Summary

Система Zerio Tol2: модульный и гибкий подход к трансгенезу на основе шлюза

Published: November 30, 2022
doi:

Summary

В этой работе описывается протокол модульной системы трансгенеза Tol2, метода клонирования на основе шлюза для создания и введения трансгенных конструкций в эмбрионы рыбок данио.

Abstract

Расстройства алкогольного спектра плода (FASD) характеризуются сильно варьирующимся набором структурных дефектов и когнитивных нарушений, которые возникают из-за пренатального воздействия этанола. Из-за сложной патологии ФАСН животные модели оказались критически важными для нашего нынешнего понимания дефектов развития, вызванных этанолом. Рыбки данио-рерио оказались мощной моделью для изучения дефектов развития, вызванных этанолом, из-за высокой степени сохранения как генетики, так и развития между рыбками данио-рерио и людьми. Как модельная система, рыбки данио-рерио обладают многими атрибутами, которые делают их идеальными для исследований развития, включая большое количество внешне оплодотворенных эмбрионов, которые генетически поддаются обработке и полупрозрачны. Это позволяет исследователям точно контролировать время и дозировку воздействия этанола в нескольких генетических контекстах. Одним из важных генетических инструментов, доступных у рыбок данио, является трансгенез. Однако создание трансгенных конструкций и установление трансгенных линий может быть сложным и трудным. Чтобы решить эту проблему, исследователи рыбок данио-рерио создали систему трансгенеза Tol2 на основе транспозонов. Эта модульная система использует многосайтовый подход клонирования шлюза для быстрой сборки полных трансгенных конструкций на основе транспозонов Tol2. Здесь мы описываем гибкий набор инструментов системы Tol2 и протокол для создания трансгенных конструкций, готовых к трансгенезу рыбок данио, и их использования в исследованиях этанола.

Introduction

Пренатальное воздействие этанола приводит к континууму структурных дефицитов и когнитивных нарушений, называемых расстройствами алкогольного спектра плода (FASD)1,2,3,4. Сложные взаимосвязи между несколькими факторами затрудняют изучение и понимание этиологии ФАСН у людей. Для решения этой проблемы были использованы самые разные модели животных. Биологические и экспериментальные инструменты, доступные в этих моделях, оказались решающими в развитии нашего понимания механистической основы тератогенности этанола, и результаты этих модельных систем удивительно согласуются с тем, что было обнаружено в исследованиях этанола на людях 5,6. Среди них рыбки данио-рерио стали мощной моделью для изучения тератогенезаэтанола 7,8, отчасти из-за их внешнего оплодотворения, высокой плодовитости, генетической обрабатываемости и полупрозрачных эмбрионов. Эти сильные стороны в совокупности делают рыбок данио-рерио идеальными для исследований ФАСН в реальном времени с использованием трансгенных линий рыбок данио.

Трансгенные рыбки данио-рерио широко используются для изучения многочисленных аспектов эмбрионального развития9. Однако создание трансгенных конструкций и последующих трансгенных линий может быть чрезвычайно трудным. Стандартный трансген требует активного промоторного элемента для управления трансгеном и поли-А-сигнала или «хвоста», и все это в стабильном бактериальном векторе для общего поддержания вектора. Традиционная генерация многокомпонентной трансгенной конструкции требует нескольких трудоемких этапов субклонирования10. Подходы, основанные на ПЦР, такие как сборка Гибсона, могут обойти некоторые проблемы, связанные с субклонированием. Тем не менее, уникальные праймеры должны быть разработаны и испытаны для генерации каждой уникальной трансгенной конструкции10. Помимо конструирования трансгенов, геномная интеграция, передача зародышевой линии и скрининг на надлежащую интеграцию трансгенов также были затруднены. Здесь мы описываем протокол использования системы трансгенеза Tol2 на основе транспозонов (Tol2Kit)10,11. Эта модульная система использует многосайтовое клонирование шлюза для быстрого создания нескольких трансгенных конструкций из постоянно расширяющейся библиотеки векторов «входа» и «назначения». Интегрированные переносимые элементы Tol2 значительно увеличивают скорость трансгенеза, обеспечивая быстрое построение и геномную интеграцию нескольких трансгенов. Используя эту систему, мы показываем, как генерация трансгенной линии эндодермы данио-рерио может быть использована для изучения тканеспецифических структурных дефектов, лежащих в основе FASD. В конечном счете, в этом протоколе мы показываем, что модульная установка и построение трансгенных конструкций значительно помогут исследованиям ФАСН на основе рыбок данио.

Protocol

Все эмбрионы рыбок данио, используемые в этой процедуре, были выращены и разведены в соответствии с установленными протоколами IACUC12. Эти протоколы были одобрены Университетом Луисвилля. ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались штамм рыбок данио-рерио…

Representative Results

Для генерации трансгенных конструкций мы использовали систему трансгенеза Tol2. Три входных вектора, в том числе p5E, который содержит элементы промотора/энхансера гена, pME, который удерживает ген, экспрессируемый элементами промотора/энхансера, и p3E, который, как минимум, удерживает хвост …

Discussion

Рыбки данио-рерио идеально подходят для изучения влияния воздействия этанола на развитие и болезненные состояния 7,8. Рыбки данио-рерио производят большое количество полупрозрачных, оплодотворенных, генетически обрабатываемых эмбрионов, что позволяет ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Исследование, представленное в этой статье, было поддержано грантом Национального института здравоохранения / Национального института по борьбе со злоупотреблением алкоголем (NIH / NIAAA) R00AA023560 для C.B.L.

Materials

Addgene Tol2 toolbox https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
Air Provided directly by the university
Ampicillin Fisher Scientific BP1760
Analytical Balance VWR 10204-962
Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary FHC 30-30-0
Calcium Chloride VWR 97062-590
Chloramphenicol BioVision 2486
EDTA Fisher Scientific BP118-500
Fluorescent Dissecting Microscope Olympus SZX16
Kanamycin Fisher Scientific BP906
Laser Scanning Confocal Microscope Olympus Fluoview FV1000
Lawsone Lab Donor Plasmid Prep https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB Agar Fisher Scientific BP9724
LB Broth Fisher Scientific BP1426
Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose Fisher Scientific BP160-500
LR Clonase II Plus Enzyme Fisher Scientific 12538200
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Micro Pipette holder Applied Scientific Instrumentation MIMPH-M-PIP
Microcentrifuge tube 0.5 mL  VWR 10025-724
Microcentrifuge tube 1.5 mL  VWR 10025-716
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Micropipette tips 10 μL  Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL  Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL  Fisher Scientific 13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Fisher Scientific AM1340
Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
NanoDrop Spectrophotometer NanoDrop ND-1000
NcoI NEB R0189S
NotI NEB R0189S
Petri dishes 100 mm  Fisher Scientific FB012924
Phenol Red sodium salt Sigma Aldrich P4758-5G
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pressure Injector Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Stericup .22 µm vacuum filtration system  Millipore SCGPU11RE
Tol2 Wiki Page http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 Chemically Competent E. coli Fisher Scientific C404010
Vertical Pipetter Puller David Kopf Instruments 720
Zebrafish microinjection mold Adaptive Science Tools i34

References

  1. Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
  2. Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
  3. Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
  4. Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
  5. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
  6. Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).
  7. Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460 (2021).
  8. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
  9. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).
  10. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  11. Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
  12. Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  13. Protocols. UMass Chan Medical School Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017)
  14. Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
  15. Chung, W. -. S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
  16. Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
  17. Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
  18. Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).
  19. Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).
  20. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
  21. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
  22. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  23. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  24. Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).

Play Video

Cite This Article
Klem, J. R., Gray, R., Lovely, C. B. The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach. J. Vis. Exp. (189), e64679, doi:10.3791/64679 (2022).

View Video