Quantificazione dello stress di replicazione nelle cellule tumorali ovariche mediante immunofluorescenza del DNA a singolo filamento

Summary

Qui, descriviamo un metodo basato sull’immunofluorescenza per quantificare i livelli di DNA a singolo filamento nelle cellule. Questo metodo efficiente e riproducibile può essere utilizzato per esaminare lo stress di replicazione, una caratteristica comune in diversi tumori ovarici. Inoltre, questo test è compatibile con una pipeline di analisi automatizzata, che ne aumenta ulteriormente l’efficienza.

Abstract

Lo stress di replicazione è un segno distintivo di diversi tumori ovarici. Lo stress di replicazione può emergere da più fonti, tra cui rotture a doppio filamento, conflitti di trascrizione-replicazione o oncogeni amplificati, con conseguente inevitabilmente generazione di DNA a singolo filamento (ssDNA). Quantificare l’ssDNA, quindi, offre l’opportunità di valutare il livello di stress di replicazione in diversi tipi di cellule e in varie condizioni o trattamenti dannosi per il DNA. Prove emergenti suggeriscono anche che l’ssDNA può essere un predittore di risposte ai farmaci chemioterapici che mirano alla riparazione del DNA. Qui, descriviamo una metodologia dettagliata basata sull’immunofluorescenza per quantificare il ssDNA. Questa metodologia prevede la marcatura del genoma con un analogo della timidina, seguita dalla rilevazione basata su anticorpi dell’analogo alla cromatina in condizioni non denaturanti. Tratti di ssDNA possono essere visualizzati come fuochi al microscopio a fluorescenza. Il numero e l’intensità dei fuochi sono direttamente correlati con il livello di ssDNA presente nel nucleo. Descriviamo anche una pipeline automatizzata per quantificare il segnale ssDNA. Il metodo è rapido e riproducibile. Inoltre, la semplicità di questa metodologia la rende suscettibile di applicazioni ad alto rendimento come farmaci e screening genetici.

Introduction

Il DNA genomico è spesso esposto ad attacchi multipli da varie fonti endogene ed esogene¹. La frequenza del danno endogeno è direttamente correlata ai livelli di sottoprodotti metabolici, come le specie reattive dell’ossigeno o le aldeidi, che sono intrinsecamente più elevati in più tipi di cancro, compresi i tumori ovarici ^2,3. È imperativo che il danno al DNA sia risolto in modo efficiente; in caso contrario, può favorire lesioni genotossiche e, di conseguenza, mutagenesi. La capacità delle cellule di riparare le lesioni genotossiche dipende dalla funzionalità di percorsi di riparazione del DNA privi di errori e dall’efficiente regolazione della progressione del ciclo cellulare in risposta al danno al DNA. In particolare, molti tumori ovarici portano mutazioni funzionalmente inattivanti in p53 e, quindi, hanno un checkpoint G1/S difettoso, portando le cellule ad avviare la replicazione del DNA nonostante la presenza di lesioni genomiche non riparate ^4,5. Il grado di danno al DNA nei tumori ovarici è ulteriormente aggravato dall’osservazione che oltre il 50% del carcinoma ovarico sieroso di alto grado (HGSOC) ha difetti nella ricombinazione omologa mediata da BRCA1 e BRCA2, la via di riparazione del DNA priva di errori, e circa il 20% ha amplificazione nel gene CCNE1, che spinge prematuramente le cellule G1 nella fase S⁶. . Insieme, l’alta frequenza di danni endogeni al DNA, i checkpoint difettosi e i percorsi di riparazione malfunzionanti aumentano esponenzialmente l’accumulo di lesioni genomiche nei tumori ovarici. Queste lesioni possono servire come impedimenti alla progressione di processi cellulari critici come la replicazione e la trascrizione del DNA. Come discusso di seguito, tali impedimenti catalizzano la generazione di DNA a singolo filamento (ssDNA) nelle cellule.

La doppia elica del DNA è fondamentale per salvaguardare il genoma da molteplici processi mutageni, come la depurazione spontanea e la depirimidinazione, l’attività delle citosine deaminasi e il danno ossidativo al DNA ^1,7. Al contrario, l’ssDNA è altamente vulnerabile a questi eventi mutazionali. Processi multipli nelle cellule possono portare alla generazione di ssDNA (Figura 1). Questi includono quanto segue:

(i) Stallo del meccanismo di replicazione del DNA: questo porta ad un disaccoppiamento dell’elicasi del DNA e della polimerasi, lasciando tratti di ssDNA ^8,9.

(ii) Stallo del macchinario di trascrizione: lo stallo persistente della RNA polimerasi porta alla generazione di strutture ibride DNA/RNA a tre filamenti chiamate R-loop. La formazione di R-loop espone il DNA spostato e non trascritto come un singolo filamento¹⁰.

(iii) Resezione finale del DNA: l’inizio della riparazione diretta dall’omologia richiede la generazione di un ssDNA 3′ per catalizzare la ricerca di una sequenza omologa¹¹.

(iv) D-loop: l’invasione del filamento durante la ricombinazione omologa può provocare lo spostamento del filamento complementare non-template, con conseguente ssDNA¹².

(v) Lacune accoppiate alla replicazione: durante la replicazione del DNA, la sintesi del filamento ritardato avviene in modo discontinuo, per cui i frammenti di Okazaki vengono prima generati e poi legati. Un ritardo o un difetto nell’elaborazione dei frammenti di Okazaki può anche provocare la formazione di ssDNA. Infine, se la forcella di replicazione su un filamento principale incontra una lesione in stallo, DNA polimerasi e primasi, PRIMPOL può riattivare la sintesi a valle, lasciando un gap di ssDNA dietro^13,14.

Evidentemente, la maggior parte di questi eventi si verificano quando il meccanismo di replicazione del DNA affronta lesioni genomiche o durante la riparazione accoppiata alla replicazione, suggerendo che un danno al DNA più elevato porta ad un aumento dei livelli di ssDNA. Poiché molti di questi eventi sono associati alla replicazione, la formazione di ssDNA è considerata il marker dello “stress di replicazione” nelle cellule^15,16.

Qui, descriviamo un test che può essere utilizzato per quantificare in modo affidabile l’ssDNA nelle cellule. La semplicità, la riproducibilità e i benefici in termini di costi di questo approccio lo rendono utilizzabile per valutare la risposta replicazione-stress nelle cellule. Studi emergenti hanno rivelato che il livello di ssDNA può anche essere un predittore di risposte alla chemioterapia, come gli inibitori degli enzimi PARP1/2, ATR e Wee1 chinasi 17,18,19,20,21. Questi inibitori sono perseguiti nel regime di trattamento di diversi HGSOCs²². Pertanto, questo test può anche essere uno strumento utile per prevedere le risposte chemioterapiche nelle cellule tumorali ovariche.

Protocol

NOTA: La linea cellulare di cancro ovarico, OVCAR3, è stata utilizzata in queste fasi, ma questo protocollo è ampiamente applicabile a più altre linee cellulari, comprese quelle derivate da fonti non ovariche. Uno schema del protocollo è mostrato nella Figura 2. 1. Placcatura delle celle Realizzare copertine rivestite di poli-L-lisina.Aggiungere i coperchi autoclavati di 12 mm di diametro a un tubo conico da 50 mL con soluzio…

Representative Results

Le immagini rappresentative e la quantificazione dei focolai di IdU dai nuclei derivati dalle cellule non trattate e dalle cellule trattate con idrossiurea 0,5 mM per 24 ore sono mostrate nella Figura 4. Entrambi i nuclei sono colorati e identificabili nel canale DAPI. L’analisi di queste immagini consiste nel quantificare il numero di focolai in ciascun nucleo. Il numero di fuochi è proporzionale al grado di stress di replicazione. <p class="jove_content biglegend" fo:keep-together.wit…

Discussion

Come menzionato nel protocollo, è importante includere alcuni controlli sperimentali per garantire che il test funzioni. Questi includono un campione senza trattamento con IDU e un campione non trattato con anticorpi primari. Entrambi i controlli negativi dovrebbero produrre celle colorate da DAPI ma non contengono alcun segnale IdU.

In base alle condizioni sperimentali e alle linee cellulari utilizzate, possono essere necessarie diverse diluizioni anticorpali per ottenere il miglior segnale …

Materials

3% Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	NC0179595	10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C
5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C
Anti-BrdU antibody	BD Biosciences	347580	Storage: Store in 4 °C
Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody	Thermo Scientific	A32766	Light sensitive – keep in dark Storage: Store in 4 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C
Circular Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72230-01
NIS GA3 Software	Nikon	77010604
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C
Poly-L-Lysine solution	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Storage: Store in 4 °C
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	Thermo Scientific	P36962	Storage: Store in 4 °C
Trypsin-EDTA, 0.25%	Genesee Scientific	25-510	Storage: Store in 4 °C
Water, sterile-filtered	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Storage: Store in 4 °C