Summary

Il sistema Zebrafish Tol2: un approccio di transgenesi modulare e flessibile basato su gateway

Published: November 30, 2022
doi:

Summary

Questo lavoro descrive un protocollo per il sistema modulare di transgenesi Tol2, un metodo di clonazione basato su gateway per creare e iniettare costrutti transgenici in embrioni di zebrafish.

Abstract

I disturbi dello spettro alcolico fetale (FASD) sono caratterizzati da un insieme altamente variabile di difetti strutturali e disturbi cognitivi che insorgono a causa dell’esposizione prenatale all’etanolo. A causa della complessa patologia della FASD, i modelli animali si sono dimostrati fondamentali per la nostra attuale comprensione dei difetti di sviluppo indotti dall’etanolo. I pesci zebra hanno dimostrato di essere un potente modello per esaminare i difetti di sviluppo indotti dall’etanolo a causa dell’alto grado di conservazione sia della genetica che dello sviluppo tra zebrafish e umani. Come sistema modello, i pesci zebra possiedono molti attributi che li rendono ideali per gli studi sullo sviluppo, tra cui un gran numero di embrioni fecondati esternamente che sono geneticamente trattabili e traslucidi. Ciò consente ai ricercatori di controllare con precisione i tempi e il dosaggio dell’esposizione all’etanolo in più contesti genetici. Un importante strumento genetico disponibile nel pesce zebra è la transgenesi. Tuttavia, generare costrutti transgenici e stabilire linee transgeniche può essere complesso e difficile. Per affrontare questo problema, i ricercatori del pesce zebra hanno stabilito il sistema di transgenesi Tol2 basato su trasposoni. Questo sistema modulare utilizza un approccio di clonazione gateway multisito per l’assemblaggio rapido di costrutti transgenici completi basati su trasposoni Tol2. Qui, descriviamo la cassetta degli attrezzi flessibile del sistema Tol2 e un protocollo per generare costrutti transgenici pronti per la transgenesi del pesce zebra e il loro uso negli studi sull’etanolo.

Introduction

L’esposizione prenatale all’etanolo dà origine a un continuum di deficit strutturali e disturbi cognitivi definiti disturbi dello spettro alcolico fetale (FASD)1,2,3,4. Le complesse relazioni tra molteplici fattori rendono difficile lo studio e la comprensione dell’eziologia della FASD negli esseri umani. Per risolvere questa sfida, è stata utilizzata un’ampia varietà di modelli animali. Gli strumenti biologici e sperimentali disponibili in questi modelli si sono dimostrati cruciali nello sviluppo della nostra comprensione delle basi meccanicistiche della teratogenicità dell’etanolo e i risultati di questi sistemi modello sono stati notevolmente coerenti con ciò che si trova negli studi sull’etanolo umano 5,6. Tra questi, i pesci zebra sono emersi come un potente modello per studiare la teratogenesi dell’etanolo7,8, in parte a causa della loro fecondazione esterna, alta fecondità, trattabilità genetica ed embrioni traslucidi. Questi punti di forza si combinano per rendere il pesce zebra ideale per studi di imaging live in tempo reale di FASD utilizzando linee di zebrafish transgeniche.

I pesci zebra transgenici sono stati ampiamente utilizzati per studiare molteplici aspetti dello sviluppo embrionale9. Tuttavia, la creazione di costrutti transgenici e successive linee transgeniche può essere estremamente difficile. Un transgene standard richiede un elemento promotore attivo per guidare il transgene e un segnale o “coda” poli A, il tutto in un vettore batterico stabile per il mantenimento generale del vettore. La generazione tradizionale di un costrutto transgenico multicomponente richiede più fasi di sub-clonazione che richiedono molto tempo10. Gli approcci basati sulla PCR, come l’assemblaggio Gibson, possono aggirare alcuni dei problemi associati alla subclonazione. Tuttavia, primer unici devono essere progettati e testati per la generazione di ogni costrutto transgenico unico10. Oltre alla costruzione del transgene, anche l’integrazione genomica, la trasmissione della linea germinale e lo screening per una corretta integrazione transgenica sono stati difficili. Qui, descriviamo un protocollo per l’utilizzo del sistema di transgenesi Tol2 basato su trasposone (Tol2Kit)10,11. Questo sistema modulare utilizza la clonazione multisito di gateway per generare rapidamente più costrutti transgenici da una libreria in continua espansione di vettori “ingresso” e “destinazione”. Gli elementi trasponibili Tol2 integrati aumentano notevolmente il tasso di transgenesi, consentendo la rapida costruzione e integrazione genomica di più transgeni. Utilizzando questo sistema, mostriamo come la generazione di una linea di zebrafish transgenico endoderma può essere utilizzata per studiare i difetti strutturali tessuto-specifici alla base della FASD. In definitiva, in questo protocollo, dimostriamo che la configurazione modulare e la costruzione di costrutti transgenici aiuteranno notevolmente la ricerca FASD basata sul pesce zebra.

Protocol

Tutti gli embrioni di zebrafish utilizzati in questa procedura sono stati allevati e allevati seguendo i protocolli IACUC stabiliti12. Questi protocolli sono stati approvati dall’Università di Louisville. NOTA: In questo studio sono stati utilizzati il ceppo zebrafish wild-type, AB, e la linea mutante doppia bmp4st72;smad5b1100 . Tutta l’acqua utilizzata in questa procedura era acqua sterile ad osmosi inversa. Le immagini confocali sono s…

Representative Results

Per generare i costrutti transgenici, abbiamo usato il sistema di transgenesi Tol2. Tre vettori di ingresso, tra cui p5E, che contiene gli elementi promotore/potenziatore del gene, pME, che contiene il gene che deve essere espresso dagli elementi promotore/potenziatore, e p3E che, come minimo, detiene la coda polyA, sono stati utilizzati per generare il costrutto transgenico tramite clonazione LR multisite gateway. Il vettore di destinazione, pDest, fornisce le ripetizioni Tol2 per l’inserimento genomico del cos…

Discussion

I pesci zebra sono ideali per studiare l’impatto dell’esposizione all’etanolo sullo sviluppo e sugli stati patologici 7,8. I pesci zebra producono un gran numero di embrioni traslucidi, fecondati esternamente e geneticamente trattabili, che consentono l’imaging dal vivo di diversi tessuti e tipi di cellule marcati con transgene contemporaneamente in più contesti ambientali19,20. Questi punti di forza, co…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La ricerca presentata in questo articolo è stata supportata da una sovvenzione del National Institutes of Health / National Institute on Alcohol Abuse (NIH / NIAAA) R00AA023560 a CBL.

Materials

Addgene Tol2 toolbox https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
Air Provided directly by the university
Ampicillin Fisher Scientific BP1760
Analytical Balance VWR 10204-962
Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary FHC 30-30-0
Calcium Chloride VWR 97062-590
Chloramphenicol BioVision 2486
EDTA Fisher Scientific BP118-500
Fluorescent Dissecting Microscope Olympus SZX16
Kanamycin Fisher Scientific BP906
Laser Scanning Confocal Microscope Olympus Fluoview FV1000
Lawsone Lab Donor Plasmid Prep https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB Agar Fisher Scientific BP9724
LB Broth Fisher Scientific BP1426
Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose Fisher Scientific BP160-500
LR Clonase II Plus Enzyme Fisher Scientific 12538200
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Micro Pipette holder Applied Scientific Instrumentation MIMPH-M-PIP
Microcentrifuge tube 0.5 mL  VWR 10025-724
Microcentrifuge tube 1.5 mL  VWR 10025-716
Micromanipulator Applied Scientific Instrumentation MM33
Micropipette tips 10 μL  Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL  Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL  Fisher Scientific 13611112
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit Fisher Scientific AM1340
Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
NanoDrop Spectrophotometer NanoDrop ND-1000
NcoI NEB R0189S
NotI NEB R0189S
Petri dishes 100 mm  Fisher Scientific FB012924
Phenol Red sodium salt Sigma Aldrich P4758-5G
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pressure Injector Applied Scientific Instrumentation MPPI-3
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Stericup .22 µm vacuum filtration system  Millipore SCGPU11RE
Tol2 Wiki Page http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 Chemically Competent E. coli Fisher Scientific C404010
Vertical Pipetter Puller David Kopf Instruments 720
Zebrafish microinjection mold Adaptive Science Tools i34

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Cite This Article
Klem, J. R., Gray, R., Lovely, C. B. The Zebrafish Tol2 System: A Modular and Flexible Gateway-Based Transgenesis Approach. J. Vis. Exp. (189), e64679, doi:10.3791/64679 (2022).

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