Le système Tol2 du poisson zèbre : une approche de transgénèse modulaire et flexible basée sur une passerelle
Summary
Ce travail décrit un protocole pour le système modulaire de transgénèse Tol2, une méthode de clonage basée sur une passerelle pour créer et injecter des constructions transgéniques dans des embryons de poisson zèbre.
Abstract
Les troubles causés par l’alcoolisation fœtale (ETCAF) sont caractérisés par un ensemble très variable de défauts structurels et de déficiences cognitives qui surviennent en raison de l’exposition prénatale à l’éthanol. En raison de la pathologie complexe de l’ETCAF, les modèles animaux se sont révélés essentiels à notre compréhension actuelle des défauts de développement induits par l’éthanol. Le poisson zèbre s’est avéré être un modèle puissant pour examiner les défauts de développement induits par l’éthanol en raison du degré élevé de conservation de la génétique et du développement entre le poisson zèbre et les humains. En tant que système modèle, le poisson zèbre possède de nombreux attributs qui le rendent idéal pour les études de développement, y compris un grand nombre d’embryons fécondés à l’extérieur qui sont génétiquement traitables et translucides. Cela permet aux chercheurs de contrôler avec précision le moment et le dosage de l’exposition à l’éthanol dans de multiples contextes génétiques. Un outil génétique important disponible chez le poisson zèbre est la transgénèse. Cependant, générer des constructions transgéniques et établir des lignées transgéniques peut être complexe et difficile. Pour résoudre ce problème, les chercheurs sur le poisson zèbre ont établi le système de transgénèse Tol2 basé sur des transposons. Ce système modulaire utilise une approche de clonage de passerelle multisite pour l’assemblage rapide de constructions transgéniques complètes basées sur des transposons Tol2. Ici, nous décrivons la boîte à outils flexible du système Tol2 et un protocole pour générer des constructions transgéniques prêtes pour la transgénèse du poisson zèbre et leur utilisation dans les études sur l’éthanol.
Introduction
L’exposition prénatale à l’éthanol donne lieu à un continuum de déficits structurels et de déficiences cognitives appelés troubles causés par l’alcoolisation fœtale (ETCAF)1,2,3,4. Les relations complexes entre de multiples facteurs rendent difficile l’étude et la compréhension de l’étiologie de l’ETCAF chez les humains. Pour résoudre ce problème, une grande variété de modèles animaux ont été utilisés. Les outils biologiques et expérimentaux disponibles dans ces modèles se sont avérés cruciaux pour développer notre compréhension de la base mécaniste de la tératogénicité de l’éthanol, et les résultats de ces systèmes modèles ont été remarquablement cohérents avec ce que l’on trouve dans les études sur l’éthanol humain 5,6. Parmi ceux-ci, le poisson zèbre est apparu comme un modèle puissant pour étudier la tératogenèse de l’éthanol 7,8, en partie en raison de leur fécondation externe, de leur fécondité élevée, de leur traçabilité génétique et de leurs embryons translucides. Ces forces se combinent pour rendre le poisson zèbre idéal pour les études d’imagerie en temps réel de l’ETCAF à l’aide de lignées de poissons-zèbres transgéniques.
Le poisson-zèbre transgénique a été largement utilisé pour étudier de multiples aspects du développement embryonnaire9. Cependant, la création de constructions transgéniques et de lignées transgéniques ultérieures peut être extrêmement difficile. Un transgène standard nécessite un élément promoteur actif pour piloter le transgène et un signal poly A ou « queue », le tout dans un vecteur bactérien stable pour le maintien général du vecteur. La génération traditionnelle d’une construction transgénique à plusieurs composants nécessite plusieurs étapes de sous-clonagechronophages 10. Les approches basées sur la PCR, telles que l’assemblage Gibson, peuvent contourner certains des problèmes associés au sous-clonage. Cependant, des amorces uniques doivent être conçues et testées pour la génération de chaque construction transgénique unique10. Au-delà de la construction transgénique, l’intégration génomique, la transmission germinale et le criblage d’une intégration correcte des transgènes ont également été difficiles. Ici, nous décrivons un protocole d’utilisation du système de transgénèse Tol2 basé sur des transposons (Tol2Kit)10,11. Ce système modulaire utilise le clonage de passerelle multisite pour générer rapidement plusieurs constructions transgéniques à partir d’une bibliothèque en constante expansion de vecteurs « d’entrée » et de « destination ». Les éléments transposables Tol2 intégrés augmentent considérablement le taux de transgénèse, permettant la construction rapide et l’intégration génomique de plusieurs transgènes. À l’aide de ce système, nous montrons comment la génération d’une lignée de poisson-zèbre transgénique endodermique peut être utilisée pour étudier les défauts structurels spécifiques aux tissus sous-jacents à l’ETCAF. En fin de compte, dans ce protocole, nous montrons que la configuration modulaire et la construction de constructions transgéniques aideront grandement la recherche sur l’ETCAF à base de poisson zèbre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le poisson zèbre est idéal pour étudier l’impact de l’exposition à l’éthanol sur le développement et les états pathologiques 7,8. Le poisson zèbre produit un grand nombre d’embryons translucides, fécondés à l’extérieur et génétiquement traitables, ce qui permet l’imagerie en direct de plusieurs tissus et types de cellules marqués par des transgènes simultanément dans de multiples contextes environnementaux19,20…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La recherche présentée dans cet article a été soutenue par une subvention des National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 à CBL.
Materials
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawsone Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
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