단일 가닥 DNA 면역형광을 사용한 난소암 세포의 복제 스트레스 정량화
Summary
여기에서는 세포에서 단일 가닥 DNA의 수준을 정량화하는 면역형광 기반 방법을 설명합니다. 이 효율적이고 재현 가능한 방법은 여러 난소암에서 흔히 볼 수 있는 특징인 복제 스트레스를 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 이 분석은 자동화된 분석 파이프라인과 호환되어 효율성을 더욱 높입니다.
Abstract
복제 스트레스는 여러 난소암의 특징입니다. 복제 스트레스는 이중 가닥 절단, 전사-복제 충돌 또는 증폭된 종양 유전자를 포함한 여러 소스에서 나타날 수 있으며, 필연적으로 단일 가닥 DNA(ssDNA)의 생성을 초래합니다. 따라서 ssDNA를 정량화하면 다양한 세포 유형과 다양한 DNA 손상 조건 또는 치료에서 복제 스트레스 수준을 평가할 수 있습니다. 새로운 증거는 또한 ssDNA가 DNA 복구를 표적으로 하는 화학요법 약물에 대한 반응의 예측 인자일 수 있음을 시사합니다. 여기에서는 ssDNA를 정량화하기 위한 상세한 면역형광 기반 방법론을 설명합니다. 이 방법론은 티미딘 유사체로 게놈을 표지한 다음 비변성 조건에서 염색질에서 유사체의 항체 기반 검출을 포함합니다. ssDNA의 스트레치는 형광 현미경으로 초점으로 시각화할 수 있습니다. 병소의 수와 강도는 핵에 존재하는 ssDNA의 수준과 직접 관련이 있습니다. 또한 ssDNA 신호를 정량화하기 위한 자동화된 파이프라인에 대해서도 설명합니다. 이 방법은 빠르고 재현 가능합니다. 또한 이 방법론의 단순성으로 인해 약물 및 유전자 스크리닝과 같은 고처리량 응용 분야에 적합합니다.
Introduction
게놈 DNA는 다양한 내인성 및 외인성 출처의 여러 공격에 자주 노출된다1. 내인성 손상의 빈도는 난소암을 포함한 여러 암 유형에서 본질적으로 더 높은 활성산소종 또는 알데히드와 같은 대사 부산물의 수준과 직접적인 상관관계가 있다 2,3. DNA 손상을 효율적으로 해결하는 것이 필수적입니다. 그렇지 않으면 유전 독성 병변을 조장하여 결과적으로 돌연변이 유발을 일으킬 수 있습니다. 유전독성 병변을 복구하는 세포의 능력은 오류 없는 DNA 복구 경로의 기능과 DNA 손상에 대한 반응으로 세포 주기 진행의 효율적인 조절에 달려 있습니다. 특히, 많은 난소암은 p53에 기능적으로 비활성화 돌연변이를 가지고 있으며, 따라서 결함이 있는 G1/S 체크포인트를 가지고 있어 복구되지 않은 게놈 병변이 있음에도 불구하고 세포가 DNA 복제를 시작하도록 유도합니다 4,5. 난소암의 DNA 손상 정도는 고급 장액성 난소암(HGSOC)의 50% 이상이 BRCA1 및 BRCA2 매개 상동 재조합, 오류 없는 DNA 복구 경로에 결함이 있고 약 20%가 유전자 CCNE1에서 증폭되어 G1 세포를 S상6으로 조기에 밀어 넣는다는 관찰에 의해 더욱 복잡해집니다 . 높은 빈도의 내인성 DNA 손상, 결함 있는 체크포인트 및 오작동하는 복구 경로가 함께 난소암에서 게놈 병변의 축적을 기하급수적으로 향상시킵니다. 이러한 병변은 DNA 복제 및 전사와 같은 중요한 세포 과정의 진행에 장애가 될 수 있습니다. 아래에서 논의되는 바와 같이, 이러한 장애는 세포에서 단일 가닥 DNA(ssDNA)의 생성을 촉매합니다.
DNA의 이중 나선은 자발적인 정화 및 탈피리미딘, 시토신 데아미나제의 활성, 산화적 DNA 손상과 같은 여러 돌연변이 유발 과정으로부터 게놈을 보호하는 데 중요합니다 1,7. 대조적으로, ssDNA는 이러한 돌연변이 사건에 매우 취약합니다. 세포의 여러 과정으로 인해 ssDNA가 생성될 수 있습니다(그림 1). 여기에는 다음이 포함됩니다.
(i) DNA 복제 기계의 정지: 이것은 DNA 헬리카제와 중합효소의 분리로 이어져 ssDNA 8,9의 스트레칭을 남깁니다.
(ii) 전사 기계의 실속: RNA 중합효소의 지속적인 실속은 R-루프라고 하는 3가닥 하이브리드 DNA/RNA 구조의 생성으로 이어집니다. R-루프 형성은 변위되고 전사되지 않은 DNA를 단일 가닥10으로 노출시킵니다.
(iii) DNA 말단 절제술: 상동성 지향 복구의 개시는 상동 서열11에 대한 탐색을 촉매하기 위해 3′ ssDNA의 생성을 필요로 한다.
(iv) D-루프: 상동성 재조합 동안 가닥 침범은 비주형 상보적 가닥의 변위를 초래하여 ssDNA12를 초래할 수 있습니다.
(v) 복제 결합 갭: DNA 복제 중에 지연 가닥 합성이 불연속적인 방식으로 발생하여 오카자키 조각이 먼저 생성된 다음 결찰됩니다. 오카자키 단편 처리의 지연 또는 결함도 ssDNA 형성을 초래할 수 있습니다. 마지막으로, 선행 가닥의 복제 포크가 실속 병변, DNA 중합효소 및 프리마제를 만나면 PRIMPOL은 합성 다운스트림을 리프라이밍하여13,14 뒤에 ssDNA 갭을 남길 수 있습니다.
분명히, 이러한 사건의 대부분은 DNA 복제 기계가 게놈 병변에 직면하거나 복제 결합 복구 중에 발생하며, 이는 DNA 손상이 높을수록 ssDNA 수치가 증가함을 시사합니다. 이러한 사건의 많은 부분이 복제와 관련되어 있기 때문에 ssDNA의 형성은 세포15,16에서 “복제 스트레스”의 마커로 간주됩니다.
여기에서는 세포에서 ssDNA를 안정적으로 정량화하는 데 사용할 수 있는 분석법을 설명합니다. 이 접근법의 단순성, 재현성 및 비용 이점으로 인해 세포의 복제 스트레스 반응을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 신흥 연구는 ssDNA의 수준이 또한 PARP1/2 효소의 억제제, ATR, 및 Wee1 키나제 17,18,19,20,21과 같은 화학요법에 대한 반응의 예측인자일 수 있다는 것을 밝혀냈다. 이들 억제제는 여러 HGSOCs2의 치료 요법에서 추구되고 있다. 따라서, 이 분석은 또한 난소암 세포에서 화학요법 반응을 예측하는 유용한 도구가 될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜에서 언급했듯이 분석이 작동하는지 확인하기 위해 몇 가지 실험 컨트롤을 포함하는 것이 중요합니다. 여기에는 IdU 처리되지 않은 샘플과 1차 항체 처리되지 않은 샘플이 포함됩니다. 두 음성 대조군 모두 DAPI에 의해 염색되었지만 IdU 신호를 포함하지 않는 세포를 생성해야 합니다.
사용된 실험 조건 및 세포주에 따라 최상의 형광 신호를 얻기 위해 다양한 항체 희석?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PV는 The Foundation for Barnes-Jewish Hospital을 통한 Alvin J. Siteman Cancer Center의 Inaugural Pedal the Cause Grant, Marsha Rivkin Center for Ovarian Cancer Research의 파일럿 연구 보조금, Mary Kay Ash Foundation 및 V-Foundation의 암 연구 보조금의 지원을 받습니다. NR은 세인트루이스 워싱턴 대학교에 대한 NIH 세포 및 분자 생물학 교육 T32 보조금의 지원을 받습니다.
Materials
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C |
| Anti-BrdU antibody | BD Biosciences | 347580 | Storage: Store in 4 °C |
| Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody | Thermo Scientific | A32766 | Light sensitive – keep in dark Storage: Store in 4 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C |
| Circular Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| NIS GA3 Software | Nikon | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma Aldrich | P4832-50ML | Storage: Store in 4 °C |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Thermo Scientific | P36962 | Storage: Store in 4 °C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | Storage: Store in 4 °C |
| Water, sterile-filtered | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | Storage: Store in 4 °C |
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