Summary
Qui, descriviamo la metodologia utilizzata per generare ceppi di L. panamensis e L . donovani che esprimono il gene per eGFP come transgene integrato stabile utilizzando il sistema pLEXSY. I parassiti trasfettati sono stati clonati limitando la diluizione e i cloni con la più alta intensità di fluorescenza in entrambe le specie sono stati selezionati per un ulteriore utilizzo nei saggi di screening farmacologico.
Abstract
I parassiti protozoari del genere Leishmania causano la leishmaniosi , una malattia con manifestazioni cliniche variabili che colpisce milioni di persone in tutto il mondo. L'infezione da L. donovani può provocare una malattia viscerale fatale. A Panama, Colombia e Costa Rica, L. panamensis è responsabile della maggior parte dei casi segnalati di leishmaniosi cutanea e mucocutanea. Studiare un gran numero di farmaci candidati con le metodologie disponibili fino ad oggi è abbastanza difficile, dato che sono molto laboriosi per valutare l'attività dei composti contro le forme intracellulari del parassita o per eseguire saggi in vivo . In questo lavoro, descriviamo la generazione di ceppi di L. panamensis e L. donovani con espressione costitutiva del gene che codifica per una proteina fluorescente verde potenziata (eGFP) integrata nel locus che codifica per l'rRNA 18S (ssu). Il gene che codifica per l'eGFP è stato ottenuto da un vettore commerciale e amplificato dalla reazione a catena della polimerasi (PCR) per arricchirlo e aggiungere siti di restrizione per gli enzimi BglII e KpnI. L'amplicone eGFP è stato isolato mediante purificazione su gel di agarosio, digerito con gli enzimi BglII e KpnI, e legato nel vettore di espressione di Leishmania pLEXSY-sat2.1 precedentemente digerito con lo stesso set di enzimi. Il vettore di espressione con il gene clonato è stato propagato in E. coli, purificato, e la presenza dell'inserto è stata verificata mediante colony PCR. Il plasmide purificato è stato linearizzato e utilizzato per trasfettare i parassiti di L. donovani e L . panamensis. L'integrazione del gene è stata verificata mediante PCR. L'espressione del gene eGFP è stata valutata mediante citometria a flusso. I parassiti fluorescenti sono stati clonati limitando la diluizione e i cloni con la più alta intensità di fluorescenza sono stati selezionati utilizzando la citometria a flusso.
Introduction
I parassiti protozoari del genere Leishmania causano la leishmaniosi, una malattia con una vasta gamma di manifestazioni cliniche. Questa malattia è prevalente in 98 paesi e la sua incidenza annuale è stimata tra 0,9 e 1,6 milioni di casi1. Le specie di Leishmania che sono patogene per l'uomo sono divise in due sottogeneri, vale a dire L. (Leishmania) e L. (Viannia). Infezione con alcune specie appartenenti alla L. (Leishmania) sottogenere, come L. donovani e L. infantum, può provocare leishmaniosi viscerale (VL), che è fatale se non trattata2. Specie appartenenti alla L. (Viannia) sono associati alla maggior parte dei casi di leishmaniosi cutanea (CL) e leishmaniosi mucocutanea (MCL) in America centrale e meridionale, in particolare a Panama, Colombia e Costa Rica, con L. panamensis che è il principale agente eziologico di queste presentazioni cliniche 3,4.
La chemioterapia anti-leishmania esistente che include farmaci come antimoniali pentavalenti, miltefosina e amfotericina B è altamente tossica e costosa. Inoltre, l'aumento della resistenza ai farmaci negli ultimi decenni è stato aggiunto ai fattori che interferiscono con il trattamento efficace dei pazienti in tutto il mondo5. Differenze sostanziali sono state dimostrate tra le specie del genere Leishmania in relazione alla suscettibilità ai farmaci, in particolare tra le specie del Nuovo e del Vecchio Mondo 6,7. Per questi motivi, è necessario indirizzare gli sforzi verso l'identificazione e lo sviluppo di nuovi farmaci anti-leishmania, prestando particolare attenzione agli approcci specie-specifici. Studiare grandi librerie di farmaci candidati con metodologie tradizionali è abbastanza difficile, dato che queste metodologie sono molto laboriose per valutare l'attività di composti contro amastigoti intracellulari o per eseguire esperimenti in vivo 8; Pertanto, è stato necessario sviluppare nuove tecniche che riducano questi svantaggi, compresa l'implementazione di geni reporter e lo sviluppo di saggi di screening fenotipico ad alto contenuto9.
L'uso di geni reporter ha dimostrato il potenziale per aumentare l'efficienza del processo di screening dei farmaci in quanto facilita lo sviluppo di saggi ad alto rendimento e in vivo. I parassiti ricombinanti della Leishmania che esprimono diversi geni reporter sono stati generati da vari gruppi di ricerca. I geni reporter, come la β-galattosidasi, la β-lattamasi e la luciferasi, sono stati introdotti in diverse specie di Leishmania utilizzando vettori episomiali, mostrando un'utilità limitata per lo screening dei farmaci nelle forme extra- e intracellulari del parassita 10,11,12,13,14,15. Questi approcci hanno il limite di richiedere una forte pressione selettiva in coltura per evitare l'eliminazione del costrutto episomiale, nonché l'uso di reagenti aggiuntivi per rivelare l'attività del gene reporter. Al contrario, la proteina fluorescente verde (GFP) e la sua variante, la proteina fluorescente verde potenziata (eGFP), sono state utilizzate nella generazione di un gran numero di ceppi transgenici di Leishmania per saggi di screening farmacologico in vitro grazie alla loro flessibilità e sensibilità, nonché alla possibilità di automatizzare il processo di screening utilizzando citometria a flusso o fluorometria15, 16,17,18,19. Nonostante i risultati promettenti, le colture di questi ceppi transgenici erano altamente eterogenee nei loro livelli di fluorescenza, poiché il numero di copie del gene GFP non era lo stesso in tutti i parassiti. Inoltre, il mantenimento della fluorescenza richiedeva una pressione selettiva costante sui parassiti in coltura, poiché il gene GFP è stato introdotto in un costrutto episomiale.
Per le ragioni esposte in precedenza, molti sforzi si sono concentrati sullo sviluppo di nuove metodologie per la produzione di ceppi ricombinanti stabili. Questi sforzi si sono basati principalmente sull'integrazione dei geni reporter nei loci ribosomiali, sfruttando i più alti tassi di trascrizione dei geni ribosomiali20. I ceppi di L. infantum e L. amazonensis sono stati generati dopo aver integrato i geni che codificano per β-galattocidasi 21, IFP 1.4, iRFP 22 e tdTomato23, e sono stati valutati per la loro utilità nei saggi di screening dei farmaci. Vari gruppi hanno sviluppato ceppi di L. donovani che esprimono la GFP costitutivamente integrando il suo gene codificante nel locus dell'RNA ribosomiale 18S (locus ssu) attraverso la ricombinazione omologa24,25; hanno mostrato un'espressione stabile e omogenea di GFP nella popolazione trasfettata, inclusi amastigoti intracellulari 24,25, e sono stati implementati con successo nei saggi di screening dei farmaci24,25,26. Bolhassani et al.27 hanno sviluppato ceppi di L. major e L. infantum che esprimono GFP come transgene integrato. Hanno usato il vettore di integrazione pLEXSY, originariamente progettato per l'espressione transgenica di proteine in un sistema che utilizza L. tarentolae come ospite28. Il vettore pLEXSY-GFP ha dimostrato di essere molto efficiente per la generazione di diversi ceppi di Leishmania che esprimono costitutivamente GFP 24,25,27,29,30. In questi parassiti, la fluorescenza è omogenea e mantenuta nelle forme intracellulari, potendo essere rilevata nelle lesioni del cuscinetto dei topi infetti27.
In questo lavoro, descriviamo la metodologia utilizzata per generare ceppi di L. panamensis e L . donovani che esprimono il gene che codifica per eGFP come transgene integrato utilizzando il sistema pLEXSY. I ceppi generati attraverso questo processo sono utilizzati nel nostro laboratorio per eseguire saggi di screening farmacologico che valutano la potenziale attività anti-leishmania di molecole di origine naturale e sintetica.
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Protocol
Per mantenere i campioni sterili, tutte le fasi che coinvolgono la coltura parassitaria devono essere eseguite all'interno di una cappa di livello di biosicurezza 2 (BSL-2) o secondo le normative locali in materia di salute e sicurezza. Un riepilogo grafico di questo protocollo è disponibile nella Figura 1.
Figura 1: Schema riassuntivo del protocollo per la generazione di parassiti L. panamensis e L. donovani che esprimono eGFP utilizzando la famiglia di vettori pLEXSY-2.1. Tutte e sei le sezioni principali descritte nell'articolo sono rappresentate qui. 1) Amplificazione e inserzione del gene eGFP nel vettore pLEXSY-2.1: il gene bersaglio viene amplificato, aggiungendo i siti di riconoscimento per gli enzimi KpnI e BglII, e sia l'amplicone eGFP che il plasmide pLEXSY vengono digeriti sequenzialmente con entrambi gli enzimi per la successiva legatura con T4 ligasi. 2) Linearizzazione del plasmide di espressione pLEXSY: il costrutto pLEXSY + eGFP viene digerito con SwaI per la linearizzazione e purificazione della cassetta di espressione 7-8 kbp. 3) Trasfezione e 4) selezione policlonale: i promastigoti di Leishmania vengono trasfettati con la cassetta di espressione mediante elettroporazione e rimessi in coltura per la selezione antibiotica di parassiti ricombinanti. La fluorescenza parassitaria è confermata attraverso la citometria a flusso. 5) Conferma dell'integrazione genomica e 6) clonaggio mediante diluizione limitante: l'integrazione della cassetta di espressione pLEXSY-eGFP è confermata dalla PCR diagnostica, utilizzando un primer in avanti ibridante alla cassetta di espressione e un primer inverso ibridante ad una sequenza cromosomica assente nella cassetta di espressione. Le colture trasfettate potrebbero essere arricchite per i parassiti fluorescenti mediante clonazione limitando la diluizione e i cloni con le più alte intensità fluorescenti medie possono essere selezionati per ulteriori applicazioni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
1. Amplificazione e inserzione del gene eGFP nel vettore pLEXSY-2.1
- Amplificazione del gene eGFP
NOTA: Poiché questo protocollo utilizza la famiglia di vettori pLEXSY-2.1 (vedi Tabella dei Materiali) per l'espressione costitutiva di proteine bersaglio in seguito all'integrazione della cassetta di espressione nel locus cromosomico 18S rRNA (ssu) delle specie di Leishmania , il primo passo è introdurre nel gene eGFP le sequenze contenenti i siti di restrizione che ne consentono l'inserimento nei vettori pLEXSY-2.1. In questo caso, poiché l'eGFP deve essere espresso solo citosolicamente, i siti di restrizione per gli enzimi BglII e KpnI sono stati aggiunti rispettivamente nelle estremità 5' e 3' del gene eGFP. La clonazione con KpnI porta alla fusione della proteina bersaglio in un tag poliistidina C-terminale di sei residui, seguito da un codone di stop codificato nel plasmide pLEXSY-2.1 per un'ulteriore purificazione della proteina di interesse. Per questo motivo, la sequenza di primer inversa non contiene un codone di stop.- A seconda della sorgente plasmidica per eGFP, analizzare la sequenza target utilizzando uno strumento di analisi delle restrizioni come NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)31 per assicurarsi che non contenga siti interni per gli enzimi di restrizione utilizzati per il clonaggio (BglII e KpnI) o per SwaI, che è l'enzima utilizzato per la linearizzazione del vettore prima della trasfezione.
- Progettare primer forward e reverse per l'amplificazione eGFP contenenti le sequenze di restrizione BglII e KpnI. Ad esempio, la fonte eGFP per questo protocollo era il plasmide pEGFP-N1-1X32, e le sequenze di primer erano quelle riportate da Bolhassani et al.27:
Forward primer (EGFP1): 5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3' (BglII restriction site in grassetto).
Reverse primer (EGFP2): 5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3' (KpnI restriction site in grassetto). - Amplificare il gene bersaglio utilizzando una polimerasi ad alta fedeltà per garantire la conservazione della sequenza codificante. Ad esempio, per i primer EGFP1 e EGFP2, eseguire il protocollo di ciclo PCR come riportato da Bolhassani et al.27. Eseguire una denaturazione iniziale di 2 min a 94 °C, seguita da 30 cicli di 30 s a 94 °C, 30 s a 57 °C e 1 min a 72 °C. Eseguire una fase di estensione finale di 10 minuti a 72 °C. Aggiungere i primer ad una concentrazione finale di 0,2 μM.
- Purificare il frammento utilizzando un kit di purificazione del prodotto PCR convenzionale o una precipitazione standard di acetato di sodio ed etanolo, come descritto altrove33.
- Inserimento dell'eGFP nel vettore di espressione pLEXSY-2.1
- Tagliare le estremità del prodotto eGFP-PCR utilizzando BglII e KpnI, seguendo le istruzioni del produttore.
- In primo luogo, impostare la reazione per l'enzima che richiede la più bassa concentrazione di sale (in questo caso, KpnI), secondo le istruzioni del produttore, e incubare a 37 ° C per 1 ora.
- Quindi, aggiungere 100 mM NaCl e 10 unità di BglII e incubare per 15 minuti. Purificare la reazione, come descritto al punto 1.1.4.
- Digerire il vettore di espressione di pLEXSY con BglII e KpnI, seguendo il protocollo di digestione sequenziale descritto al punto 1.2.1.
- Ligare il vettore pLEXSY e il gene eGFP con T4 ligasi utilizzando un rapporto molare di 1:3 (vector:insert). Aggiungere brevemente 100 ng di pLEXSY digerito e 28 ng di prodotto eGFP digerito a una reazione da 20 μL contenente tampone ligasi ad una concentrazione finale di 1x e 3 unità di T4 DNA ligasi. Incubare per una notte a 4 °C.
- Trasformare cellule di E. coli competenti, come XL-10, DH5α o DH10B, con il prodotto di legatura ottenuto nella fase 1.2.3 utilizzando protocolli di trasformazione standard33. Placcare le cellule trasformate in agar Luira-Bertani (LB)-ampicillina e incubare per 24 ore a 30 °C per selezionare cloni ricombinanti (i plasmidi pLEXSY sono più stabili in E. coli a 30 °C che a 37 °C).
- Screening per la presenza dell'inserto nei plasmidi mediante PCR di colonia.
- Prelevare singole colonie, risospendere in 20 μL di acqua priva di nucleasi, riscaldare a 95 °C per 15 minuti e prelevare 1 μL di lisato come modello di DNA per la PCR di colonia. Utilizzare il primer forward per l'amplificazione eGFP, descritto al punto 1.1.2 (in questo esempio, EGFP1), e il primer A264 (5'-CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAAG-3') come primer inverso29.
- Il primer A264 è progettato per ricottura 80 bp dopo il codone di stop dell'inserto nei vettori di espressione pLEXSY-2.1. Ad esempio, per la coppia di primer EGFP1 + A264, utilizzare un protocollo di ciclo PCR consistente in una denaturazione iniziale di 2 min a 94 °C, seguita da 30 cicli di 30 s a 94 °C, 30 s a 50 °C e 1 min a 72 °C. Eseguire una fase di estensione finale di 10 minuti a 72 °C. I primer vengono aggiunti ad una concentrazione finale di 0,2 μM.
NOTA: il prodotto previsto utilizzando questo set di primer è lungo 859 bp. I siti di ricottura per i primer EGFP1 e A264 sono illustrati nella Figura 2.
- Preparare il DNA plasmidico purificato da un clone positivo per la successiva trasfezione utilizzando un kit di isolamento plasmidico commerciale o una precipitazione alcalina standard33. Utilizzare 50 ml di coltura notturna a 30 °C per isolare almeno 10 μg di plasmide/clone positivo.
- Tagliare le estremità del prodotto eGFP-PCR utilizzando BglII e KpnI, seguendo le istruzioni del produttore.
2. Linearizzazione del plasmide di espressione pLEXSY
- Utilizzare almeno 10 μg del plasmide purificato pLEXSY-eGFP per la digestione con SwaI (sito di riconoscimento: 5'-ATTTAAAT-3'). Digerire per 3-4 ore a 25 °C e inattivare a 65 °C per 20 min.
- Eseguire il prodotto digestivo in elettroforesi su gel di agarosio per separare i frammenti risultanti. Questa digestione genererà due frammenti, un frammento di 2,9 kbp che rappresenta gli elementi necessari per la replicazione e la selezione in E. coli e un frammento di 7-8 kbp che rappresenta la cassetta di espressione linearizzata.
- Purificare la cassetta di espressione utilizzando un kit commerciale per l'estrazione del gel di agarosio.
3. Trasfezione di L. panamensis e L. donovani mediante elettroporazione
NOTA: La cultura della Leishmania viene eseguita come descritto altrove34. In questo esempio, L. panamensis e L. donovani promastigotes sono stati coltivati nel mezzo di insetti di Schneider, integrati con il 20% (v/v) di siero fetale bovino (FBS) e 50 μg/mL di gentamicina, e incubati a 26 °C.
- Coltiva le colture di parassiti fino a quando non ci sono abbastanza promastigoti in fase logaritmica o in fase stazionaria precoce per utilizzare circa 4 x 107 parassiti per trasfezione. La densità cellulare massima per pallone di coltura prima di raggiungere la fase stazionaria può variare a seconda delle specie di Leishmania e di quanto bene i ceppi sono adattati alle condizioni di laboratorio. Se necessario, raggruppa il contenuto di più borracce di coltura.
- Centrifugare la coltura parassitaria a 2.000 x g per 3 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Risospendere il pellet in tampone di elettroporazione a 4 °C (21 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na2HPO4 e 6 mM glucosio; pH 7,5)27 per ottenere una concentrazione di 1 x 108 parassiti/mL. Mettere in ghiaccio per 10 min.
NOTA: Il tampone per elettroporazione deve essere sterilizzato filtrando prima dell'uso. - In parallelo, tubi pre-chill con 2-10 μg di pLEXSY-eGFP linearizzato costrutto in un volume massimo di 50 μL di acqua o tampone tris 10 mM (pH 8,0) e cuvette di elettroporazione di d = 2 mm.
- Aggiungere 350 μL di parassiti pre-raffreddati al tubo con il plasmide linearizzato e trasferire l'intero 400 μL alla cuvetta di elettroporazione su ghiaccio. In parallelo, elettroporare le cellule del parassita senza DNA plasmidico come controllo negativo.
- Elettroporate utilizzando uno di questi due protocolli:
Decadimento esponenziale: 450 V, 450 μF, un impulso.
Costante di tempo: 450 V, T = 3,5 ms, un impulso.
NOTA: Questi protocolli sono stati eseguiti utilizzando un pulser genetico commerciale (Table of Materials) con moduli PC e CE. - Rimettere la cuvetta sul ghiaccio per 10 minuti e trasferire i parassiti elettroporati a 5 ml del terreno di coltura appropriato. Questo esempio ha utilizzato il mezzo di insetti di Schneider integrato con FBS al 20% (v / v). Incubare a 26 °C per 20 h.
4. Selezione policlonale in coltura
- Circa 20 ore dopo l'elettroporazione, osservare le colture al microscopio. Almeno la metà della popolazione di parassiti dovrebbe mostrare morfologia e motilità visivamente buone (promastigotiti simili a gocce con flagello oscillante che si muove attraverso i mezzi e/o forma aggregati parassitari attivi). Aggiungere l'antibiotico selettivo appropriato a seconda del plasmide pLEXSY utilizzato. In questo esempio viene utilizzato pLEXSY-sat2.1, che contiene streptotricina acetiltransferasi come marcatore di selezione. Pertanto, utilizzare la nourseotricina come antibiotico selettivo ad una concentrazione di 0,1 mg / ml.
- Seguire le colture al microscopio fino a quando non si vede una chiara differenza tra i parassiti elettroporati con e senza DNA plasmide.
- Verificare la fluorescenza del parassita attraverso la citometria a flusso.
- Centrifugare 1 mL di coltura in fase stazionaria a 2.000 x g per 3 minuti a RT. Lavare due volte in PBS e risospendere il pellet finale in 1 mL di PBS.
NOTA: La fluorescenza dell'eGFP può essere rilevata nel canale FL1 della maggior parte dei citometri commerciali. Le impostazioni di guadagno per la dispersione diretta e laterale e il canale FL1 possono variare tra i citometri. Per questo esempio, è stato utilizzato un citometro spaziale CyFlow (Sysmex). - Eseguire i campioni, raccogliendo 20.000 eventi a una velocità di 0,5 μL/s, e impostare i valori di guadagno per i canali di dispersione diretta (FSC), dispersione laterale (SSC) e fluorescenza 1 (FL-1) rispettivamente come 225,0, 200,0 e 520,0. Eseguire un campione di controllo con parassiti non fluorescenti per determinare la popolazione di parassiti in un dot-plot FSC rispetto a SSC.
- Creare un gate (G1) contenente la popolazione di parassiti e filtrare il canale FL-1 attraverso quel gate per determinare l'autofluorescenza dei promastigoti e impostare un range gate (G2) per il canale FL-1.
- Eseguire i parassiti trasfettati per verificare se c'è fluorescenza. Registrare la percentuale di parassiti in G1 che sono fluorescenti e la media dell'intensità di fluorescenza in G2.
- Centrifugare 1 mL di coltura in fase stazionaria a 2.000 x g per 3 minuti a RT. Lavare due volte in PBS e risospendere il pellet finale in 1 mL di PBS.
5. Conferma dell'integrazione genomica
NOTA: L'integrazione della cassetta di espressione pLEXSY-eGFP può essere confermata mediante PCR diagnostico, utilizzando un primer diretto che ibrida la cassetta di espressione (varia a seconda del vettore pLEXSY-2.1 utilizzato) e il primer inverso F3002 (5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3') che si ibrida in una sequenza cromosomica ssu-fiancheggiante assente nella cassetta di espressione. In questo esempio, il primer anteriore F2999 (5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3') viene utilizzato come ibridazione nella cassetta di espressione pLEXSY-sat2.1. Una rappresentazione schematica della cassetta di espressione integrata e dei siti di ricottura del primer per la PCR diagnostica è illustrata nella Figura 2.
- Purificare il DNA genomico da 2-5 ml di una coltura parassitaria in fase stazionaria mediante estrazione convenzionale di fenolo/cloroformio35 o con un kit commerciale.
- Eseguire la PCR diagnostica per pLEXSY-sat2.1 utilizzando un protocollo ciclico consistente in una denaturazione iniziale di 2 min a 94 °C, seguita da 30 cicli di 30 s a 94 °C, 30 s a 53 °C e 1 min a 72 °C. Eseguire una fase di estensione finale di 10 minuti a 72 °C. I primer vengono aggiunti ad una concentrazione finale di 0,2 μM.
Figura 2: Rappresentazione schematica della cassetta di espressione integrata. Le caselle etichettate come Chr-S (grigio) rappresentano le sequenze cromosomiche adiacenti del locus 18S rRNA (ssu) in cui è integrata la cassetta di espressione. La cassetta di espressione integrata consiste di sequenze di 5' e 3' (blu) per la ricombinazione omologa nel locus ssu , un promotore ribosomiale aggiuntivo della Leishmania (rosso) per una maggiore produzione di proteine, il gene eGFP (verde), un gene marcatore di selezione (giallo) e tre regioni non tradotte (grigio chiaro), vale a dire utr1, 2 e 3, che forniscono i segnali di splicing per l'elaborazione post-trascrizionale dell'mRNA per l'espressione ottimizzata di eGFP e il marcatore di selezione nei parassiti della Leishmania . I siti di ricottura per primer avanti e indietro utilizzati per la verifica della presenza dell'inserto mediante colony PCR (fase 1.2.5) sono contrassegnati dalle frecce nere etichettate rispettivamente come cpcr-fwd (primer EGFP1) e cpcr-rev (primer A264), che delimitano un prodotto da 859 bp. I siti di ricottura per primer avanti e indietro utilizzati per la verifica dell'integrazione genomica mediante PCR diagnostica (fase 5) sono contrassegnati dalle frecce nere etichettate rispettivamente come sat-fwd (primer F2999) e ssu-rev (primer F3002), che delimitano un prodotto da 2.271 bp. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
6. Clonazione mediante limitazione della diluizione (facoltativo)
- Dopo la conferma della fluorescenza attraverso citometria a flusso, preparare una diluizione dei parassiti ricombinanti ad una concentrazione di cinque promastigoti/mL36.
- Aggiungere 100 μL di questa diluizione in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. In questo modo, le piastre vengono seminate ad una densità media di 0,5 promastigotes/pozzetto, il che assicura che alcuni pozzetti ricevano un singolo parassita riducendo al minimo la probabilità di avere più di un parassita per pozzetto36.
- Lasciare il piatto indisturbato per almeno 12 ore. Seguire la piastra al microscopio con un ingrandimento minimo di 100x fino a quando non vengono rilevati pozzetti con crescita parassitaria.
- Quando un pozzetto è pieno di parassiti, utilizzare il contenuto per inoculare una coltura da 5 ml. Questo richiede 1-2 settimane.
- Quando le colture con sementi clonate raggiungono la fase stazionaria, verificare la fluorescenza mediante citometria a flusso, come descritto nella fase 4.3. Selezionare i cloni da utilizzare per ulteriori test in vitro e in vivo in base alla percentuale di parassiti fluorescenti e all'intensità media di fluorescenza misurata nel canale FL-1. Puntare a cloni con il 98%-99% di parassiti fluorescenti e selezionare quelli con la più alta intensità media di fluorescenza.
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Representative Results
Dopo aver costruito il costrutto pLEXSY-eGFP e trasformato cellule di E. coli competenti, le colonie contenenti il costrutto con l'inserto eGFP genereranno un prodotto di circa 859 bp dopo aver eseguito la PCR di colonia descritta nella sezione 1.2 (Figura 3A). La digestione totale del plasmide purificato da colonie positive utilizzando SwaI dovrebbe dare due frammenti caratteristici in elettroforesi su gel, un frammento di 2,9 kbp che è la porzione del vettore PLEXSY contenente tutti gli elementi necessari per la replicazione e la selezione in E. coli, e un frammento di 7-8 kpb che rappresenta la cassetta di espressione linearizzata che viene utilizzata per la trasfezione (Figura 3B).
Dopo la trasfezione, la selezione policlonale viene effettuata principalmente qualitativamente. Lo stato delle colture di parassiti durante la selezione con antibiotici viene monitorato al microscopio, prestando particolare attenzione alla morfologia e alla motilità del parassita. Dopo il successo del recupero di una coltura di parassiti trasfettati, quelli che esprimono efficacemente eGFP dovrebbero essere rilevati nel canale FL-1 di un citometro a flusso (Figura 4A); l'efficienza della trasfezione può variare tra le diverse specie di Leishmania . In questo lavoro, dopo la selezione policlonale, il 98,44% dei parassiti di L. donovani analizzati mediante citometria a flusso erano fluorescenti rispetto all'82,00% di L. panamensis (Figura 4B). Se la cassetta di espressione di pLEXSY-eGFP è stata integrata con successo nel locus ssu , deve essere osservato un prodotto a 2,3 kbp dopo aver eseguito la PCR diagnostica descritta nel paragrafo 5 (Figura 4C). Questi risultati assicurano che si ottengano parassiti ricombinanti che esprimono costitutivamente l'eGFP come transgene integrato e rimarranno stabili nei passaggi successivi della coltura parassitaria.
La clonazione mediante diluizione limitante consente l'arricchimento della popolazione di parassiti fluorescenti con minori efficienze di trasfezione, come L. panamensis, nonché la selezione di cloni con le più alte intensità di fluorescenza. Sono stati ottenuti quattro cloni per ciascuna delle specie di Leishmania utilizzate in questo lavoro (Tabella 1), vale a dire Lpan-A7, F11, F12 e H2 per L. panamensis e Ldon-C1, G4, F2 e H1 per L. donovani. Cloni con la più alta percentuale di parassiti fluorescenti (Lpan-F11 = 95,74%; Ldon-C1 = 99,16%) e intensità media di fluorescenza (Lpan-F11 = 35,63 unità fluorescenti relative [RFU]; Ldon-C1 = 14,12 RFU) sono stati selezionati per un ulteriore utilizzo nei saggi di screening farmacologico.
Figura 3: Risultati rappresentativi della preparazione del costrutto pLEXSY-eGFP per la trasfezione. (A) Risultati rappresentativi della PCR della colonia. Corsia 1: scala da 1 kb (unità in coppie di basi); corsie 2, 10 e 12: campioni negativi per la presenza dell'inserto eGFP; corsie 3-9 e 13-14: campioni positivi per la presenza dell'inserto eGFP. (B) Risultati della linearizzazione con SwaI. Lane 1: 1 kb ladder (unità in coppie di basi); corsie 2-4: reazioni di digestione di plasmidi purificati da tre diverse colonie positive per la presenza dell'inserto eGFP. Si osservano un frammento di 2,9 kbp che rappresenta gli elementi necessari per la replicazione e la selezione in E. coli e un frammento di 7-8 kpb che rappresenta la cassetta di espressione linearizzata. Entrambi i gel sono stati preparati con una concentrazione di agarosio dell'1%. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Risultati rappresentativi della conferma dell'espressione di eGFP e dell'inserimento cromosomico della cassetta di espressione . (A) Istogramma di citometria a flusso nel canale FL-1. Rosso: cellule wild-type senza eGFP; Blu: parassiti trasfettati di L. panamensis con l'82,00% della popolazione che esprime eGFP. (B) Confronto dei risultati della trasfezione tra L. panamensis (Lpan-1) e L. donovani (Ldon-1). Una maggiore efficienza di trasfezione è stata osservata in L. donovani (98,44%) rispetto a L. panamensis (82,00%) dopo selezione policlonale. (C) Risultati della PCR per la conferma dell'integrazione genomica. L: scala da 100 bp (unità in coppie di basi); corsie 1-4: campioni provenienti da quattro diversi cloni di L. panamensis che mostrano un prodotto caratteristico di 2,3 kbp per l'integrazione di pLEXSY-sat2.1 nel locus ssu . Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
| Specie | Codice clone | Percentuale di parassiti fluorescenti | Intensità media di fluorescenza* |
| L. panamensis | Lpan-A7 | 90.00 | 24.70 |
| LPAN-F11 | 95.74 | 35.63 | |
| LPAN-F12 | 92.85 | 34.44 | |
| Lpan-H2 | 85.00 | 20.66 | |
| L. donovani | LDON-C1 | 99.16 | 14.12 |
| Ldon-G4 | 99.21 | 13.96 | |
| Ldon-F2 | 97.96 | 11.67 | |
| Ldon-H1 | 98.97 | 12.90 |
Tabella 1: Cloni ottenuti limitando la diluizione. Quattro cloni sono stati ottenuti limitando la diluizione per ciascuna delle specie di Leishmania utilizzate in questo lavoro. La percentuale di parassiti fluorescenti e l'intensità media della fluorescenza sono riportate per ciascun clone. *La fluorescenza è espressa in unità di fluorescenza relativa (RFU).
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Discussion
I vantaggi e gli svantaggi di vari geni reporter sono stati studiati in diversi protozoi parassiti. Tra questi, GFP ed eGFP sono intrinsecamente fluorescenti e consentono una facile quantificazione e imaging. L'attività fluorescente di queste proteine può essere rilevata con una manipolazione minima utilizzando microscopia a fluorescenza, fluorimetria o citometria a flusso. Pochi studi sono stati condotti per generare L che esprime GFP. (Viannia), nonostante la dimostrata robustezza della GFP e dei loro derivati come geni reporter nelle specie di Leishmania del Vecchio Mondo15,16,18,24. Varela et al.37 hanno sviluppato ceppi di L. panamensis che esprimono GFP come transgene episomiale. L'analisi citometrica a flusso sia dei promastigoti axenici che degli amastigoti intracellulari ha mostrato l'utilità di questi parassiti per i saggi di screening farmacologico. Tuttavia, la fluorescenza era molto eterogenea e il numero di parassiti fluorescenti nella popolazione trasfettata dipendeva dalla costante pressione selettiva con l'antibiotico tunicamicina. Questi fatti limitano l'uso di questi parassiti come amastigoti intracellulari per i test di screening farmacologico, dato che la tunicamicina non può essere aggiunta ai macrofagi infetti38, lasciando parassiti con bassa fluorescenza presenti nella popolazione di amastigoti intracellulari che potrebbero influenzare la quantificazione dei macrofagi infetti.
L'uso di vettori come pLEXSY costituisce uno strumento potente e affidabile per la modifica stabile dei parassiti delle specie Leishmania attraverso l'integrazione di transgeni mediante ricombinazione omologa28. La cassetta pLEXSY è integrata nel locus dell'rRNA 18S (ssu), la cui trascrizione è sotto il controllo del promotore forte della RNA polimerasi I, portando a tassi di trascrizione più elevati20. L'uso di questo sistema ha dimostrato di consentire un'espressione stabile e omogenea della proteina bersaglio27. Queste caratteristiche favoriscono l'espressione di eGFP e il suo uso in saggi intracellulari con livelli omogenei di fluorescenza nelle cellule infette, nonché il suo uso per infezioni sperimentali in modelli murini. La famiglia di vettori pLEXSY-2.1 utilizzata in questo protocollo è stata progettata con un promotore ribosomiale Leishmania aggiuntivo davanti alla cassetta di espressione, aumentando la produzione di proteine29,30.
In questo protocollo, ci sono diversi passaggi critici per ottenere risultati ottimali. In primo luogo, la clonazione del gene bersaglio dovrebbe essere eseguita utilizzando una polimerasi33 ad alta fedeltà e la digestione del DNA bersaglio e del vettore di espressione dovrebbe essere effettuata utilizzando un protocollo di digestione sequenziale quando si utilizza la combinazione BglII/KpnI per la clonazione. Quest'ultimo perché non esiste un tampone in cui sia BglII che KpnI mostrino un'attività ottimale, sebbene entrambi gli enzimi siano attivi in modo ottimale alla stessa temperatura (37 °C). In secondo luogo, la selezione dei cloni ricombinanti dopo la trasformazione in E. coli deve essere effettuata a 30 °C, poiché i plasmidi pLEXSY sono più stabili a questa temperatura in E. coli28,29. Inoltre, i tassi di crescita di L. panamensis e L. donavani potrebbero essere molto diversi. Durante l'esecuzione degli esperimenti descritti in questo articolo, L. panamensis di solito impiegava più tempo per raggiungere la fase stazionaria. I tassi di crescita possono anche variare da ceppo a ceppo in diversi laboratori; Pertanto, è necessario caratterizzare i tassi di crescita dei ceppi di laboratorio per stimare il tempo necessario per raggiungere la concentrazione di parassiti richiesta per l'elettroporazione. L'uso del tampone riportato da Bolhassani et al.27 per l'elettroporazione è una modifica importante che aumenta significativamente la sopravvivenza dei parassiti elettroporati rispetto all'elettroporazione diretta in un terreno di coltura, come suggerito dal protocollo originale di Jena Bioscience. Durante la selezione policlonale, è estremamente importante non lasciare che le colture elettroporate crescano troppo prima di aggiungere l'antibiotico selettivo; Altrimenti, i parassiti non ricombinanti supereranno quelli ricombinanti27. Ci vorranno uno o due passaggi consecutivi (inoculo 1:10) in terreno fresco con l'antibiotico appropriato per ottenere una coltura torbida di parassiti ricombinanti resistenti agli antibiotici e un chiaro controllo negativo. I passaggi devono essere effettuati entro 5 giorni dalla prima aggiunta di antibiotici. Infine, ci sono notevoli differenze nell'efficienza della trasfezione e nell'integrazione della cassetta di espressione pLEXSY tra L. panamensis e L. donovani24,37. Mentre in L. donovani quasi il 98% della popolazione totale analizzata attraverso citometria a flusso dopo selezione policlonale mostra fluorescenza, in L. panamesis la percentuale di parassiti fluorescenti è intorno all'80%. Per questo motivo, la fase facoltativa della clonazione limitando la diluizione è una modifica per lo più necessaria per ottenere una popolazione di L. panamensis in cui oltre il 95% dei parassiti analizzati attraverso la citometria a flusso sono fluorescenti. L'uso dei plasmidi pLEXSY è limitato alla modificazione genomica delle specie di Leishmania, in quanto sono stati originariamente progettati per utilizzare L. tarentolae come piattaforme di produzione proteica28. Sebbene pLEXSY abbia dimostrato di funzionare in diverse specie di Leishmania diverse da L. tarentolae21,24,27, è importante verificare la conservazione della sequenza ssu quando si lavora con una nuova specie di Leishmania per assicurarsi che i siti di ricombinazione nel plasmide pLEXSY funzionino.
Il metodo descritto in questo articolo consente la produzione di parassiti ricombinanti della Leishmania con un'espressione costitutiva e stabile di eGFP o di qualsiasi altro reporter di interesse. In questi parassiti, la fluorescenza è omogenea e viene mantenuta in forme intracellulari. Pertanto, i ceppi generati attraverso questo processo potrebbero essere utilizzati per standardizzare i saggi di screening dei farmaci ad alto rendimento per valutare la potenziale attività anti-leishmania di molecole di origine naturale e sintetica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato dalla Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), Panamá, numero di sovvenzione NI-177-2016, e Sistema Nacional de Investigación (SNI), Panamá, numeri di sovvenzione SNI-169-2018, SNI-008-2022 e SNI-060-2022.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Microplates | Corning | CLS3340 | Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, suitable for cell culture |
| BglII restriction enzyme | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Cell Culture Flasks | Corning | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | Not available | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Gel Loading Buffer | Sigma-Aldrich | G2526 | The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading. |
| Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber. |
| Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Inverted microscope | Olympus | IXplore Standard | |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3142S | 4,000 units. 20,000 units/mL |
| LB Broth with agar | Sigma-Aldrich | L3147 | Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture. |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L2542 | Liquid microbial growth medium |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad | 1640300 | Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray |
| pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence |
| pLEXSYcon2.1 expression kit | Jena Bioscience | EGE-1310sat | Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing. |
| Potassium Chloride | Millipore | 529552 | Molecular Biology Grade - CAS 7447-40-7 - Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures. |
| Schneider′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | Medium used in our laboratory for culturing Leishmania. |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration) |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri |
| SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Syringe filters | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9285 | |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA. |
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