Summary

Het Zebrafish Tol2-systeem: een modulaire en flexibele gateway-gebaseerde transgenesebenadering

Published: November 30, 2022
doi:

Summary

Dit werk beschrijft een protocol voor het modulaire Tol2-transgenesesysteem, een gateway-gebaseerde kloonmethode om transgene constructies in zebravisembryo’s te creëren en te injecteren.

Abstract

Foetale alcoholspectrumstoornissen (FASD) worden gekenmerkt door een zeer variabele reeks structurele defecten en cognitieve stoornissen die optreden als gevolg van prenatale blootstelling aan ethanol. Vanwege de complexe pathologie van FASD zijn diermodellen van cruciaal belang gebleken voor ons huidige begrip van door ethanol geïnduceerde ontwikkelingsdefecten. Zebravissen hebben bewezen een krachtig model te zijn om door ethanol geïnduceerde ontwikkelingsdefecten te onderzoeken vanwege de hoge mate van behoud van zowel genetica als ontwikkeling tussen zebravissen en mensen. Als modelsysteem bezitten zebravissen veel eigenschappen die ze ideaal maken voor ontwikkelingsstudies, waaronder grote aantallen uitwendig bevruchte embryo’s die genetisch traceerbaar en doorschijnend zijn. Dit stelt onderzoekers in staat om de timing en dosering van blootstelling aan ethanol in meerdere genetische contexten nauwkeurig te regelen. Een belangrijk genetisch hulpmiddel dat beschikbaar is bij zebravissen is transgenese. Het genereren van transgene constructies en het vaststellen van transgene lijnen kan echter complex en moeilijk zijn. Om dit probleem aan te pakken, hebben zebravisonderzoekers het op transposon gebaseerde Tol2-transgenesesysteem opgezet. Dit modulaire systeem maakt gebruik van een multisite Gateway-kloonbenadering voor de snelle assemblage van complete Tol2 transposon-gebaseerde transgene constructies. Hier beschrijven we de flexibele Tol2-systeemtoolbox en een protocol voor het genereren van transgene constructies die klaar zijn voor zebravistransgenese en hun gebruik in ethanolstudies.

Introduction

Prenatale blootstelling aan ethanol geeft aanleiding tot een continuüm van structurele tekorten en cognitieve stoornissen die foetale alcoholspectrumstoornissen (FASD) worden genoemd1,2,3,4. De complexe relaties tussen meerdere factoren maken het bestuderen en begrijpen van de etiologie van FASD bij mensen een uitdaging. Om deze uitdaging op te lossen, is een grote verscheidenheid aan diermodellen gebruikt. De biologische en experimentele hulpmiddelen die beschikbaar zijn in deze modellen zijn cruciaal gebleken bij het ontwikkelen van ons begrip van de mechanistische basis van ethanolteratogeniciteit, en de resultaten van deze modelsystemen zijn opmerkelijk consistent met wat wordt gevonden in humane ethanolstudies 5,6. Onder deze zijn zebravissen naar voren gekomen als een krachtig model om ethanolteratogenese7,8 te bestuderen, deels vanwege hun externe bevruchting, hoge vruchtbaarheid, genetische tractie en doorschijnende embryo’s. Deze sterke punten combineren om zebravissen ideaal te maken voor real-time live beeldvormingsstudies van FASD met behulp van transgene zebravislijnen.

Transgene zebravissen zijn op grote schaal gebruikt om meerdere aspecten van de embryonale ontwikkeling te bestuderen9. Het creëren van transgene constructies en daaropvolgende transgene lijnen kan echter buitengewoon moeilijk zijn. Een standaard transgen vereist een actief promotorelement om het transgen en een poly A-signaal of “staart” aan te sturen, allemaal in een stabiele bacteriële vector voor algemeen vectoronderhoud. De traditionele generatie van een multi-component transgeen construct vereist meerdere tijdrovende sub-klonenstappen 10. PCR-gebaseerde benaderingen, zoals Gibson-assemblage, kunnen enkele van de problemen in verband met subklonen omzeilen. Unieke primers moeten echter worden ontworpen en getest voor het genereren van elke unieke transgene constructie10. Naast transgenconstructie zijn genomische integratie, kiembaantransmissie en screening op een goede transgenintegratie ook moeilijk geweest. Hier beschrijven we een protocol voor het gebruik van het transposon-gebaseerde Tol2-transgenesesysteem (Tol2Kit)10,11. Dit modulaire systeem maakt gebruik van multisite Gateway-klonen om snel meerdere transgene constructies te genereren uit een steeds groter wordende bibliotheek van “entry” en “destination” vectoren. Geïntegreerde Tol2 transponeerbare elementen verhogen de snelheid van transgenese aanzienlijk, waardoor de snelle constructie en genomische integratie van meerdere transgenen mogelijk is. Met behulp van dit systeem laten we zien hoe de generatie van een endoderm transgene zebravislijn kan worden gebruikt om de weefselspecifieke structurele defecten die ten grondslag liggen aan FASD te bestuderen. Uiteindelijk laten we in dit protocol zien dat de modulaire opzet en de constructie van transgene constructies het op zebravissen gebaseerde FASD-onderzoek enorm zal helpen.

Protocol

Alle zebravisembryo’s die in deze procedure werden gebruikt, werden grootgebracht en gefokt volgens de vastgestelde IACUC-protocollen12. Deze protocollen werden goedgekeurd door de Universiteit van Louisville. OPMERKING: De wild-type zebravis stam, AB, en de bmp4st72;smad5b1100 dubbele mutant lijn werden gebruikt in deze studie. Al het water dat bij deze procedure werd gebruikt, was steriel omgekeerde osmosewater. Confocale beelden werden …

Representative Results

Om de transgene constructen te genereren, gebruikten we het Tol2-transgenesesysteem. Drie ingangsvectoren, waaronder p5E, dat de genpromotor/enhancer-elementen bevat, pME, dat het gen bevat dat tot expressie moet worden gebracht door de promotor/enhancer-elementen, en p3E, dat minimaal de polyA-staart bevat, werden gebruikt om het transgene construct te genereren via multisite gateway LR-klonen. De bestemmingsvector, pDest, levert de Tol2-herhalingen voor de genomische insertie van het transgene construct in zeb…

Discussion

Zebravissen zijn bij uitstek geschikt voor het bestuderen van de impact van blootstelling aan ethanol op ontwikkeling en ziektetoestanden 7,8. Zebravissen produceren grote aantallen doorschijnende, extern bevruchte, genetisch verhandelbare embryo’s, waardoor verschillende transgen-gelabelde weefsels en celtypen tegelijkertijd in meerdere omgevingscontexten live kunnen worden afgebeeld19,20. Deze sterke pu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Het onderzoek dat in dit artikel wordt gepresenteerd, werd ondersteund door een subsidie van de National Institutes of Health / National Institute on Alcohol Abuse (NIH / NIAAA) R00AA023560 aan C.B.L.

Materials

Addgene Tol2 toolbox https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
Air Provided directly by the university
Ampicillin Fisher Scientific BP1760
Analytical Balance VWR 10204-962
Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary FHC 30-30-0
Calcium Chloride VWR 97062-590
Chloramphenicol BioVision 2486
EDTA Fisher Scientific BP118-500
Fluorescent Dissecting Microscope Olympus SZX16
Kanamycin Fisher Scientific BP906
Laser Scanning Confocal Microscope Olympus Fluoview FV1000
Lawsone Lab Donor Plasmid Prep https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB Agar Fisher Scientific BP9724
LB Broth Fisher Scientific BP1426
Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose Fisher Scientific BP160-500
LR Clonase II Plus Enzyme Fisher Scientific 12538200
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Micro Pipette holder Applied Scientific Instrumentation MIMPH-M-PIP
Microcentrifuge tube 0.5 mL  VWR 10025-724
Microcentrifuge tube 1.5 mL  VWR 10025-716
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Micropipette tips 10 μL  Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL  Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL  Fisher Scientific 13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Fisher Scientific AM1340
Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
NanoDrop Spectrophotometer NanoDrop ND-1000
NcoI NEB R0189S
NotI NEB R0189S
Petri dishes 100 mm  Fisher Scientific FB012924
Phenol Red sodium salt Sigma Aldrich P4758-5G
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pressure Injector Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Stericup .22 µm vacuum filtration system  Millipore SCGPU11RE
Tol2 Wiki Page http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 Chemically Competent E. coli Fisher Scientific C404010
Vertical Pipetter Puller David Kopf Instruments 720
Zebrafish microinjection mold Adaptive Science Tools i34

References

  1. Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
  2. Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
  3. Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
  4. Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
  5. Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
  6. Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).
  7. Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460 (2021).
  8. Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
  9. Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).
  10. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  11. Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
  12. Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  13. Protocols. UMass Chan Medical School Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017)
  14. Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
  15. Chung, W. -. S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
  16. Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
  17. Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
  18. Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).
  19. Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).
  20. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
  21. Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
  22. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  23. Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
  24. Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).

Play Video

Cite This Article
Klem, J. R., Gray, R., Lovely, C. B. The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach. J. Vis. Exp. (189), e64679, doi:10.3791/64679 (2022).

View Video