ゼブラフィッシュTol2システム:モジュール式で柔軟なゲートウェイベースのトランスジェネシスアプローチ
Summary
この研究では、トランスジェニックコンストラクトを作成してゼブラフィッシュ胚に注入するためのゲートウェイベースのクローニング方法であるモジュラーTol2トランスジェネシスシステムのプロトコルについて説明します。
Abstract
胎児性アルコールスペクトラム障害(FASD)は、出生前のエタノール曝露によって生じる構造的欠陥および認知障害の非常に多様なセットによって特徴付けられる。FASDの複雑な病理のために、動物モデルはエタノール誘発性発達障害の現在の理解にとって重要であることが証明されています。ゼブラフィッシュは、ゼブラフィッシュとヒトの間の遺伝学と発生の両方の高度な保存のために、エタノール誘発性発達障害を調べるための強力なモデルであることが証明されています。モデルシステムとして、ゼブラフィッシュは、遺伝的に扱いやすく半透明の多数の外部受精胚を含む、発生研究に理想的な多くの属性を持っています。これにより、研究者は複数の遺伝的状況でエタノール曝露のタイミングと投与量を正確に制御することができます。ゼブラフィッシュで利用可能な重要な遺伝的ツールの1つは、遺伝子導入です。しかし、トランスジェニック構築物の生成とトランスジェニック株の確立は複雑で困難な場合があります。この問題に対処するために、ゼブラフィッシュの研究者はトランスポゾンベースのTol2トランスジェネシスシステムを確立しました。このモジュラーシステムは、マルチサイトGatewayクローニングアプローチを使用して、完全なTol2トランスポゾンベースのトランスジェニックコンストラクトを迅速に組み立てます。ここでは、柔軟なTol2システムツールボックスと、ゼブラフィッシュのトランスジェネシスの準備ができているトランスジェニックコンストラクトを生成するためのプロトコルと、エタノール研究におけるそれらの使用について説明します。
Introduction
出生前のエタノール曝露は、胎児アルコールスペクトラム障害(FASD)1,2,3,4と呼ばれる構造的欠損と認知障害の連続を引き起こします。複数の要因間の複雑な関係により、ヒトにおけるFASDの病因の研究と理解は困難になっています。この課題を解決するために、多種多様な動物モデルが使用されてきました。これらのモデルで利用可能な生物学的および実験的ツールは、エタノール催奇形性の機構的基礎の理解を深める上で重要であることが証明されており、これらのモデルシステムからの結果は、ヒトエタノール研究で見られるものと著しく一致しています5,6。これらの中で、ゼブラフィッシュはエタノール催奇形性を研究するための強力なモデルとして浮上しています7,8、部分的には、それらの外部受精、高い繁殖力、遺伝的扱いやすさ、および半透明の胚のために。これらの強みが組み合わさって、ゼブラフィッシュはトランスジェニックゼブラフィッシュ系統を用いたFASDのリアルタイムライブイメージング研究に最適です。
トランスジェニックゼブラフィッシュは、胚発生の複数の側面を研究するために広く使用されています9。しかし、トランスジェニックコンストラクトとそれに続くトランスジェニック株を作成することは非常に困難な場合があります。標準的な導入遺伝子は、導入遺伝子を駆動するための活性プロモーター要素と、一般的なベクター維持のために安定した細菌ベクター中のポリAシグナルまたは「テール」を必要とします。多成分トランスジェニック構築物の従来の生成は、複数の時間のかかるサブクローニングステップ10を必要とする。ギブソンアセンブリなどのPCRベースのアプローチは、サブクローニングに関連する問題のいくつかを回避できます。しかしながら、固有のプライマーは、すべての固有のトランスジェニック構築物の生成のために設計および試験されなければならない10。導入遺伝子の構築を超えて、ゲノム統合、生殖細胞系列伝達、および適切な導入遺伝子統合のスクリーニングも困難でした。ここでは、トランスポゾンベースのTol2トランスジェネシスシステム(Tol2Kit)を使用するためのプロトコルについて説明します10,11。このモジュラーシステムは、マルチサイトゲートウェイクローニングを使用して、「エントリ」および「宛先」ベクターの増え続けるライブラリから複数のトランスジェニックコンストラクトを迅速に生成します。統合されたTol2転移因子は、導入速度を大幅に増加させ、複数の導入遺伝子の迅速な構築とゲノム統合を可能にします。このシステムを使用して、内胚葉トランスジェニックゼブラフィッシュ系統の生成を使用して、FASDの根底にある組織特異的な構造欠陥を研究する方法を示します。最終的に、このプロトコルでは、モジュラーセットアップとトランスジェニックコンストラクトの構築がゼブラフィッシュベースのFASD研究に大いに役立つことを示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゼブラフィッシュは、エタノール曝露が発育および病態に与える影響を研究するのに理想的です7,8。ゼブラフィッシュは、半透明の、体外受精の、遺伝的に扱いやすい胚を大量に産生し、複数の環境状況で同時にいくつかの導入遺伝子標識組織および細胞タイプのライブイメージングを可能にします19,20?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この記事で紹介した研究は、国立衛生研究所/国立アルコール乱用研究所(NIH / NIAAA)R00AA023560からCBLへの助成金によってサポートされました。
Materials
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawsone Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
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