Tek Sarmallı DNA İmmünofloresan Kullanarak Yumurtalık Kanseri Hücrelerinde Replikasyon Stresinin Ölçülmesi
Summary
Burada, hücrelerdeki tek sarmallı DNA seviyelerini ölçmek için immünofloresan tabanlı bir yöntem tarif ediyoruz. Bu etkili ve tekrarlanabilir yöntem, birçok yumurtalık kanserinde ortak bir özellik olan replikasyon stresini incelemek için kullanılabilir. Ek olarak, bu tahlil, verimliliğini daha da artıran otomatik bir analiz boru hattı ile uyumludur.
Abstract
Replikasyon stresi, çeşitli yumurtalık kanserlerinin ayırt edici bir özelliğidir. Replikasyon stresi, çift iplikçik kırılmaları, transkripsiyon-replikasyon çatışmaları veya güçlendirilmiş onkogenler dahil olmak üzere birden fazla kaynaktan ortaya çıkabilir ve kaçınılmaz olarak tek sarmallı DNA’nın (ssDNA) üretilmesine neden olabilir. Bu nedenle, ssDNA’nın nicelleştirilmesi, farklı hücre tiplerinde ve çeşitli DNA’ya zarar veren koşullar veya tedaviler altında replikasyon stresi seviyesini değerlendirmek için bir fırsat sunar. Ortaya çıkan kanıtlar ayrıca ssDNA’nın DNA onarımını hedefleyen kemoterapötik ilaçlara verilen yanıtların bir göstergesi olabileceğini düşündürmektedir. Burada, ssDNA’yı ölçmek için ayrıntılı bir immünofloresan tabanlı metodolojiyi açıklıyoruz. Bu metodoloji, genomun bir timidin analoğu ile etiketlenmesini ve ardından denatüre olmayan koşullar altında kromatinde analogun antikor bazlı tespitini içerir. ssDNA’nın uzantıları, floresan mikroskop altında odaklar olarak görselleştirilebilir. Odakların sayısı ve yoğunluğu, çekirdekte bulunan ssDNA seviyesi ile doğrudan ilişkilidir. Ayrıca ssDNA sinyalini ölçmek için otomatik bir boru hattı da tanımlıyoruz. Yöntem hızlı ve tekrarlanabilir. Ayrıca, bu metodolojinin basitliği, ilaç ve genetik ekranlar gibi yüksek verimli uygulamalara uygun olmasını sağlar.
Introduction
Genomik DNA sıklıkla çeşitli endojen ve eksojen kaynaklardan gelen çoklu saldırılara maruz kalır1. Endojen hasarın sıklığı, yumurtalık kanserleri de dahil olmak üzere birçok kanser türünde özünde daha yüksek olan reaktif oksijen türleri veya aldehitler gibi metabolik yan ürünlerin seviyeleri ile doğrudan ilişkilidir 2,3. DNA hasarının etkili bir şekilde çözülmesi zorunludur; aksi takdirde, genotoksik lezyonları ve dolayısıyla mutageneziyi teşvik edebilir. Hücrelerin genotoksik lezyonları onarma yeteneği, hatasız DNA onarım yollarının işlevselliğine ve DNA hasarına yanıt olarak hücre döngüsü ilerlemesinin etkili bir şekilde düzenlenmesine bağlıdır. Özellikle, birçok yumurtalık kanseri, p53’te fonksiyonel olarak inaktive edici mutasyonlar taşır ve bu nedenle, bozulmamış genomik lezyonların varlığına rağmen hücrelerin DNA replikasyonunu başlatmasına yol açan kusurlu bir G1 / S kontrol noktasına sahiptir 4,5. Yumurtalık kanserlerinde DNA hasarının derecesi, yüksek dereceli seröz yumurtalık karsinomunun (HGSOC) % 50’sinden fazlasının BRCA1 ve BRCA2 aracılı homolog rekombinasyonda, hatasız DNA onarım yolunda kusurlara sahip olduğu ve yaklaşık% 20’sinin G1 hücrelerini erken S-faz6’ya iten CCNE1 geninde amplifikasyona sahip olduğu gözlemiyle daha da artmaktadır. . Endojen DNA hasarının yüksek sıklığı, kusurlu kontrol noktaları ve arızalı onarım yolakları birlikte, yumurtalık kanserlerinde genomik lezyonların birikimini katlanarak arttırır. Bu lezyonlar, DNA replikasyonu ve transkripsiyonu gibi kritik hücresel süreçlerin ilerlemesine engel teşkil edebilir. Aşağıda tartışıldığı gibi, bu tür engeller hücrelerde tek sarmallı DNA (ssDNA) oluşumunu katalize eder.
DNA’nın çift sarmalları, genomu spontan depurinasyon ve depirimidinasyon, sitozin deaminazların aktivitesi ve oksidatif DNA hasarı gibi çoklu mutajenik süreçlerden korumak için kritik öneme sahiptir 1,7. Buna karşılık, ssDNA bu mutasyonel olaylara karşı oldukça savunmasızdır. Hücrelerdeki çoklu süreçler ssDNA’nın üretilmesine neden olabilir (Şekil 1). Bunlar arasında şunlar bulunur:
(i) DNA replikasyon mekanizmasının durması: Bu, DNA helikaz ve polimerazın ayrılmasına yol açar ve ssDNA 8,9’un uzantılarını bırakır.
(ii) Transkripsiyon mekanizmasının durması: RNA polimerazın sürekli olarak durması, R-döngüleri adı verilen üç sarmallı hibrit DNA / RNA yapılarının üretilmesine yol açar. R-döngü oluşumu, yer değiştirmiş, transkribe edilmemiş DNA’yı tek bir iplik10 olarak ortaya çıkarır.
(iii) DNA son rezeksiyonu: Homolojiye yönelik onarımın başlatılması, homolog bir dizi11 arayışını katalize etmek için 3′ ssDNA’nın üretilmesini gerektirir.
(iv) D-döngüsü: Homolog rekombinasyon sırasında iplik invazyonu, şablon olmayan tamamlayıcı ipliğin yer değiştirmesine neden olabilir ve ssDNA12 ile sonuçlanabilir.
(v) Replikasyon-bağlı boşluklar: DNA replikasyonu sırasında, geciken iplik sentezi süreksiz bir şekilde gerçekleşir, böylece Okazaki parçaları önce üretilir ve sonra bağlanır. Okazaki parçalarının işlenmesindeki gecikme veya kusur da ssDNA oluşumuna neden olabilir. Son olarak, önde gelen bir iplikçik üzerindeki replikasyon çatalı duran bir lezyon, DNA polimeraz ve primaz ile karşılaşırsa, PRIMPOL sentezi aşağı yönde yeniden hazırlayabilir ve 13,14’ün arkasında bir ssDNA boşluğu bırakabilir.
Açıkçası, bu olayların çoğu ya DNA replikasyon mekanizması genomik lezyonlarla karşı karşıya kaldığında ya da replikasyonla birleştirilmiş onarım sırasında meydana gelir, bu da daha yüksek DNA hasarının ssDNA seviyelerinin artmasına yol açtığını düşündürür. Bu olayların birçoğu replikasyonla ilişkili olduğundan, ssDNA’nın oluşumu15,16 hücrelerinde “replikasyon stresinin” belirteci olarak kabul edilir.
Burada, hücrelerdeki ssDNA’yı güvenilir bir şekilde ölçmek için kullanılabilecek bir tahlil tarif ediyoruz. Bu yaklaşımın basitliği, tekrarlanabilirliği ve maliyet faydaları, hücrelerdeki replikasyon-stres tepkisini değerlendirmek için kullanılmasını uygun kılar. Ortaya çıkan çalışmalar, ssDNA seviyesinin, PARP1/2 enzimleri, ATR ve Wee1 kinaz 17,18,19,20,21 inhibitörleri gibi kemoterapiye verilen yanıtların bir göstergesi olabileceğini ortaya koymuştur. Bu inhibitörler birkaç HGSOC22’nin tedavi rejiminde takip edilmektedir. Bu nedenle, bu tahlil yumurtalık kanseri hücrelerinde kemoterapötik yanıtları tahmin etmek için de yararlı bir araç olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokolde belirtildiği gibi, tahlilin çalıştığından emin olmak için birkaç deneysel kontrol eklemek değerlidir. Bunlar arasında IdU ile tedavi edilmemiş bir numunenin yanı sıra birincil antikor ile tedavi edilmemiş bir örnek de bulunur. Her iki negatif kontrol de DAPI tarafından boyanmış ancak IdU sinyali içermeyen hücreler vermelidir.
Deneysel koşullara ve kullanılan hücre hatlarına bağlı olarak, en iyi floresan sinyalini elde etmek için farklı antikor seyreltmel…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PV, Barnes-Yahudi Hastanesi Vakfı aracılığıyla Alvin J. Siteman Kanser Merkezi tarafından Açılış Pedalı Sebep Hibesi, Marsha Rivkin Yumurtalık Kanseri Araştırma Merkezi’nden Pilot Araştırma Hibesi, Mary Kay Ash Vakfı ve V-Vakfı’ndan Kanser Araştırma Bursu ile desteklenmektedir. NR, Washington Üniversitesi, St. Louis’e NIH Hücre ve Moleküler Biyoloji eğitimi T32 hibesi ile desteklenmektedir.
Materials
| 3% Paraformaldehyde (PFA) | Fisher Scientific | NC0179595 | 10 g sucrose + 100 mL 10X PBS + water to make volume to 925 mL. Add 75 mL 40% Methanol free PFA, mix, and make aliquots of 50 mL before storage Storage: Store in -20 °C |
| 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) | Sigma Aldrich | I7125-5G | MW = 354.10 g/mol.For 10 mM stock: dissolve 3.541 mg IdU to 1 mL 1 N liquid ammonia Storage: Stored in -20 °C |
| Anti-BrdU antibody | BD Biosciences | 347580 | Storage: Store in 4 °C |
| Anti-mouse Alexa Fluor Plus 488 secondary antibody | Thermo Scientific | A32766 | Light sensitive – keep in dark Storage: Store in 4 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906-100G | Made by adding specific mass to volume of PBS Storage: Store in 4 °C |
| Circular Cover Glass | Electron Microscopy Sciences | 72230-01 | |
| NIS GA3 Software | Nikon | 77010604 | |
| OVCAR3 | ATCC | HTB-161 | Growth Media: RPMI supplemented with L-glutamine, 0.01 mg/mL bovine insulin; fetal bovine serum to a final concentration of 20% and 1X Pen Strep Storage: Freezing Media: growth media + 5% DMSO and stored in -80 °C |
| Poly-L-Lysine solution | Sigma Aldrich | P4832-50ML | Storage: Store in 4 °C |
| ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI | Thermo Scientific | P36962 | Storage: Store in 4 °C |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Genesee Scientific | 25-510 | Storage: Store in 4 °C |
| Water, sterile-filtered | Sigma Aldrich | W3500-6X500ML | Storage: Store in 4 °C |
Riferimenti
- Tubbs, A., Nussenzweig, A. Endogenous DNA damage as a source of genomic instability in cancer. Cell. 168 (4), 644-656 (2017).
- Konstantinopoulos, P. A., Ceccaldi, R., Shapiro, G. I., D’Andrea, A. D. Homologous recombination deficiency: Exploiting the fundamental vulnerability of ovarian cancer. Cancer Discovery. 5 (11), 1137-1154 (2015).
- Gee, M. E., Faraahi, Z., McCormick, A., Edmondson, R. J. DNA damage repair in ovarian cancer: Unlocking the heterogeneity. Journal of Ovarian Research. 11, 50 (2018).
- Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nature communications. 8, 1093 (2017).
- Kroeger, P. T., Drapkin, R. Pathogenesis and heterogeneity of ovarian cancer. Current Opinion in Obstetrics & Gynecology. 29 (1), 26-34 (2017).
- Patch, A. -. M., et al. Whole-genome characterization of chemoresistant ovarian cancer. Nature. 521 (7553), 489-494 (2015).
- Alexandrov, L. B., et al. The repertoire of mutational signatures in human cancer. Nature. 578 (7793), 94-101 (2020).
- Byun, T. S., Pacek, M., Yee, M. -. C., Walter, J. C., Cimprich, K. A. Functional uncoupling of MCM helicase and DNA polymerase activities activates the ATR-dependent checkpoint. Genes & Development. 19 (9), 1040-1052 (2005).
- Toledo, L. I., et al. ATR prohibits replication catastrophe by preventing global exhaustion of RPA. Cell. 155 (5), 1088-1103 (2013).
- Brickner, J. R., Garzon, J. L., Cimprich, K. A. Walking a tightrope: The complex balancing act of R-loops in genome stability. Molecular Cell. 82 (12), 2267-2297 (2022).
- Cejka, P., Symington, L. S. DNA end resection: Mechanism and control. Annual Review of Genetics. 55, 285-307 (2021).
- Kowalczykowski, S. C. An overview of the molecular mechanisms of recombinational DNA repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (11), 016410 (2015).
- Tirman, S., Cybulla, E., Quinet, A., Meroni, A., Vindigni, A. PRIMPOL ready, set, reprime. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 56 (1), 17-30 (2021).
- Taglialatela, A., et al. REV1-Polζ maintains the viability of homologous recombination-deficient cancer cells through mutagenic repair of PRIMPOL-dependent ssDNA gaps. Molecular Cell. 81 (19), 4008-4025 (2021).
- Cimprich, K. A., Cortez, D. ATR: An essential regulator of genome integrity. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (8), 616-627 (2008).
- Tirman, S., et al. Temporally distinct post-replicative repair mechanisms fill PRIMPOL-dependent ssDNA gaps in human cells. Molecular Cell. 81 (19), 4026-4040 (2021).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Xu, H., et al. CCNE1 copy number is a biomarker for response to combination WEE1-ATR inhibition in ovarian and endometrial cancer models. Cell Reports. Medicine. 2 (9), 100394 (2021).
- Konstantinopoulos, P. A., et al. A Replication stress biomarker is associated with response to gemcitabine versus combined gemcitabine and ATR inhibitor therapy in ovarian cancer. Nature Communications. 12, 5574 (2021).
- Buisson, R., Boisvert, J. L., Benes, C. H., Zou, L. Distinct but concerted roles of ATR, DNA-PK, and Chk1 in countering replication stress during S phase. Molecular Cell. 59 (6), 1011-1024 (2015).
- Belan, O., et al. POLQ seals post-replicative ssDNA gaps to maintain genome stability in BRCA-deficient cancer cells. Molecular Cell. 82 (24), 4664-4680 (2022).
- da Costa, A. A. B. A., et al. Targeting replication stress in cancer therapy. Nature Reviews. Drug Discovery. 22 (1), 38-58 (2023).
- Chen, R., Wold, M. S. Replication protein A: Single-stranded DNA’s first responder: Dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair. BioEssays. 36 (12), 1156-1161 (2014).
- Bhat, K. P., Cortez, D. RPA and RAD51: Fork reversal, fork protection, and genome stability. Nature Structural & Molecular Biology. 25 (6), 446-453 (2018).
- Maréchal, A., Zou, L. RPA-coated single-stranded DNA as a platform for post-translational modifications in the DNA damage response. Cell Research. 25 (1), 9-23 (2015).
