Quantifier le stress de réplication dans les cellules cancéreuses de l’ovaire à l’aide de l’immunofluorescence d’ADN simple brin

Summary

Ici, nous décrivons une méthode basée sur l’immunofluorescence pour quantifier les niveaux d’ADN simple brin dans les cellules. Cette méthode efficace et reproductible peut être utilisée pour examiner le stress de réplication, une caractéristique commune à plusieurs cancers de l’ovaire. De plus, ce test est compatible avec un pipeline d’analyse automatisé, ce qui augmente encore son efficacité.

Abstract

Le stress de réplication est une caractéristique de plusieurs cancers de l’ovaire. Le stress de réplication peut émerger de sources multiples, y compris des ruptures double brin, des conflits de transcription-réplication ou des oncogènes amplifiés, entraînant inévitablement la génération d’ADN simple brin (ssDNA). La quantification de l’ADNss offre donc l’occasion d’évaluer le niveau de stress de réplication dans différents types de cellules et dans diverses conditions ou traitements endommageant l’ADN. De nouvelles preuves suggèrent également que l’ADNss peut être un prédicteur des réponses aux médicaments chimiothérapeutiques qui ciblent la réparation de l’ADN. Ici, nous décrivons une méthodologie détaillée basée sur l’immunofluorescence pour quantifier l’ADNss. Cette méthodologie implique le marquage du génome avec un analogue de la thymidine, suivi de la détection par anticorps de l’analogue à la chromatine dans des conditions non dénaturantes. Des segments d’ADNss peuvent être visualisés comme des foyers sous un microscope à fluorescence. Le nombre et l’intensité des foyers sont directement liés au niveau d’ADNss présent dans le noyau. Nous décrivons également un pipeline automatisé pour quantifier le signal ssDNA. La méthode est rapide et reproductible. De plus, la simplicité de cette méthodologie la rend propice à des applications à haut débit telles que les criblages de médicaments et de génétiques.

Introduction

L’ADN génomique est fréquemment exposé à de multiples agressions provenant de diverses sources endogènes et exogènes¹. La fréquence des dommages endogènes est directement corrélée aux niveaux de sous-produits métaboliques, tels que les espèces réactives de l’oxygène ou les aldéhydes, qui sont intrinsèquement plus élevés dans plusieurs types de cancer, y compris les cancers de l’ovaire ^2,3. Il est impératif que les dommages à l’ADN soient résolus efficacement; Sinon, il peut favoriser les lésions génotoxiques et, par conséquent, la mutagénèse. La capacité des cellules à réparer les lésions génotoxiques dépend de la fonctionnalité des voies de réparation de l’ADN sans erreur et de la régulation efficace de la progression du cycle cellulaire en réponse aux dommages à l’ADN. Notamment, de nombreux cancers de l’ovaire portent des mutations fonctionnellement inactivantes dans p53 et, par conséquent, ont un point de contrôle G1/S défectueux, conduisant les cellules à initier la réplication de l’ADN malgré la présence de lésions génomiques non réparées ^4,5. Le degré de dommages à l’ADN dans les cancers de l’ovaire est encore aggravé par l’observation que plus de 50% des carcinomes séreux de l’ovaire de haut grade (HGSOC) ont des défauts dans la recombinaison homologue médiée par BRCA1 et BRCA2, la voie de réparation de l’ADN sans erreur, et environ 20% ont une amplification dans le gène CCNE1, qui pousse prématurément les cellules G1 dans la phase S⁶ . Ensemble, la fréquence élevée des dommages endogènes à l’ADN, les points de contrôle défectueux et les voies de réparation défectueuses augmentent exponentiellement l’accumulation de lésions génomiques dans les cancers de l’ovaire. Ces lésions peuvent constituer des obstacles à la progression de processus cellulaires critiques tels que la réplication et la transcription de l’ADN. Comme nous le verrons ci-dessous, de tels obstacles catalysent la génération d’ADN simple brin (ADNss) dans les cellules.

La double hélice de l’ADN est essentielle pour protéger le génome de multiples processus mutagènes, tels que la dépurination spontanée et la dépyrimidination, l’activité des cytosine désaminases et les dommages oxydatifs^à l’ADN ^1,7. En revanche, l’ADNss est très vulnérable à ces événements mutationnels. De multiples processus dans les cellules peuvent entraîner la génération d’ADNss (Figure 1). Il s’agit notamment des éléments suivants :

(i) Blocage de la machinerie de réplication de l’ADN: Cela conduit à un découplage de l’hélicase de l’ADN et de la polymérase, laissant des tronçons d’ADNss ^8,9.

(ii) Blocage de la machinerie de transcription : Le décrochage persistant de l’ARN polymérase conduit à la génération de structures hybrides ARN/ARN à trois brins appelées boucles R. La formation de la boucle R expose l’ADN déplacé et non transcrit comme un seul brin¹⁰.

(iii) Résection finale de l’ADN: L’initiation de la réparation dirigée par homologie nécessite la génération d’un ADNss 3′ pour catalyser la recherche d’une séquence homologue¹¹.

(iv) Boucle D: L’invasion de brins au cours de la recombinaison homologue peut entraîner le déplacement du brin complémentaire non modèle, ce qui entraîne^{l’ADNss 12}.

(v) Lacunes couplées à la réplication : Au cours de la réplication de l’ADN, la synthèse retardée des brins se produit de manière discontinue, les fragments d’Okazaki étant d’abord générés puis ligaturés. Un retard ou un défaut dans le traitement des fragments d’Okazaki peut également entraîner la formation d’ADNss. Enfin, si la fourche de réplication sur un brin principal rencontre une lésion de décrochage, l’ADN polymérase et la primase, PRIMPOL peut amorcer la synthèse en aval, laissant un espace d’ADNss derrière^13,14.

De toute évidence, la plupart de ces événements se produisent lorsque la machinerie de réplication de l’ADN fait face à des lésions génomiques ou lors d’une réparation couplée à la réplication, ce qui suggère que des dommages plus importants à l’ADN entraînent une augmentation des niveaux d’ADNss. Comme bon nombre de ces événements sont associés à la réplication, la formation de l’ADNss est considérée comme le marqueur du « stress de réplication » dans les cellules^15,16.

Ici, nous décrivons un test qui peut être utilisé pour quantifier de manière fiable l’ADNss dans les cellules. La simplicité, la reproductibilité et les avantages en termes de coûts de cette approche la rendent utilisable pour évaluer la réponse au stress de réplication dans les cellules. Des études émergentes ont révélé que le niveau d’ADNss peut également être un prédicteur des réponses à la chimiothérapie, telles que les inhibiteurs des enzymes PARP1/2, ATR et Wee1 kinase ^{17,18,19,20,21}. Ces inhibiteurs sont recherchés dans le schéma thérapeutique de plusieurs HGSOCs²². Par conséquent, ce test peut également être un outil utile pour prédire les réponses chimiothérapeutiques dans les cellules cancéreuses de l’ovaire.

Protocol

REMARQUE: La lignée cellulaire du cancer de l’ovaire, OVCAR3, a été utilisée dans ces étapes, mais ce protocole est largement applicable à plusieurs autres lignées cellulaires, y compris celles dérivées de sources non ovariennes. Un schéma du protocole est illustré à la figure 2. 1. Placage des cellules Faites des lamelles enduites de poly-L-lysine.Ajouter des lamelles autoclavées de 12 mm de diamètre dans un tube…

Representative Results

Des images représentatives et la quantification des foyers d’IdU provenant des noyaux dérivés des cellules non traitées et des cellules traitées avec 0,5 mM d’hydroxyurée pendant 24 h sont présentées à la figure 4. Les deux noyaux sont colorés et identifiables dans le canal DAPI. L’analyse de ces images consiste à quantifier le nombre de foyers dans chaque noyau. Le nombre de foyers est proportionnel au degré de contrainte de réplication. <p class="jove_content biglege…

Discussion

Comme il a été mentionné dans le protocole, il est utile d’inclure quelques témoins expérimentaux pour s’assurer que le test fonctionne. Il s’agit notamment d’un échantillon sans IdU traité ainsi que d’un échantillon sans anticorps primaire traité. Les deux témoins négatifs devraient produire des cellules colorées par DAPI mais ne contenant aucun signal IdU.

En fonction des conditions expérimentales et des lignées cellulaires utilisées, différentes dilutions d’antic…

Materials

3% Paraformaldehyde (PFA)	Fisher Scientific	NC0179595	10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C
5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C
Anti-BrdU antibody	BD Biosciences	347580	Storage: Store in 4 °C
Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody	Thermo Scientific	A32766	Light sensitive – keep in dark Storage: Store in 4 °C
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C
Circular Cover Glass	Electron Microscopy Sciences	72230-01
NIS GA3 Software	Nikon	77010604
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C
Poly-L-Lysine solution	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Storage: Store in 4 °C
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI	Thermo Scientific	P36962	Storage: Store in 4 °C
Trypsin-EDTA, 0.25%	Genesee Scientific	25-510	Storage: Store in 4 °C
Water, sterile-filtered	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Storage: Store in 4 °C