قياس إجهاد النسخ المتماثل في خلايا سرطان المبيض باستخدام التألق المناعي للحمض النووي أحادي الشريط
Summary
نصف هنا طريقة قائمة على التألق المناعي لتحديد مستويات الحمض النووي أحادي الشريط في الخلايا. يمكن استخدام هذه الطريقة الفعالة والقابلة للتكرار لفحص إجهاد النسخ المتماثل ، وهي سمة شائعة في العديد من سرطانات المبيض. بالإضافة إلى ذلك ، يتوافق هذا الفحص مع خط أنابيب التحليل الآلي ، مما يزيد من كفاءته.
Abstract
إجهاد النسخ المتماثل هو السمة المميزة للعديد من سرطانات المبيض. يمكن أن ينشأ إجهاد النسخ المتماثل من مصادر متعددة ، بما في ذلك فواصل الشريط المزدوج ، أو تعارضات النسخ والتكرار ، أو تضخم الجينات المسرطنة ، مما يؤدي حتما إلى توليد الحمض النووي أحادي الشريط (ssDNA). وبالتالي ، فإن القياس الكمي ل ssDNA يمثل فرصة لتقييم مستوى إجهاد النسخ المتماثل في أنواع الخلايا المختلفة وتحت ظروف أو علاجات مختلفة مدمرة للحمض النووي. تشير الأدلة الناشئة أيضا إلى أن ssDNA يمكن أن يكون مؤشرا على الاستجابات لأدوية العلاج الكيميائي التي تستهدف إصلاح الحمض النووي. هنا ، نصف منهجية مفصلة قائمة على التألق المناعي لتحديد ssDNA. تتضمن هذه المنهجية تسمية الجينوم بنظير ثيميدين ، يليه الكشف القائم على الأجسام المضادة للتناظرية في الكروماتين في ظل ظروف عدم تغيير طبيعة الجينوم. يمكن تصور امتدادات ssDNA كبؤر تحت مجهر مضان. يرتبط عدد وشدة البؤر ارتباطا مباشرا بمستوى ssDNA الموجود في النواة. نصف أيضا خط أنابيب آلي لتحديد إشارة ssDNA. الطريقة سريعة وقابلة للتكرار. علاوة على ذلك ، فإن بساطة هذه المنهجية تجعلها قابلة للتطبيقات عالية الإنتاجية مثل الأدوية والشاشات الجينية.
Introduction
كثيرا ما يتعرض الحمض النووي الجينومي لاعتداءات متعددة من مصادر داخلية وخارجيةمختلفة 1. يرتبط تواتر الضرر الداخلي ارتباطا مباشرا بمستويات المنتجات الثانوية الأيضية ، مثل أنواع الأكسجين التفاعلية أو الألدهيدات ، والتي تكون أعلى جوهريا في أنواع متعددة من السرطان ، بما في ذلك سرطانات المبيض 2,3. من الضروري حل تلف الحمض النووي بكفاءة. خلاف ذلك ، يمكن أن تعزز الآفات السمية الجينية ، وبالتالي ، الطفرات. تعتمد قدرة الخلايا على إصلاح الآفات السامة للجينات على وظائف مسارات إصلاح الحمض النووي الخالية من الأخطاء والتنظيم الفعال لتطور دورة الخلية استجابة لتلف الحمض النووي. والجدير بالذكر أن العديد من سرطانات المبيض تحمل طفرات معطلة وظيفيا في p53 ، وبالتالي ، لديها نقطة تفتيش G1 / S معيبة ، مما يؤدي بالخلايا إلى بدء تكرار الحمض النووي على الرغم من وجود آفات جينومية لم يتم إصلاحها 4,5. تتفاقم درجة تلف الحمض النووي في سرطانات المبيض من خلال ملاحظة أن أكثر من 50٪ من سرطان المبيض المصلي عالي الدرجة (HGSOC) لديها عيوب في إعادة التركيب المتماثل بوساطة BRCA1 و BRCA2 ، ومسار إصلاح الحمض النووي الخالي من الأخطاء ، وحوالي 20٪ لديهم تضخيم في الجين CCNE1 ، الذي يدفع خلايا G1 قبل الأوان إلى المرحلةS 6 . إن التكرار العالي لتلف الحمض النووي الداخلي ، ونقاط التفتيش المعيبة ، ومسارات الإصلاح المعطلة تعزز بشكل كبير تراكم الآفات الجينومية في سرطانات المبيض. يمكن أن تكون هذه الآفات بمثابة عوائق أمام تقدم العمليات الخلوية الحرجة مثل تكرار الحمض النووي والنسخ. كما نوقش أدناه ، تحفز هذه العوائق توليد الحمض النووي أحادي الشريط (ssDNA) في الخلايا.
يعد اللولب المزدوج للحمض النووي أمرا بالغ الأهمية لحماية الجينوم من عمليات الطفرات المتعددة ، مثل التطهير التلقائي وإزالة الحرارة ، ونشاط deaminases السيتوزين ، وتلف الحمض النووي التأكسدي 1,7. في المقابل ، فإن ssDNA معرض بشدة لهذه الأحداث الطفرة. يمكن أن تؤدي العمليات المتعددة في الخلايا إلى توليد ssDNA (الشكل 1). وتشمل هذه ما يلي:
(ط) توقف آلية تكرار الحمض النووي: يؤدي هذا إلى فصل لولب الحمض النووي والبلمرة ، تاركا امتدادات من ssDNA 8,9.
(ii) توقف آلية النسخ: يؤدي التوقف المستمر لبوليميراز الحمض النووي الريبي إلى توليد هياكل هجينة ثلاثية الخيوط من الحمض النووي / الحمض النووي الريبي تسمى حلقات R. يكشف تكوين الحلقة R الحمض النووي النازح وغير المنسوخ كشريط واحد10.
(iii) استئصال نهاية الحمض النووي: يتطلب بدء الإصلاح الموجه بالتماثل توليد ssDNA 3 ‘لتحفيز البحث عن تسلسل متماثل11.
(iv) حلقة D: يمكن أن يؤدي غزو الشريط أثناء إعادة التركيب المتماثل إلى إزاحة الشريط المكمل غير القالب ، مما يؤدي إلى ssDNA12.
(v) الفجوات المقترنة بالتكرار: أثناء تكرار الحمض النووي ، يحدث تخليق الشريط المتأخر بطريقة متقطعة ، حيث يتم إنشاء شظايا أوكازاكي أولا ثم ربطها. يمكن أن يؤدي التأخير أو العيب في معالجة شظايا أوكازاكي أيضا إلى تكوين ssDNA. أخيرا ، إذا واجهت شوكة النسخ المتماثل على حبلا رائدا آفة توقف ، بوليميراز الحمض النووي ، والبريماز ، يمكن ل PRIMPOL إعادة تنظيم التوليف في اتجاه مجرى النهر ، تاركا فجوة ssDNA خلف13,14.
من الواضح أن معظم هذه الأحداث تحدث إما عندما تواجه آلية تكرار الحمض النووي آفات جينومية أو أثناء الإصلاح المقترن بالتكرار ، مما يشير إلى أن تلف الحمض النووي العالي يؤدي إلى زيادة مستويات ssDNA. نظرا لأن العديد من هذه الأحداث مرتبطة بالنسخ المتماثل ، فإن تكوين ssDNA يعتبر علامة “إجهاد النسخ المتماثل” في الخلايا15,16.
هنا ، نصف مقايسة يمكن استخدامها لتحديد كمية ssDNA في الخلايا بشكل موثوق. إن بساطة هذا النهج وقابليته للتكرار وفوائد التكلفة تجعله قابلا للاستخدام لتقييم استجابة إجهاد النسخ المتماثل في الخلايا. كشفت الدراسات الناشئة أن مستوى ssDNA يمكن أن يكون أيضا مؤشرا على الاستجابات للعلاج الكيميائي ، مثل مثبطات إنزيمات PARP1 / 2 ، ATR ، و Wee1 kinase17،18،19،20،21. يتم متابعة هذه المثبطات في نظام العلاج للعديد من HGSOCs22. لذلك ، يمكن أن يكون هذا الفحص أيضا أداة مفيدة للتنبؤ بالاستجابات العلاجية الكيميائية في خلايا سرطان المبيض.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما ذكر في البروتوكول ، من المفيد تضمين بعض الضوابط التجريبية لضمان عمل الفحص. وتشمل هذه العينة التي لا تعالج ب IdU بالإضافة إلى عينة معالجة بالأجسام المضادة الأولية. يجب أن ينتج عن كلا العنصرين السلبيين خلايا ملطخة بواسطة DAPI ولكنها لا تحتوي على إشارة IdU.
بناء على الظروف التجر…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم دعم PV من خلال منحة Pedal the Cause الافتتاحية من قبل مركز Alvin J. Siteman للسرطان من خلال مؤسسة مستشفى بارنز اليهودي ، ومنحة الأبحاث التجريبية من مركز مارشا ريفكين لأبحاث سرطان المبيض ، ومنحة أبحاث السرطان من مؤسسة ماري كاي آش ومؤسسة V. يتم دعم NR من خلال منحة تدريب المعاهد الوطنية للصحة على الخلايا والبيولوجيا الجزيئية T32 لجامعة واشنطن ، سانت لويس.
Materials
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C |
| Anti-BrdU antibody | BD Biosciences | 347580 | Storage: Store in 4 °C |
| Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody | Thermo Scientific | A32766 | Light sensitive – keep in dark Storage: Store in 4 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C |
| Circular Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| NIS GA3 Software | Nikon | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma Aldrich | P4832-50ML | Storage: Store in 4 °C |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Thermo Scientific | P36962 | Storage: Store in 4 °C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | Storage: Store in 4 °C |
| Water, sterile-filtered | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | Storage: Store in 4 °C |
Riferimenti
- Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
- Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D’Andrea, A. D. Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer. Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).
- Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity. Journal of Ovarian Research. 11, 50 (2018).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nature communications. 8, 1093 (2017).
- Kroeger, P. T., Drapkin, R. Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).
- Patch, A. -. M., et al. Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer. Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).
- Alexandrov, L. B., et al. The repertoire of mutational signatures in human cancer. Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).
- Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -. C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint. Genes & Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).
- Toledo, L. I., et al. ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA. Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).
- Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability. Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).
- Cejka, P., Symington, L. S. DNA end resection: Mechanism and control. Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).
- Kowalczykowski, S. C. An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410 (2015).
- Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. PRIMPOL ready, set, reprime. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).
- Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: An essential regulator of genome integrity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).
- Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Xu, H., et al. CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models. Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394 (2021).
- Konstantinopoulos, P. A., et al. A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer. Nature Communications. 12, 5574 (2021).
- Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase. Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).
- Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).
- da Costa, A. A. B. A., et al. Targeting replication stress in cancer therapy. Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).
- Chen, R., Wold, M. S. Replication protein A: Single-stranded DNA’s first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair. BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).
- Bhat, K. P., Cortez, D. RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).
- Maréchal, A., Zou, L. RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response. Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).
