung transgener Linien kann jedoch komplex und schwierig sein. Um dieses Problem zu lösen, haben Zebrafischforscher das Transposon-basierte Tol2-Transgenesesystem etabliert. Dieses modulare System verwendet einen Multisite-Gateway-Klonierungsansatz für den schnellen Zusammenbau kompletter Tol2-Transposon-basierter transgener Konstrukte. Hier beschreiben wir die flexible Tol2-System-Toolbox und ein Protokoll zur Generierung transgener Konstrukte, die für die Zebrafisch-Transgenese und deren Verwendung in Ethanolstudien bereit sind.
Introduction
Die pränatale Ethanolexposition führt zu einem Kontinuum struktureller Defizite und kognitiver Beeinträchtigungen, die als fetale Alkoholspektrumstörungen (FASD) bezeichnet werden1,2,3,4. Die komplexen Beziehungen zwischen mehreren Faktoren machen es schwierig, die Ätiologie von FASD beim Menschen zu untersuchen und zu verstehen. Um diese Herausforderung zu lösen, wurde eine Vielzahl von Tiermodellen verwendet. Die biologischen und experimentellen Werkzeuge, die in diesen Modellen zur Verfügung stehen, haben sich als entscheidend für die Entwicklung unseres Verständnisses der mechanistischen Grundlagen der Ethanol-Teratogenität erwiesen, und die Ergebnisse dieser Modellsysteme stimmen bemerkenswert mit dem überein, was in humanen Ethanolstudien gefunden wurde 5,6. Unter diesen haben sich Zebrafische zu einem leistungsfähigen Modell für die Untersuchung der Ethanol-Teratogeneseentwickelt 7,8, was zum Teil auf ihre externe Befruchtung, ihre hohe Fruchtbarkeit, ihre genetische Lenkbarkeit und ihre durchscheinenden Embryonen zurückzuführen ist. Diese Stärken zusammen machen Zebrafische ideal für Echtzeit-Live-Bildgebungsstudien von FASD mit transgenen Zebrafischlinien.
Transgene Zebrafische wurden ausgiebig verwendet, um verschiedene Aspekte der Embryonalentwicklung zu untersuchen9. Die Herstellung transgener Konstrukte und nachfolgender transgener Linien kann jedoch äußerst schwierig sein. Ein Standard-Transgen benötigt ein aktives Promotorelement, um das Transgen anzutreiben, und ein Poly-A-Signal oder einen “Schwanz”, alles in einem stabilen bakteriellen Vektor für die allgemeine Vektorerhaltung. Die traditionelle Erzeugung eines transgenen Mehrkomponentenkonstrukts erfordert mehrere zeitaufwändige Unterklonierungsschritte10. PCR-basierte Ansätze, wie z. B. die Gibson-Assemblierung, können einige der Probleme umgehen, die mit dem Subklonen verbunden sind. Für die Erzeugung jedes einzigartigen transgenen Konstrukts müssen jedoch einzigartige Primer entworfen und getestet werden10. Neben der Konstruktion von Transgenen waren auch die genomische Integration, die Übertragung der Keimbahn und das Screening auf eine ordnungsgemäße Transgenintegration schwierig. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Verwendung des Transposon-basierten Tol2-Transgenesesystems (Tol2Kit)10,11. Dieses modulare System nutzt das Klonen von Gateways an mehreren Standorten, um schnell mehrere transgene Konstrukte aus einer ständig wachsenden Bibliothek von “Eingangs”- und “Ziel”-Vektoren zu generieren. Integrierte Tol2-transponierbare Elemente erhöhen die Transgeneserate erheblich und ermöglichen die schnelle Konstruktion und genomische Integration mehrerer Transgene. Mit Hilfe dieses Systems zeigen wir, wie die Generierung einer endodermen transgenen Zebrafischlinie genutzt werden kann, um die gewebespezifischen strukturellen Defekte zu untersuchen, die FASD zugrunde liegen. Letztendlich zeigen wir in diesem Protokoll, dass der modulare Aufbau und die Konstruktion transgener Konstrukte die FASD-Forschung auf Zebrafischbasis sehr unterstützen werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafische eignen sich hervorragend, um die Auswirkungen einer Ethanolexposition auf Entwicklungs- und Krankheitszustände zu untersuchen 7,8. Zebrafische produzieren eine große Anzahl von durchscheinenden, extern befruchteten, genetisch beherrschbaren Embryonen, was die Live-Bildgebung mehrerer transgenmarkierter Gewebe und Zelltypen gleichzeitig in mehreren Umweltkontexten ermöglicht19,20. Diese Stä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die in diesem Artikel vorgestellte Forschung wurde durch einen Zuschuss der National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 an C.B.L. unterstützt.
Materials
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawsone Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
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