Zebrafish Tol2-systemet: En modulær og fleksibel gateway-basert transgenesetilnærming
Summary
Dette arbeidet beskriver en protokoll for det modulære Tol2 transgenesesystemet, en gateway-basert kloningsmetode for å lage og injisere transgene konstruksjoner i sebrafiskembryoer.
Abstract
Føtale alkoholspektrumforstyrrelser (FASD) er preget av et svært variabelt sett med strukturelle defekter og kognitive funksjonsnedsettelser som oppstår på grunn av prenatal etanoleksponering. På grunn av den komplekse patologien til FASD har dyremodeller vist seg å være kritiske for vår nåværende forståelse av etanolinduserte utviklingsdefekter. Sebrafisk har vist seg å være en kraftig modell for å undersøke etanolinduserte utviklingsdefekter på grunn av den høye graden av bevaring av både genetikk og utvikling mellom sebrafisk og mennesker. Som modellsystem har sebrafisk mange egenskaper som gjør dem ideelle for utviklingsstudier, inkludert et stort antall eksternt befruktede embryoer som er genetisk håndterbare og gjennomskinnelige. Dette gjør det mulig for forskere å nøyaktig kontrollere tidspunktet og doseringen av etanoleksponering i flere genetiske sammenhenger. Et viktig genetisk verktøy som er tilgjengelig i sebrafisk er transgenese. Imidlertid kan generering av transgene konstruksjoner og etablering av transgene linjer være komplisert og vanskelig. For å løse dette problemet har sebrafiskforskere etablert det transposonbaserte Tol2-transgenesesystemet. Dette modulære systemet bruker en multisite Gateway-kloningstilnærming for rask montering av komplette Tol2 transposonbaserte transgene konstruksjoner. Her beskriver vi den fleksible Tol2-systemverktøykassen og en protokoll for generering av transgene konstruksjoner klare for sebrafisktransgenese og deres bruk i etanolstudier.
Introduction
Prenatal etanoleksponering gir opphav til et kontinuum av strukturelle underskudd og kognitive funksjonsnedsettelser som kalles føtale alkoholspektrumforstyrrelser (FASD)1,2,3,4. De komplekse forholdene mellom flere faktorer gjør det utfordrende å studere og forstå etiologien til FASD hos mennesker. For å løse denne utfordringen har et bredt utvalg av dyremodeller blitt brukt. De biologiske og eksperimentelle verktøyene som er tilgjengelige i disse modellene har vist seg avgjørende for å utvikle vår forståelse av det mekanistiske grunnlaget for etanolteratogenisitet, og resultatene fra disse modellsystemene har vært bemerkelsesverdig konsistente med det som er funnet i humane etanolstudier 5,6. Blant disse har sebrafisk dukket opp som en kraftig modell for å studere etanol teratogenese7,8, delvis på grunn av deres eksterne befruktning, høy fruktbarhet, genetisk trekkbarhet og gjennomsiktige embryoer. Disse styrkene kombineres for å gjøre sebrafisk ideell for sanntids levende bildestudier av FASD ved bruk av transgene sebrafisklinjer.
Transgen sebrafisk har blitt mye brukt til å studere flere aspekter av embryonal utvikling9. Imidlertid kan det være svært vanskelig å skape transgene konstruksjoner og påfølgende transgene linjer. Et standard transgen krever et aktivt promotorelement for å drive transgenet og et poly A-signal eller “hale”, alt i en stabil bakteriell vektor for generelt vektorvedlikehold. Den tradisjonelle genereringen av en multikomponent transgen konstruksjon krever flere tidkrevende underkloning trinn10. PCR-baserte tilnærminger, som Gibson-montering, kan omgå noen av problemene knyttet til underkloning. Imidlertid må unike primere designes og testes for generering av hver unike transgene konstruksjon10. Utover transgenkonstruksjon har genomisk integrasjon, kimlinjeoverføring og screening for riktig transgenintegrasjon også vært vanskelig. Her beskriver vi en protokoll for bruk av det transposonbaserte Tol2-transgenesesystemet (Tol2Kit)10,11. Dette modulære systemet bruker multisite Gateway-kloning for raskt å generere flere transgene konstruksjoner fra et stadig voksende bibliotek med “oppføring” og “destinasjon” vektorer. Integrerte Tol2 transponerbare elementer øker transgenesehastigheten sterkt, noe som muliggjør rask konstruksjon og genomisk integrasjon av flere transgener. Ved hjelp av dette systemet viser vi hvordan genereringen av en endoderm transgen sebrafisklinje kan brukes til å studere de vevsspesifikke strukturelle defektene som ligger til grunn for FASD. Til syvende og sist, i denne protokollen, viser vi at det modulære oppsettet og konstruksjonen av transgene konstruksjoner i stor grad vil hjelpe sebrafiskbasert FASD-forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sebrafisk er ideelt egnet for å studere virkningen av etanoleksponering på utvikling og sykdomstilstander 7,8. Sebrafisk produserer et stort antall gjennomskinnelige, eksternt befruktede, genetisk traktable embryoer, noe som muliggjør levende avbildning av flere transgenmerkede vev og celletyper samtidig i flere miljøsammenhenger19,20. Disse styrkene, kombinert med den sterke utviklingsgenetiske bevar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen som presenteres i denne artikkelen ble støttet av et tilskudd fra National Institutes of Health / National Institute on Alcohol Abuse (NIH / NIAAA) R00AA023560 til CBL
Materials
| Addgene Tol2 toolbox | https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/ | ||
| Air | Provided directly by the university | ||
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| Analytical Balance | VWR | 10204-962 | |
| Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID Capillary | FHC | 30-30-0 | |
| Calcium Chloride | VWR | 97062-590 | |
| Chloramphenicol | BioVision | 2486 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP118-500 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Kanamycin | Fisher Scientific | BP906 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | |
| Lawsone Lab Donor Plasmid Prep | https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/ | ||
| LB Agar | Fisher Scientific | BP9724 | |
| LB Broth | Fisher Scientific | BP1426 | |
| Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade Agarose | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| LR Clonase II Plus Enzyme | Fisher Scientific | 12538200 | |
| Magnesium Sulfate (Heptahydrate) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Micro Pipette holder | Applied Scientific Instrumentation | MIMPH-M-PIP | |
| Microcentrifuge tube 0.5 mL | VWR | 10025-724 | |
| Microcentrifuge tube 1.5 mL | VWR | 10025-716 | |
| Micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | |
| Micropipette tips 10 μL | Fisher Scientific | 13611106 | |
| Micropipette tips 1000 μL | Fisher Scientific | 13611127 | |
| Micropipette tips 200 μL | Fisher Scientific | 13611112 | |
| mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription Kit | Fisher Scientific | AM1340 | |
| Mosimann Lab Tol2 Calculation Worksheet | https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1 | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | ND-1000 | |
| NcoI | NEB | R0189S | |
| NotI | NEB | R0189S | |
| Petri dishes 100 mm | Fisher Scientific | FB012924 | |
| Phenol Red sodium salt | Sigma Aldrich | P4758-5G | |
| Pipetman L p1000L Micropipette | Gilson | FA10006M | |
| Pipetman L p200L Micropipette | Gilson | FA10005M | |
| Pipetman L p2L Micropipette | Gilson | FA10001M | |
| Potassium Chloride | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium Phosphate (Dibasic) | VWR | BDH9266-500G | |
| Pressure Injector | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Sodium Bicarbonate | VWR | BDH9280-500G | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic) | Fisher Scientific | S374-500 | |
| Stericup .22 µm vacuum filtration system | Millipore | SCGPU11RE | |
| Tol2 Wiki Page | http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page | ||
| Top10 Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C404010 | |
| Vertical Pipetter Puller | David Kopf Instruments | 720 | |
| Zebrafish microinjection mold | Adaptive Science Tools | i34 |
References
- Denny, L., Coles, S., Blitz, R. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol spectrum disorders. American Family Physician. 96 (8), 515-522 (2017).
- Popova, S., et al. Comorbidity of fetal alcohol spectrum disorder: A systematic review and meta-analysis. The Lancet. 387 (10022), 978-987 (2016).
- Wilhoit, L. F., Scott, D. A., Simecka, B. A. Fetal alcohol spectrum disorders: Characteristics, complications, and treatment. Community Mental Health Journal. 53, 711-718 (2017).
- Wozniak, J. R., Riley, E. P., Charness, M. E. Clinical presentation, diagnosis, and management of fetal alcohol spectrum disorder. The Lancet Neurology. 18 (8), 760-770 (2019).
- Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. A Comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors. Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).
- Lovely, C. B. Animal models of gene-alcohol interactions. Birth Defects Research. 112 (4), 367-379 (2020).
- Fernandes, Y., Lovely, C. B. Zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorders. Genesis. 59 (11), 23460 (2021).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).
- Choe, C. P., et al. Transgenic fluorescent zebrafish lines that have revolutionized biomedical research. Lab Animal Research. 37 (1), 26 (2021).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: A multisite gateway-based construction kit forTol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Don, E. K., et al. A Tol2 gateway-compatible toolbox for the study of the nervous system and neurodegenerative disease. Zebrafish. 14 (1), 69-72 (2017).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Protocols. UMass Chan Medical School Available from: https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols (2017)
- Mosimann, C. Multisite gateway calculations: Excel spreadsheet. protocols.io. , (2022).
- Chung, W. -. S., Stainier, D. Y. R. Intra-endodermal interactions are required for pancreatic β cell induction. Developmental Cell. 14 (4), 582-593 (2008).
- Grevellec, A., Tucker, A. S. The pharyngeal pouches and clefts: Development, evolution, structure and derivatives. Seminars in Cell & Developmental Biology. 21 (3), 325-332 (2010).
- Lovely, C. B., Swartz, M. E., McCarthy, N., Norrie, J. L., Eberhart, J. K. Bmp signaling mediates endoderm pouch morphogenesis by regulating Fgf signaling in zebrafish. Development. 143 (11), 2000-2011 (2016).
- Silva Brito, R., Canedo, A., Farias, D., Rocha, T. L. Transgenic zebrafish (Danio rerio) as an emerging model system in ecotoxicology and toxicology: Historical review, recent advances, and trends. Science of The Total Environment. 848, 157665 (2022).
- Lai, K. P., Gong, Z., Tse, W. K. F. Zebrafish as the toxicant screening model: Transgenic and omics approaches. Aquatic Toxicology. 234, 105813 (2021).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Stable lines of transgenic zebrafish exhibit reproducible patterns of transgene expression. Development. 109 (3), 577-584 (1988).
- Stuart, G. W., McMurray, J. V., Westerfield, M. Replication, integration and stable germ-line transmission of foreign sequences injected into early zebrafish embryos. Development. 103 (2), 403-412 (1990).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mechanisms of Development. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Kawakami, K., Asakawa, K., Muto, A., Wada, H. Tol2-mediated transgenesis, gene trapping, enhancer trapping, and Gal4-UAS system. Methods in Cell Biology. 135, 19-37 (2016).
