Summary
Her beskriver vi metodikken som brukes til å generere L. panamensis og L . donovani-stammer som uttrykker genet for eGFP som et stabilt integrert transgen ved hjelp av pLEXSY-systemet. Transfekterte parasitter ble klonet ved å begrense fortynning, og kloner med høyest fluorescensintensitet i begge arter ble valgt for videre bruk i screeninganalyser.
Abstract
Protozoan parasitter av slekten Leishmania forårsaker leishmaniasis , en sykdom med variable kliniske manifestasjoner som rammer millioner av mennesker over hele verden. Infeksjon med L. donovani kan føre til dødelig visceral sykdom. I Panama, Colombia og Costa Rica er L. panamensis ansvarlig for de fleste rapporterte tilfellene av kutan og mukokutan leishmaniasis. Det er ganske vanskelig å studere et stort antall legemiddelkandidater med metodene som er tilgjengelige til dags dato, gitt at de er svært arbeidskrevende for å evaluere aktiviteten til forbindelser mot intracellulære former av parasitten eller for å utføre in vivo-analyser . I dette arbeidet beskriver vi generasjonen av L. panamensis og L. donovani-stammer med konstitutivt uttrykk for genet som koder for et forbedret grønt fluorescerende protein (eGFP) integrert i stedet som koder for 18S rRNA (ssu). Genet som koder for eGFP ble oppnådd fra en kommersiell vektor og forsterket ved polymerasekjedereaksjon (PCR) for å berike den og legge til restriksjonssteder for BglII og KpnI enzymer. EGFP-amplikonen ble isolert ved agarosegelrensing, fordøyd med enzymene BglII og KpnI, og ligert inn i Leishmania-ekspresjonsvektoren pLEXSY-sat2.1 som tidligere ble fordøyd med samme sett med enzymer. Ekspresjonsvektoren med det klonede genet ble forplantet i E. coli, renset, og tilstedeværelsen av innsatsen ble verifisert ved koloni-PCR. Det rensede plasmidet ble linearisert og brukt til å transfektere L. donovani og L . panamensis parasitter. Integrasjonen av genet ble verifisert ved PCR. Ekspresjonen av eGFP-genet ble evaluert ved flowcytometri. Fluorescerende parasitter ble klonet ved å begrense fortynning, og kloner med høyest fluorescensintensitet ble valgt ved hjelp av flowcytometri.
Introduction
Protozoan parasitter av slekten Leishmania forårsaker leishmaniasis, en sykdom med et bredt spekter av kliniske manifestasjoner. Denne sykdommen er utbredt i 98 land, og den årlige forekomsten er estimert til 0,9 til 1,6 millioner tilfeller1. Leishmania-arter som er patogene for mennesker er delt inn i to underslekter, nemlig L. (Leishmania) og L. (Viannia). Infeksjon med noen arter som tilhører L. (Leishmania) underslekt, som L. donovani og L. infantum, kan resultere i visceral leishmaniasis (VL), som er dødelig hvis den ikke behandles2. Arter som tilhører L. (Viannia) underslekt er assosiert med de fleste tilfeller av kutan leishmaniasis (CL) og mukokutan leishmaniasis (MCL) i Sentral- og Sør-Amerika, spesielt i Panama, Colombia og Costa Rica, med L. panamensis som det viktigste etiologiske middelet for disse kliniske presentasjonene 3,4.
Eksisterende anti-leishmania kjemoterapi som inkluderer stoffer som pentavalente antimonialer, miltefosin og amfotericin B er svært giftig og dyrt. Videre har økt legemiddelresistens de siste tiårene blitt lagt til faktorene som forstyrrer effektiv behandling av pasienter over hele verden5. Det er påvist betydelige forskjeller mellom artene i slekten Leishmania i forhold til legemiddelfølsomhet, spesielt mellom arter i den nye og den gamle verden 6,7. Av disse grunner er det nødvendig å rette innsatsen mot identifisering og utvikling av nye anti-leishmania-legemidler, med spesiell oppmerksomhet på artsspesifikke tilnærminger. Det er ganske vanskelig å studere store biblioteker av legemiddelkandidater med tradisjonelle metoder, gitt at disse metodene er svært arbeidskrevende for å evaluere aktiviteten til forbindelser mot intracellulære amastigoter eller for å utføre in vivo-eksperimenter 8; Derfor har det vært nødvendig å utvikle nye teknikker som reduserer disse ulempene, inkludert implementering av reportergener og utvikling av fenotypiske screeninganalyser med høyt innhold9.
Bruken av reportergener har vist potensialet til å øke effektiviteten av narkotikascreeningsprosessen, da det letter utviklingen av høy gjennomstrømning og in vivo-analyser. Rekombinante Leishmania-parasitter som uttrykker flere reportergener har blitt generert av ulike forskningsgrupper. Reportergener, som β-galaktosidase, β-laktamase og luciferase, har blitt introdusert i flere Leishmania-arter ved hjelp av episomale vektorer, og viser begrenset nytte for legemiddelscreening i ekstra- og intracellulære former av parasitten 10,11,12,13,14,15. Disse tilnærmingene har begrensningen av å kreve et sterkt selektivt trykk i kultur for å unngå eliminering av den episomale konstruksjonen, samt bruk av ytterligere reagenser for å avsløre aktiviteten til reportergenet. Omvendt har det grønne fluorescerende proteinet (GFP) og dets variant, det forbedrede grønne fluorescerende proteinet (eGFP), blitt brukt i genereringen av et stort antall transgene Leishmania-stammer for in vitro legemiddelscreeningsanalyser på grunn av deres fleksibilitet og følsomhet, samt muligheten for å automatisere screeningprosessen ved bruk av flowcytometri eller fluorometri15, 16,17,18,19. Til tross for lovende resultater var kulturer av disse transgene stammene svært heterogene i deres fluorescensnivåer, siden antall kopier av GFP-genet ikke var det samme i alle parasittene. Videre krevde opprettholdelse av fluorescens konstant selektivt trykk på parasittene i kultur, siden GFP-genet ble introdusert i en episomal konstruksjon.
Av de grunner som er nevnt tidligere, har mange anstrengelser fokusert på å utvikle nye metoder for å produsere stabile rekombinante stammer. Disse anstrengelsene har for det meste stått på integrering av reportergener i ribosomale loci, og utnyttet de høyere transkripsjonsratene av ribosomale gener20. Stammer av L. infantum og L. amazonensis har blitt generert etter å ha integrert genene som koder for β-galaktocidase 21, IFP 1.4, iRFP22 og tdTomato23, og de har blitt evaluert for deres nytte i legemiddelscreeningsanalyser. Ulike grupper har utviklet L. donovani-stammer som uttrykker GFP konstitutivt ved å integrere kodegenet i 18S ribosomalt RNA-lokus (ssu locus) gjennom homolog rekombinasjon24,25; de viste stabilt og homogent GFP-uttrykk i den transfekterte populasjonen, inkludert intracellulære amastigoter 24,25, og de ble vellykket implementert i legemiddelscreeningsanalyser24,25,26. Bolhassani et al.27 utviklet stammer av L. major og L. infantum som uttrykker GFP som et integrert transgen. De brukte integrasjonsvektoren pLEXSY, opprinnelig designet for transgen ekspresjon av proteiner i et system med L. tarentolae som vert28. pLEXSY-GFP-vektoren har vist seg å være svært effektiv for generering av forskjellige Leishmania-stammer som konstitutivt uttrykker GFP 24,25,27,29,30. I disse parasittene er fluorescens homogen og opprettholdes i de intracellulære formene, og kan detekteres i fotputeskader av infiserte mus27.
I dette arbeidet beskriver vi metodikken som brukes for å generere L. panamensis og L . donovani-stammer som uttrykker genet som koder for eGFP som et integrert transgen ved hjelp av pLEXSY-systemet. Stammene som genereres gjennom denne prosessen, brukes i laboratoriet vårt for å utføre screeninganalyser som evaluerer den potensielle anti-leishmania-aktiviteten til molekyler av naturlig og syntetisk opprinnelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For å holde prøvene sterile, bør alle trinn som involverer parasittkultur utføres inne i en hette på biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2) eller i henhold til lokale helse- og sikkerhetsforskrifter. Et grafisk sammendrag av denne protokollen finnes i figur 1.
Figur 1: Sammendragsskjema for protokollen for generering av eGFP-uttrykkende L. panamensis og L. donovani-parasitter ved bruk av vektorfamilien pLEXSY-2.1. Alle de seks hovedavsnittene som er beskrevet i artikkelen er avbildet her. 1) Amplifisering og innsetting av eGFP-genet i pLEXSY-2.1-vektoren: målgenet forsterkes, og legger til anerkjennelsesstedene for enzymene KpnI og BglII, og både eGFP-amplikon og pLEXSY-plasmid fordøyes sekvensielt med begge enzymer for påfølgende ligering med T4-ligase. 2) Linearisering av pLEXSY-uttrykksplasmidet: pLEXSY + eGFP-konstruksjonen fordøyes med SwaI for linearisering og rensing av 7-8 kbp-uttrykkskassetten. 3) Transfeksjon og 4) polyklonalt utvalg: Leishmania-promastigoter transfeksjoneres med uttrykkskassetten ved elektroporering og settes tilbake i kultur for antibiotikavalg av rekombinante parasitter. Parasittfluorescens bekreftes gjennom flowcytometri. 5) Bekreftelse av genomisk integrasjon og 6) kloning ved å begrense fortynning: integrasjon av pLEXSY-eGFP-ekspresjonskassetten bekreftes ved diagnostisk PCR, ved bruk av en fremoverprimer som hybridiserer til uttrykkskassetten og en omvendt primer hybridiserer til en kromosomsekvens som er fraværende i uttrykkskassetten. Transfekterte kulturer kan berikes for fluorescerende parasitter ved kloning ved å begrense fortynning, og kloner med de høyeste gjennomsnittlige fluorescerende intensitetene kan velges for videre anvendelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
1. Forsterkning og innsetting av eGFP-genet i pLEXSY-2.1-vektoren
- Amplifisering av eGFP-genet
MERK: Siden denne protokollen bruker vektorfamilien pLEXSY-2.1 (se materialfortegnelse) for det konstitutive uttrykket av målproteiner etter integrering av ekspresjonskassetten i det kromosomale 18S rRNA-lokuset (ssu) av Leishmania-arter , er det første trinnet å introdusere i eGFP-genet sekvensene som inneholder restriksjonsstedene som tillater innsetting i pLEXSY-2.1-vektorer. I dette tilfellet, da eGFP bare kreves å uttrykkes cytosolisk, ble restriksjonsstedene for enzymene BglII og KpnI tilsatt i henholdsvis 5' og 3' endene av eGFP-genet. Kloning med KpnI resulterer i fusjon av målproteinet til en C-terminal polyhistidin-tag på seks rester, etterfulgt av et stoppkodon kodet i pLEXSY-2.1-plasmidet for ytterligere rensing av proteinet av interesse. Av denne grunn inneholder den omvendte primersekvensen ikke et stoppkodon.- Avhengig av plasmidkilden for eGFP, analyser målsekvensen ved hjelp av et restriksjonsanalyseverktøy som NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3) 31 for å sikre at den ikke inneholder interne steder for restriksjonsenzymene som brukes til kloning (BglII og KpnI) eller for Swa I, som er enzymetsom brukes til vektorlinearisering før transfeksjon.
- Design forover- og bakoverprimere for eGFP-forsterkning som inneholder restriksjonssekvensene BglII og KpnI. Som et eksempel var eGFP-kilden for denne protokollen pEGFP-N1-1X plasmid32, og primersekvensene var de som ble rapportert av Bolhassani et al.27:
Forward primer (EGFP1): 5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3' (BglII restriksjonssted i fet skrift).
Omvendt primer (EGFP2): 5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3' (KpnI begrensningssted i fet skrift). - Amplifisere målgenet ved hjelp av en hi-fidelity-polymerase for å sikre bevaring av kodingssekvensen. Som et eksempel, for primerne EGFP1 og EGFP2, kjør PCR-sykkelprotokollen som rapportert av Bolhassani et al.27. Kjør en innledende denaturering på 2 minutter ved 94 °C, etterfulgt av 30 sykluser på 30 s ved 94 °C, 30 s ved 57 °C og 1 min ved 72 °C. Kjør et siste forlengelsestrinn på 10 minutter ved 72 °C. Tilsett primerne ved en endelig konsentrasjon på 0,2 μM.
- Rens fragmentet ved hjelp av et konvensjonelt PCR-produktrensingssett, eller standard natriumacetat og etanolutfelling, som beskrevet andre steder33.
- Innsetting av eGFP i pLEXSY-2.1 ekspresjonsvektoren
- Trim endene av eGFP-PCR-produktet ved hjelp av BglII og KpnI, i henhold til produsentens instruksjoner.
- Først setter du opp reaksjonen for enzymet som krever den laveste saltkonsentrasjonen (i dette tilfellet KpnI), i henhold til produsentens instruksjoner, og inkuberer ved 37 ° C i 1 time.
- Deretter legger du til 100 mM NaCl og 10 enheter BglII og inkuberer i 15 minutter. Rens reaksjonen, som beskrevet i trinn 1.1.4.
- Fordøy pLEXSY-ekspresjonsvektoren med BglII og KpnI, etter den sekvensielle fordøyelsesprotokollen beskrevet i trinn 1.2.1.
- Liger pLEXSY-vektoren og eGFP-genet med T4-ligase ved å bruke et molforhold på 1:3 (vektor:insert). Tilsett kort 100 ng fordøyd pLEXSY og 28 ng fordøyd eGFP-produkt til en 20 μL-reaksjon inneholdende ligasebuffer ved en endelig konsentrasjon på 1x og 3 enheter T4 DNA-ligase. Inkuber over natten ved 4 °C.
- Transformer kompetente E. coli-celler , slik som XL-10, DH5a eller DH10B, med ligeringsproduktet oppnådd i trinn 1.2.3 ved bruk av standard transformasjonsprotokoller33. Plate de transformerte cellene i Luira-Bertani (LB)-ampicillinagaren og inkuber i 24 timer ved 30 °C for å velge rekombinante kloner (pLEXSY-plasmider er mer stabile i E. coli ved 30 °C enn ved 37 °C).
- Skjerm for tilstedeværelse av innsatsen i plasmidene ved koloni-PCR.
- Velg individuelle kolonier, resuspender i 20 μL nukleasefritt vann, varme opp ved 95 °C i 15 minutter, og ta 1 μL av lysatet som DNA-mal for koloni-PCR. Bruk den fremre primeren for eGFP-forsterkning, beskrevet i trinn 1.1.2 (i dette eksemplet EGFP1), og primeren A264 (5'-CATCTATAGAGAAGTACGTAAAAG-3') som en omvendt primer29.
- Primeren A264 er designet til anneal 80 bp etter stoppkodonet til innsatsen i pLEXSY-2.1 ekspresjonsvektorer. Som et eksempel, for primerparet EGFP1 + A264, bruk en PCR-sykkelprotokoll som består av en innledende denaturering på 2 minutter ved 94 ° C, etterfulgt av 30 sykluser på 30 s ved 94 ° C, 30 s ved 50 ° C og 1 min ved 72 ° C. Kjør et siste forlengelsestrinn på 10 minutter ved 72 °C. Primerne tilsettes ved en endelig konsentrasjon på 0,2 μM.
MERK: Det forventede produktet som bruker dette primersettet er 859 bp langt. Glødningsstedene for primerne EGFP1 og A264 er avbildet i figur 2.
- Forbered det rensede plasmid-DNA fra en positiv klon for påfølgende transfeksjon ved hjelp av et kommersielt plasmidisolasjonssett eller standard alkalisk utfelling33. Bruk 50 ml dyrkning over natten ved 30 °C for isolering av minimum 10 μg plasmid/positiv klon.
- Trim endene av eGFP-PCR-produktet ved hjelp av BglII og KpnI, i henhold til produsentens instruksjoner.
2. Linearisering av pLEXSY-uttrykksplasmidet
- Bruk minst 10 μg av det rensede pLEXSY-eGFP-plasmidet for fordøyelsen med SwaI (gjenkjenningssted: 5'-ATTTAAAT-3'). Stek i 3-4 timer ved 25 °C og deaktiver ved 65 °C i 20 minutter.
- Kjør fordøyelsesproduktet i agarosegelelektroforese for å skille de resulterende fragmentene. Denne fordøyelsen vil generere to fragmenter, et 2,9 kbp-fragment som representerer elementene som er nødvendige for replikasjon og utvelgelse i E. coli, og et 7-8 kbp-fragment som representerer den lineariserte uttrykkskassetten.
- Rens uttrykkskassetten ved hjelp av et kommersielt agarosegelekstraksjonssett.
3. Transfeksjon av L. panamensis og L. donovani ved elektroporering
MERK: Leishmaniakulturen utføres som beskrevet andre steder34. I dette eksemplet ble L. panamensis og L . donovani promastigoter dyrket i Schneiders insektmedium, supplert med 20% (v/v) føtal bovint serum (FBS) og 50 μg/ml gentamicin, og inkubert ved 26 °C.
- Dyrk parasittkulturene til det er nok logfase eller tidlig stasjonære fasepromastigoter til å bruke ca. 4 x 107 parasitter per transfeksjon. Maksimal celletetthet per dyrkningskolbe før den stasjonære fasen når kan variere avhengig av Leishmania-artene og hvor godt stammene er tilpasset laboratorieforholdene. Samle innholdet i flere kulturflasker om nødvendig.
- Sentrifuger parasittkulturen ved 2000 x g i 3 minutter ved romtemperatur (RT).
- Resuspender pelleten i elektroporeringsbuffer ved 4 °C (21 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na2HPO4 og 6 mM glukose; pH 7,5)27 for å få en konsentrasjon på 1 x 108 parasitter/ml. Legg på is i 10 min.
MERK: Elektroporeringsbufferen må steriliseres ved filtrering før bruk. - Parallelt konstruerer forkjølingsrør med 2-10 μg linearisert pLEXSY-eGFP i et maksimalt volum på 50 μL vann eller 10 mM trisbuffer (pH 8,0) og elektroporasjonskyvetter på d = 2 mm.
- Tilsett 350 μL forkjølte parasitter til røret med det lineariserte plasmidet og overfør hele 400 μL til elektroporasjonskyvetten på is. Parallelt elektroporerer parasittcellene uten plasmid-DNA som en negativ kontroll.
- Elektroporer ved hjelp av en av disse to protokollene:
Eksponentielt henfall: 450 V, 450 μF, en puls.
Tidskonstant: 450 V, T = 3,5 ms, en puls.
MERK: Disse protokollene ble kjørt ved hjelp av en kommersiell genpulser (Table of Materials) med PC- og CE-moduler. - Legg kyvetten tilbake på is i 10 minutter og overfør de elektroporerte parasittene til 5 ml av det aktuelle dyrkningsmediet. Dette eksemplet brukte Schneiders insektmedium supplert med 20% (v / v) FBS. Inkuber ved 26 °C i 20 timer.
4. Polyklonalt utvalg i kultur
- Omtrent 20 timer etter elektroporering, observer kulturen under et mikroskop. Minst halvparten av parasittpopulasjonen bør vise visuelt god morfologi og motilitet (dråpelignende promastigoter med oscillerende flagellum som beveger seg gjennom media og/eller danner aktive parasittaggregater). Legg til passende selektivt antibiotika avhengig av pLEXSY-plasmidet som brukes. I dette eksemplet brukes pLEXSY-sat2.1, som inneholder streptothricinacetyltransferase som en seleksjonsmarkør. Bruk derfor nourseothricin som et selektivt antibiotikum i en konsentrasjon på 0,1 mg/ml.
- Følg kulturene mikroskopisk til en klar forskjell mellom parasittene elektroporert med og uten plasmid-DNA er sett.
- Bekreft parasittens fluorescens gjennom flowcytometri.
- Sentrifuge 1 ml av den stasjonære fasekulturen ved 2000 x g i 3 minutter ved RT. Vask to ganger i PBS og resuspender den endelige pelleten i 1 ml PBS.
MERK: Fluorescensen av eGFP kan detekteres i FL1-kanalen til de fleste kommersielle cytometre. Forsterkningsinnstillinger for forover- og sidespredning, og FL1-kanalen kan variere mellom cytometre. For dette eksemplet ble et CyFlow-rom (Sysmex) cytometer brukt. - Kjør prøvene, samle inn 20 000 hendelser med en hastighet på 0,5 μL/s, og angi forsterkningsverdiene for fremoverspredningskanalene (FSC), sidespredning (SSC) og fluorescens 1 (FL-1) som henholdsvis 225,0, 200,0 og 520,0. Kjør en kontrollprøve med ikke-fluorescerende parasitter for å bestemme parasittpopulasjonen i et FSC versus SSC dot-plot.
- Opprett en port (G1) som inneholder parasittpopulasjonen og filtrer FL-1-kanalen gjennom den porten for å bestemme autofluorescensen til promastigoter og sette en rekkeviddeport (G2) for FL-1-kanalen.
- Kjør de transfektede parasittene for å verifisere om det er fluorescens. Registrer prosentandelen parasitter i G1 som er fluorescerende og gjennomsnittet av fluorescensintensitet i G2.
- Sentrifuge 1 ml av den stasjonære fasekulturen ved 2000 x g i 3 minutter ved RT. Vask to ganger i PBS og resuspender den endelige pelleten i 1 ml PBS.
5. Bekreftelse av genomisk integrasjon
MERK: Integrasjon av pLEXSY-eGFP-ekspresjonskassetten kan bekreftes ved diagnostisk PCR, ved hjelp av en fremoverprimer som hybridiserer til uttrykkskassetten (varierer avhengig av pLEXSY-2.1-vektoren som brukes) og omvendt primer F3002 (5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3') hybridisering til en kromosomal ssu-flankerende sekvens fraværende i uttrykkskassetten. I dette eksemplet brukes F2999 forward primer (5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3') som hybridiserer i pLEXSY-sat2.1 uttrykkskassetten. En skjematisk fremstilling av integrert uttrykkskassett og primerglødningssteder for diagnostisk PCR er vist i figur 2.
- Rens det genomiske DNA fra 2-5 ml av en stasjonær fase parasittkultur ved konvensjonell fenol / kloroformekstraksjon35 eller med et kommersielt sett.
- Utfør diagnostisk PCR for pLEXSY-sat2.1 ved hjelp av en sykkelprotokoll som består av en innledende denaturering på 2 minutter ved 94 °C, etterfulgt av 30 sykluser på 30 s ved 94 °C, 30 s ved 53 °C og 1 minutt ved 72 °C. Kjør et siste forlengelsestrinn på 10 minutter ved 72 °C. Primerne tilsettes ved en endelig konsentrasjon på 0,2 μM.
Figur 2: Skjematisk fremstilling av den integrerte uttrykkskassetten. Bokser merket som Chr-S (grå) representerer de tilstøtende kromosomale sekvensene av 18S rRNA-lokuset (ssu) som uttrykkskassetten er integrert i. Den integrerte ekspresjonskassetten består av 5' og 3' sekvenser (blå) for homolog rekombinasjon i ssu-lokuset , en ekstra Leishmania ribosomal promoter (rød) for forbedret proteinproduksjon, eGFP-genet (grønn), et seleksjonsmarkørgen (gul) og tre uoversatte regioner (lysegrå), nemlig utr1, 2 og 3, som gir spleissignalene for posttranskripsjonell mRNA-prosessering for optimalisert ekspresjon av eGFP og seleksjonsmarkøren i Leishmania-parasitter . Glødningssteder for forover- og reversprimere som brukes til verifisering av innsatstilstedeværelsen ved koloni-PCR (trinn 1.2.5) er markert med de svarte pilene merket som henholdsvis CPCR-fwd (EGFP1-primer) og CPCR-rev (A264-primer), som avgrenser et 859 bp-produkt. Glødningsstedene for forover- og reversprimere som brukes til verifisering av genomisk integrasjon ved diagnostisk PCR (trinn 5) er markert med de svarte pilene merket som henholdsvis sat-fwd (F2999 primer) og ssu-rev (F3002 primer), som avgrenser et 2,271 bp-produkt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
6. Kloning ved å begrense fortynning (valgfritt)
- Etter bekreftelse av fluorescens gjennom flowcytometri, forbered en fortynning av rekombinante parasitter i en konsentrasjon på fem promastigoter / ml36.
- Tilsett 100 μL av denne fortynningen i hver brønn i en 96-brønnsplate. På denne måten blir platene sådd med en gjennomsnittlig tetthet på 0,5 promastigoter/brønn, noe som sikrer at noen brønner får en enkelt parasitt samtidig som sannsynligheten for å ha mer enn én parasitt per brønn36 minimeres.
- La platen stå uforstyrret i minst 12 timer. Følg platen mikroskopisk ved en minimumsforstørrelse på 100x til brønner med parasittvekst oppdages.
- Når en platebrønn er full av parasitter, bruk innholdet til å inokulere en 5 ml kultur. Dette tar 1-2 uker.
- Når klonefrøkulturer når den stasjonære fasen, må fluorescens verifiseres ved hjelp av flowcytometri, som beskrevet i trinn 4.3. Velg klonene som skal brukes til ytterligere in vitro og in vivo analyser basert på prosentandelen fluorescerende parasitter og gjennomsnittlig fluorescensintensitet målt i FL-1-kanalen. Sikt på kloner med 98% -99% av fluorescerende parasitter og velg de med høyest gjennomsnittlig fluorescensintensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter å ha bygget pLEXSY-eGFP-konstruksjonen og transformert kompetente E. coli-celler, vil kolonier som inneholder konstruksjonen med eGFP-innsatsen generere et ca. 859 bp-produkt etter å ha kjørt koloni-PCR beskrevet i avsnitt 1.2 (figur 3A). Total fordøyelse av det rensede plasmidet fra positive kolonier ved bruk av SwaI skal gi to karakteristiske fragmenter i gelelektroforese, et 2,9 kbp-fragment som er den delen av PLEXSY-vektoren som inneholder alle nødvendige elementer for replikasjon og seleksjon i E. coli, og et 7-8 kpb-fragment som representerer den lineariserte uttrykkskassetten som brukes til transfeksjon (figur 3B).
Etter transfeksjon gjøres det polyklonale utvalget hovedsakelig kvalitativt. Statusen til parasittkulturer under utvelgelse med antibiotika overvåkes mikroskopisk, med spesiell oppmerksomhet på parasittens morfologi og motilitet. Etter vellykket gjenoppretting av en kultur av transfektede parasitter, bør de som effektivt uttrykker eGFP detekteres i FL-1-kanalen til et flowcytometer (figur 4A); transfeksjonseffektiviteten kan variere mellom forskjellige Leishmania-arter . I dette arbeidet, etter polyklonalt utvalg, var 98,44% av L. donovani-parasittene analysert ved flowcytometri fluorescerende sammenlignet med 82,00% av L. panamensis (figur 4B). Hvis pLEXSY-eGFP-ekspresjonskassetten har blitt integrert i ssu-lokuset , bør et produkt på 2,3 kbp observeres etter å ha kjørt den diagnostiske PCR-en beskrevet i avsnitt 5 (figur 4C). Disse resultatene sikrer at rekombinante parasitter oppnås som konstitutivt uttrykker eGFP som et integrert transgen og vil forbli stabilt i etterfølgende passasjer av parasittkulturen.
Kloning ved å begrense fortynning tillater anrikning av den fluorescerende parasittpopulasjonen med lavere transfeksjonseffektivitet, slik som L. panamensis, samt valg av kloner med de høyeste fluorescensintensitetene. Fire kloner ble oppnådd for hver av Leishmania-artene som ble brukt i dette arbeidet (tabell 1), nemlig Lpan-A7, F11, F12 og H2 for L. panamensis, og Ldon-C1, G4, F2 og H1 for L. donovani. Kloner med høyest prosentandel fluorescerende parasitter (Lpan-F11 = 95, 74%; Ldon-C1 = 99,16 %) og gjennomsnittlig fluorescensintensitet (Lpan-F11 = 35,63 relative fluorescerende enheter [RFU]; Ldon-C1 = 14,12 RFU) ble valgt for videre bruk i screeninganalyser av legemidler.
Figur 3: Representative resultater av fremstilling av pLEXSY-eGFP-konstruksjonen for transfeksjon. (A) Representative resultater av kolonien PCR. Lane 1: 1 kb stige (enheter i basepar); baner 2, 10 og 12: negative prøver for tilstedeværelse av eGFP-innsatsen; banene 3-9 og 13-14: positive prøver for tilstedeværelsen av eGFP-innsatsen. (B) Resultater av linearisering med SwaI. Lane 1: 1 kb stige (enheter i basepar); baner 2-4: fordøyelsesreaksjoner av plasmider renset fra tre forskjellige kolonier positive for tilstedeværelsen av eGFP-innsatsen. Et 2,9 kbp-fragment som representerer elementene som er nødvendige for replikasjon og utvelgelse i E. coli, og et 7-8 kpb-fragment som representerer den lineariserte uttrykkskassetten observeres. Begge gelene ble fremstilt ved en agarosekonsentrasjon på 1%. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative resultater av bekreftelse av eGFP-uttrykk og kromosomal innsetting av ekspresjonskassetten . (A) Flowcytometrihistogram i FL-1-kanalen. Rød: villtypeceller uten eGFP; Blå: transfekterte L. panamensis-parasitter med 82,00% av befolkningen som uttrykker eGFP. (B) Sammenligning av transfeksjonsresultater mellom L. panamensis (Lpan-1) og L. donovani (Ldon-1). En høyere transfeksjonseffektivitet ble observert hos L. donovani (98,44 %) enn L. panamensis (82,00 %) etter polyklonal seleksjon. (C) Resultater av PCR for bekreftelse av genomisk integrasjon. L: 100 bp stige (enheter i basepar); felt 1-4: prøver fra fire forskjellige kloner av L. panamensis som viser et karakteristisk 2,3 kbp-produkt for pLEXSY-sat2.1-integrering i ssu-lokuset . Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Art | Klonkode | Prosentandel av fluorescerende parasitter | Gjennomsnittlig fluorescensintensitet* |
| L. panamensis | Lpan-A7 | 90.00 | 24.70 |
| Lpan-F11 | 95.74 | 35.63 | |
| Lpan-F12 | 92.85 | 34.44 | |
| Lpan-H2 | 85.00 | 20.66 | |
| L. Donovani | Ldon-C1 | 99.16 | 14.12 |
| Ldon-G4 | 99.21 | 13.96 | |
| Ldon-F2 | 97.96 | 11.67 | |
| Ldon-H1 | 98.97 | 12.90 |
Tabell 1: Kloner oppnådd ved å begrense fortynning. Fire kloner ble oppnådd ved å begrense fortynning for hver av Leishmania-artene som ble brukt i dette arbeidet. Prosentandel fluorescerende parasitter og gjennomsnittlig fluorescensintensitet er rapportert for hver klone. *Fluorescens uttrykkes i relative fluorescensenheter (RFU).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Fordeler og ulemper ved ulike reportergener har blitt studert hos flere protozoparasitter. Blant dem er GFP og eGFP iboende fluorescerende og tillater enkel kvantifisering og avbildning. Den fluorescerende aktiviteten til disse proteinene kan detekteres med minimal manipulering ved hjelp av fluorescensmikroskopi, fluorimetri eller flowcytometri. Få studier har blitt utført for å generere GFP-uttrykkende L. (Viannia) stammer, til tross for den demonstrerte robustheten til GFP og deres derivater som reportergener i Old World Leishmania-arter 15,16,18,24. Varela et al.37 utviklet L. panamensis-stammer som uttrykker GFP som et episomalt transgen. Flowcytometrianalyse av både akseniske promastigoter og intracellulære amastigoter viste nytten av disse parasittene for legemiddelscreeninganalyser. Imidlertid var fluorescens svært heterogen, og antall fluorescerende parasitter i den transfektede populasjonen var avhengig av konstant selektivt trykk med antibiotika tunicamycin. Disse fakta begrenser bruken av disse parasittene som intracellulære amastigoter for legemiddelscreeningsanalyser, gitt at tunicamycin ikke kan legges til infiserte makrofager38, og etterlater parasitter med lav fluorescens tilstede i populasjonen av intracellulære amastigoter som kan forstyrre kvantifiseringen av infiserte makrofager.
Bruken av vektorer som pLEXSY utgjør et kraftig og pålitelig verktøy for stabil modifikasjon av Leishmania-artsparasitter gjennom integrering av transgener ved hjelp av homolog rekombinasjon28. PLEXSY-kassetten er integrert i 18S rRNA-lokuset (ssu), hvis transkripsjon er under kontroll av RNA-polymerase I sterk promotor, noe som fører til høyere transkripsjonshastigheter20. Bruken av dette systemet har vist seg å tillate stabil og homogen ekspresjon av målproteinet27. Disse egenskapene favoriserer uttrykket av eGFP og dets bruk i intracellulære analyser med homogene nivåer av fluorescens i infiserte celler, samt dets bruk for eksperimentelle infeksjoner i murinmodeller. PLEXSY-2.1-vektorfamilien som brukes i denne protokollen er designet med en ekstra Leishmania ribosomal promotor foran uttrykkskassetten, som øker proteinproduksjonen 29,30.
I denne protokollen er det flere kritiske trinn for å oppnå optimale resultater. For det første bør kloning av målgenet utføres ved bruk av en high-fidelity polymerase33, og fordøyelse av mål-DNA og ekspresjonsvektor bør gjøres ved hjelp av en sekvensiell fordøyelsesprotokoll ved bruk av BglII / KpnI-kombinasjonen for kloning. Det siste skyldes at det ikke er noen buffer der både BglII og KpnI utviser optimal aktivitet, selv om begge enzymene er optimalt aktive ved samme temperatur (37 °C). For det andre bør seleksjon av rekombinante kloner etter transformasjon i E. coli utføres ved 30 °C, da pLEXSY-plasmider er mer stabile ved denne temperaturen i E. coli28,29. I tillegg kan vekstratene for L. panamensis og L. donavani være ganske forskjellige. Under utførelsen av forsøkene beskrevet i denne artikkelen tok L. panamensis vanligvis lengre tid å nå den stasjonære fasen. Vekstratene kan også variere fra stamme til belastning i forskjellige laboratorier; Derfor er det nødvendig å karakterisere vekstratene til laboratoriestammene for estimering av tiden som kreves for å nå parasittkonsentrasjonen som kreves for elektroporering. Bruk av bufferen rapportert av Bolhassani et al.27 for elektroporering er en viktig modifikasjon som øker overlevelsen av de elektroporerte parasittene betydelig sammenlignet med direkte elektroporering i et kulturmedium, som foreslått av den opprinnelige Jena Bioscience-protokollen. Under polyklonal seleksjon er det ekstremt viktig å ikke la de elektroporerte kulturer overgrow før du legger til det selektive antibiotika; Ellers vil ikke-rekombinante parasitter vokse ut de rekombinante27. Det vil ta en eller to påfølgende passasjer (1:10 inokulum) til friskt medium med passende antibiotika for å få en uklar kultur av antibiotikaresistente rekombinante parasitter og en klar negativ kontroll. Passasjer bør gjøres innen 5 dager etter den første antibiotikatilsetningen. Til slutt er det spesielt forskjeller i effektiviteten av transfeksjon og integrering av pLEXSY-uttrykkskassetten mellom L. panamensis og L. donovani24,37. Mens i L. donovani nesten 98% av den totale befolkningen analysert gjennom flowcytometri etter polyklonal seleksjon viser fluorescens, i L. panamesis, er prosentandelen fluorescerende parasitter rundt 80%. Av denne grunn er det valgfrie trinnet med kloning ved å begrense fortynning en modifikasjon som hovedsakelig kreves for å oppnå en L. panamensis-populasjon hvor mer enn 95% av parasittene analysert gjennom flowcytometri er fluorescerende. Bruken av pLEXSY-plasmider er begrenset til genomisk modifisering av Leishmania-arter, da de opprinnelig ble designet for å bruke L. tarentolae som proteinproduksjonsplattformer28. Selv om pLEXSY har vist seg å fungere i flere Leishmania-arter som er forskjellige fra L. tarentolae21,24,27, er det viktig å verifisere bevaringen av ssu-sekvensen når du arbeider med en ny Leishmania-art for å sikre at rekombinasjonssteder i pLEXSY-plasmidet vil fungere.
Metoden beskrevet i denne artikkelen tillater produksjon av rekombinante Leishmania-parasitter med et konstitutivt og stabilt uttrykk for eGFP eller annen reporter av interesse. I disse parasittene er fluorescens homogen, og den opprettholdes i intracellulære former. Derfor kan stammer generert gjennom denne prosessen brukes til standardisering av narkotikascreeningsanalyser med høy gjennomstrømning for å evaluere den potensielle anti-leishmania-aktiviteten til molekyler av naturlig og syntetisk opprinnelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av Secretaría Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación (SENACYT), Panamá, stipendnummer NI-177-2016, og Sistema Nacional de Investigación (SNI), Panamá, tilskuddsnummer SNI-169-2018, SNI-008-2022 og SNI-060-2022.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Microplates | Corning | CLS3340 | Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, suitable for cell culture |
| BglII restriction enzyme | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Cell Culture Flasks | Corning | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | Not available | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Gel Loading Buffer | Sigma-Aldrich | G2526 | The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading. |
| Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber. |
| Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Inverted microscope | Olympus | IXplore Standard | |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3142S | 4,000 units. 20,000 units/mL |
| LB Broth with agar | Sigma-Aldrich | L3147 | Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture. |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L2542 | Liquid microbial growth medium |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad | 1640300 | Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray |
| pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence |
| pLEXSYcon2.1 expression kit | Jena Bioscience | EGE-1310sat | Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing. |
| Potassium Chloride | Millipore | 529552 | Molecular Biology Grade - CAS 7447-40-7 - Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures. |
| Schneider′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | Medium used in our laboratory for culturing Leishmania. |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration) |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri |
| SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Syringe filters | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9285 | |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA. |
References
- Alvar, J., et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One. 7 (5), e35671 (2012).
- Franssen, S. U., et al. Global genome diversity of the Leishmania donovani complex. eLife. 9, e51243 (2020).
- Saldaña, A., et al. Clinical cutaneous leishmaniasis rates are associated with household Lutzomyia gomezi, Lu. Panamensis, and Lu. trapidoi abundance in Trinidad de Las Minas, western Panama. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 88 (3), 572-574 (2013).
- Ramírez, J. D., et al. Taxonomy, diversity, temporal and geographical distribution of Cutaneous Leishmaniasis in Colombia: A retrospective study. Scientific Reports. 6, 28266 (2016).
- Ponte-Sucre, A., et al. Drug resistance and treatment failure in leishmaniasis: A 21st century challenge. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (12), e0006052 (2017).
- Croft, S. L., Seifert, K., Yardley, V. Current scenario of drug development for leishmaniasis. Indian Journal of Medical Research. 123 (3), 399-410 (2006).
- Croft, S. L., Yardley, V., Kendrick, H. Drug sensitivity of Leishmania species: some unresolved problems. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 96, S127-S129 (2002).
- Sereno, D., Cordeiro da Silva, A., Mathieu-Daude, F., Ouaissi, A. Advances and perspectives in Leishmania cell based drug-screening procedures. Parasitology International. 56 (1), 3-7 (2007).
- Don, R., Ioset, J. R. Screening strategies to identify new chemical diversity for drug development to treat kinetoplastid infections. Parasitology. 141 (1), 140-146 (2014).
- Sereno, D., Roy, G., Lemesre, J. L., Papadopoulou, B., Ouellette, M. DNA transformation of Leishmania infantum axenic amastigotes and their use in drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1168-1173 (2001).
- Roy, G., et al. Episomal and stable expression of the luciferase reporter gene for quantifying Leishmania spp. infections in macrophages and in animal models. Molecular and Biochemical Parasitology. 110 (2), 195-206 (2000).
- Lang, T., Goyard, S., Lebastard, M., Milon, G. Bioluminescent Leishmania expressing luciferase for rapid and high throughput screening of drugs acting on amastigote-harbouring macrophages and for quantitative real-time monitoring of parasitism features in living mice. Cellular Microbiology. 7 (3), 383-392 (2005).
- Ashutosh, G. S., Ramesh, S. S., Goyal, N. Use of Leishmania donovani field isolates expressing the luciferase reporter gene in in vitro drug screening. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 49 (9), 3776-3783 (2005).
- Buckner, F. S., Wilson, A. J. Colorimetric assay for screening compounds against Leishmania amastigotes grown in macrophages. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 72 (5), 600-605 (2005).
- Okuno, T., Goto, Y., Matsumoto, Y., Otsuka, H., Matsumoto, Y. Applications of recombinant Leishmania amazonensis expressing egfp or the beta-galactosidase gene for drug screening and histopathological analysis. Experimental Animals. 52 (2), 109-118 (2003).
- Kamau, S. W., Grimm, F., Hehl, A. B. Expression of green fluorescent protein as a marker for effects of antileishmanial compounds in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (12), 3654-3656 (2001).
- Singh, N., Dube, A. Short report: fluorescent Leishmania: application to anti-leishmanial drug testing. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 71 (4), 400-402 (2004).
- Dube, A., Singh, N., Sundar, S., Singh, N. Refractoriness to the treatment of sodium stibogluconate in Indian kala-azar field isolates persist in in vitro and in vivo experimental models. Parasitology Research. 96 (4), 216-223 (2005).
- Chan, M. M. Y., Bulinski, J. C., Chang, K. P., Fong, D. A microplate assay for Leishmania amazonensis promastigotes expressing multimeric green fluorescent protein. Parasitology Research. 89 (4), 266-271 (2003).
- Boucher, N., McNicoll, F., Dumas, C., Papadopoulou, B. RNA polymerase I-mediated transcription of a reporter gene integrated into different loci of Leishmania. Molecular and Biochemical Parasitology. 119 (1), 153-158 (2002).
- da Silva Santos, A. C., Moura, D. M. N., dos Santos, T. A. R., de Melo Neto, O. P., Pereira, V. R. A. Assessment of Leishmania cell lines expressing high levels of beta-galactosidase as alternative tools for the evaluation of anti-leishmanial drug activity. Journal of Microbiological Methods. 166, 105732 (2019).
- Calvo-Álvarez, E., et al. Infrared fluorescent imaging as a potent tool for in vitro, ex vivo and in vivo models of visceral leishmaniasis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003666 (2015).
- García-Bustos, M. F., et al. Development of a fluorescent assay to search new drugs using stable tdtomato-leishmania, and the selection of galangin as a candidate with anti-leishmanial activity. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 666746 (2021).
- Singh, N., Gupta, R., Jaiswal, A. K., Sundar, S., Dube, A. Transgenic Leishmania donovani clinical isolates expressing green fluorescent protein constitutively for rapid and reliable ex vivo drug screening. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 64 (2), 370-374 (2009).
- De Rycker, M., et al. Comparison of a high-throughput high-content intracellular Leishmania donovani assay with an axenic amastigote assay. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (7), 2913-2922 (2013).
- Peña, I., et al. New compound sets identified from high throughput phenotypic screening against three kinetoplastid parasites: an open resource. Scientific Reports. 5, 8771 (2015).
- Bolhassani, A., et al. Fluorescent Leishmania species: development of stable GFP expression and its application for in vitro and in vivo studies. Experimental Parasitology. 127 (3), 637-645 (2011).
- Breitling, R., et al. Non-pathogenic trypanosomatid protozoa as a platform for protein research and production. Protein Expression and Purification. 25 (2), 209-218 (2002).
- Pulido, S. A., et al. Improvement of the green fluorescent protein reporter system in Leishmania spp. for the in vitro and in vivo screening of antileishmanial drugs. Acta Tropica. 122 (1), 36-45 (2012).
- Bastos, M. S. E., et al. Achievement of constitutive fluorescent pLEXSY-egfp Leishmania braziliensis and its application as an alternative method for drug screening in vitro. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 112 (2), 155-159 (2017).
- Vincze, T., Posfai, J., Roberts, R. J. NEBcutter: A program to cleave DNA with restriction enzymes. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3688-3691 (2003).
- Chen, M., et al. A molecular beacon-based approach for live-cell imaging of RNA transcripts with minimal target engineering at the single-molecule level. Scientific Reports. 7 (1), 1550 (2017).
- Green, M., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Fourth Edition. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Santarém, N., et al. The impact of distinct culture media in Leishmania infantum biology and infectivity. Parasitology. 141 (2), 192-205 (2014).
- Medina-Acosta, E., Cross, G. A. Rapid isolation of DNA from trypanosomatid protozoa using a simple "mini-prep" procedure. Molecular and Biochemical Parasitology. 59 (2), 327-329 (1993).
- Ye, M., Wilhelm, M., Gentschev, I., Szalay, A. A modified limiting dilution method for monoclonal stable cell line selection using a real-time fluorescence imaging system: a practical workflow and advanced applications. Methods and Protocols. 4 (1), 16 (2021).
- Varela, M. R. E., et al. Leishmania (Viannia) panamensis: an in vitro assay using the expression of GFP for screening of antileishmanial drug. Experimental Parasitology. 122 (2), 134-139 (2009).
- Komura, T., et al. ER stress induced impaired TLR signaling and macrophage differentiation of human monocytes. Cellular Immunology. 282 (1), 44-52 (2013).
