Summary
Aqui, descrevemos a metodologia usada para gerar cepas de L. panamensis e L . donovani expressando o gene para eGFP como um transgene integrado estável usando o sistema pLEXSY. Os parasitas transfectados foram clonados por diluição limitante, e os clones com maior intensidade de fluorescência em ambas as espécies foram selecionados para uso posterior em ensaios de triagem de drogas.
Abstract
Protozoários parasitas do gênero Leishmania causam leishmaniose , doença com manifestações clínicas variáveis que afeta milhões de pessoas em todo o mundo. A infecção por L. donovani pode resultar em doença visceral fatal. No Panamá, Colômbia e Costa Rica, L. panamensis é responsável pela maioria dos casos relatados de leishmaniose cutânea e mucocutânea. Estudar um grande número de candidatos a fármacos com as metodologias disponíveis até o momento é bastante difícil, uma vez que são muito trabalhosos para avaliar a atividade de compostos contra formas intracelulares do parasita ou para realizar ensaios in vivo . Neste trabalho, descrevemos a geração de cepas de L. panamensis e L. donovani com expressão constitutiva do gene que codifica para uma proteína fluorescente verde reforçada (eGFP) integrada ao locus que codifica para o 18S rRNA (ssu). O gene que codifica a eGFP foi obtido a partir de um vetor comercial e amplificado por reação em cadeia da polimerase (PCR) para enriquecê-lo e adicionar sítios de restrição para as enzimas BglII e KpnI. O amplicon da eGFP foi isolado por purificação em gel de agarose, digerido com as enzimas BglII e KpnI e ligado ao vetor de expressão de Leishmania pLEXSY-sat2.1 previamente digerido com o mesmo conjunto de enzimas. O vetor de expressão com o gene clonado foi propagado em E. coli, purificado, e a presença da inserção foi verificada por PCR de colônia. O plasmídeo purificado foi linearizado e utilizado para transfectar os parasitas L. donovani e L . panamensis. A integração do gene foi verificada por PCR. A expressão do gene eGFP foi avaliada por citometria de fluxo. Os parasitas fluorescentes foram clonados por diluição limitante, e os clones com maior intensidade de fluorescência foram selecionados por citometria de fluxo.
Introduction
Protozoários parasitas do gênero Leishmania causam leishmaniose, uma doença com uma ampla gama de manifestações clínicas. Essa doença é prevalente em 98 países, e sua incidência anual é estimada em 0,9 a 1,6 milhão decasos1. As espécies de Leishmania patogênicas para o homem são divididas em dois subgêneros, a saber, L. (Leishmania) e L. (Viannia). Infecção por algumas espécies pertencentes à L. Subgêneros (Leishmania), como L. donovani e L. infantum, podem resultar em leishmaniose visceral (LV), que é fatal se não tratada2. Espécies pertencentes ao L. Os subgêneros (Viannia) estão associados à maioria dos casos de leishmaniose cutânea (LC) e leishmaniose tegumentar americana (LCM) nas Américas Central e do Sul, particularmente no Panamá, Colômbia e Costa Rica, sendo a L. panamensis o principal agente etiológico dessas apresentações clínicas 3,4.
A quimioterapia anti-leishmania existente que inclui drogas como antimoniais pentavalentes, miltefosina e anfotericina B é altamente tóxica e cara. Além disso, o aumento da resistência aos fármacos nas últimas décadas tem se somado aos fatores que interferem no tratamento efetivo dos pacientes em todo omundo5. Diferenças substanciais têm sido demonstradas entre as espécies do gênero Leishmania em relação à suscetibilidade a drogas, especialmente entre espécies do Novo e do Velho Mundo 6,7. Por essas razões, é necessário direcionar esforços para a identificação e desenvolvimento de novas drogas anti-leishmania, com especial atenção às abordagens espécie-específicas. Estudar grandes bibliotecas de candidatos a fármacos com metodologias tradicionais é bastante difícil, uma vez que essas metodologias são muito trabalhosas para avaliar a atividade de compostos contra amastigotas intracelulares ou para realizar experimentos in vivo8; Portanto, tem sido necessário o desenvolvimento de novas técnicas que reduzam essas desvantagens, incluindo a implementação de genes repórteres e o desenvolvimento de ensaios de triagem fenotípica de alto conteúdo9.
O uso de genes repórteres mostrou o potencial de aumentar a eficiência do processo de triagem de drogas, pois facilita o desenvolvimento de ensaios de alto rendimento e in vivo. Parasitas recombinantes de Leishmania expressando vários genes repórteres têm sido gerados por vários grupos de pesquisa. Genes repórteres, como β-galactosidase, β-lactamase e luciferase, têm sido introduzidos em várias espécies de Leishmania utilizando vetores epissomais, mostrando utilidade limitada para triagem de drogas nas formas extra- e intracelulares do parasita10,11,12,13,14,15. Essas abordagens têm a limitação de exigir uma forte pressão seletiva em cultura para evitar a eliminação do construto epissomal, bem como o uso de reagentes adicionais para revelar a atividade do gene repórter. Por outro lado, a proteína fluorescente verde (GFP) e sua variante, a proteína fluorescente verde reforçada (eGFP), têm sido utilizadas na geração de um grande número de cepas transgênicas de Leishmania para ensaios de triagem in vitro de fármacos devido à sua flexibilidade e sensibilidade, bem como à possibilidade de automatizar o processo de triagem por citometria de fluxo ou fluorometria15, 16,17,18,19. Apesar dos resultados promissores, as culturas dessas cepas transgênicas foram altamente heterogêneas em seus níveis de fluorescência, uma vez que o número de cópias do gene GFP não foi o mesmo em todos os parasitas. Além disso, a manutenção da fluorescência exigiu pressão seletiva constante sobre os parasitas em cultura, uma vez que o gene GFP foi introduzido em uma construção epissomal.
Pelas razões expostas anteriormente, muitos esforços têm se concentrado no desenvolvimento de novas metodologias para a produção de cepas recombinantes estáveis. Esses esforços têm se baseado principalmente na integração de genes repórteres em locos ribossomais, aproveitando as maiores taxas de transcrição de genes ribossomais20. Cepas de L. infantum e L. amazonensis foram geradas integrando os genes que codificam para β-galactocidase 21, IFP 1.4, iRFP22 e tdTomato23, e foram avaliadas quanto à sua utilidade em ensaios de triagem de fármacos. Vários grupos desenvolveram cepas de L. donovani que expressam a GFP constitutivamente, integrando seu gene codificador ao locus do RNA ribossomal 18S (locus ssu) através de recombinação homóloga24,25; apresentaram expressão estável e homogênea de GFP na população transfectada, incluindo amastigotas intracelulares 24,25, e foram implementadas com sucesso em ensaios de triagem de drogas24,25,26. Bolhassani et al.27 desenvolveram cepas de L. major e L. infantum expressando GFP como um transgene integrado. Eles utilizaram o vetor de integração pLEXSY, originalmente projetado para a expressão transgênica de proteínas em um sistema usando L. tarentolae como hospedeiro28. O vetor pLEXSY-GFP tem se mostrado muito eficiente para a geração de diferentes cepas de Leishmania expressando constitutivamente GFP 24,25,27,29,30. Nesses parasitas, a fluorescência é homogênea e mantida nas formas intracelulares, podendo ser detectada em lesões de coxins plantares de camundongosinfectados27.
Neste trabalho, descrevemos a metodologia utilizada para gerar cepas de L. panamensis e L . donovani expressando o gene que codifica para eGFP como um transgene integrado usando o sistema pLEXSY. As cepas geradas por esse processo são utilizadas em nosso laboratório para a realização de ensaios de triagem de fármacos que avaliam a potencial atividade anti-leishmania de moléculas de origem natural e sintética.
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Protocol
Para manter as amostras estéreis, todas as etapas que envolvem a cultura do parasito devem ser realizadas dentro de um capô de nível de biossegurança 2 (BSL-2) ou de acordo com as normas locais de saúde e segurança. Um resumo gráfico desse protocolo pode ser encontrado na Figura 1.
Figura 1: Esquema resumo do protocolo para geração de parasitas L. panamensis e L. donovani que expressam eGFP usando a família de vetores pLEXSY-2.1. Todas as seis seções principais descritas no artigo são descritas aqui. 1) Amplificação e inserção do gene eGFP no vetor pLEXSY-2.1: o gene alvo é amplificado, adicionando-se os sítios de reconhecimento das enzimas KpnI e BglII, e tanto o amplicon eGFP quanto o plasmídeo pLEXSY são sequencialmente digeridos com ambas as enzimas para posterior ligadura com T4 ligase. 2) Linearização do plasmídeo de expressão pLEXSY: a construção pLEXSY + eGFP é digerida com SwaI para linearização e purificação do de expressão de 7-8 kbp. 3) Transfecção e 4) seleção policlonal: Promastigotas de Leishmania são transfectados com de expressão por eletroporação e recolocados em cultura para seleção antibiótica de parasitas recombinantes. A fluorescência do parasita é confirmada por citometria de fluxo. 5) Confirmação da integração genômica e 6) clonagem por diluição limitante: a integração do de expressão pLEXSY-eGFP é confirmada por PCR diagnóstico, usando um primer forward hibridizando para o de expressão e um primer reverso hibridizando para uma sequência cromossômica ausente no de expressão. Culturas transfectadas podem ser enriquecidas para parasitas fluorescentes por clonagem limitando a diluição, e clones com as maiores intensidades fluorescentes médias podem ser selecionados para aplicações posteriores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
1. Amplificação e inserção do gene eGFP no vetor pLEXSY-2.1
- Amplificação do gene eGFP
NOTA: Como este protocolo utiliza a família de vetores pLEXSY-2.1 (ver Tabela de Materiais) para a expressão constitutiva de proteínas-alvo após a integração do de expressão no locus cromossômico 18S rRNA (ssu) de espécies de Leishmania , o primeiro passo é introduzir no gene eGFP as sequências contendo os sítios de restrição que permitem sua inserção nos vetores pLEXSY-2.1. Neste caso, como a eGFP só precisa ser expressa citosolicamente, os sítios de restrição para as enzimas BglII e KpnI foram adicionados nas extremidades 5' e 3' do gene eGFP, respectivamente. A clonagem com KpnI resulta na fusão da proteína-alvo a um tag de poli-histidina C-terminal de seis resíduos, seguido por um códon stop codificado no plasmídeo pLEXSY-2.1 para posterior purificação da proteína de interesse. Por esta razão, a sequência de primers reversos não contém um códon de parada.- Dependendo da fonte plasmidial para eGFP, analise a sequência alvo usando uma ferramenta de análise de restrição como NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)31 para certificar-se de que ela não contém sítios internos para as enzimas de restrição usadas para clonagem (BglII e KpnI) ou para SwaI, que é a enzima usada para linearização vetorial antes da transfecção.
- Projetar primers forward e reverse para amplificação de eGFP contendo as sequências de restrição BglII e KpnI. Como exemplo, a fonte de eGFP para esse protocolo foi o plasmídeo pEGFP-N1-1X32, e as sequências de primers foram as relatadas por Bolhassani et al.27:
Primer para a frente (EGFP1): 5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3' (local de restrição BglII em negrito).
Primer reverso (EGFP2): 5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3' (site de restrição KpnI em negrito). - Amplificar o gene alvo usando uma polimerase de alta fidelidade para garantir a preservação da sequência codificante. Como exemplo, para os primers EGFP1 e EGFP2, execute o protocolo de ciclagem de PCR como relatado por Bolhassani et al.27. Executar uma desnaturação inicial de 2 min a 94 °C, seguida por 30 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 57 °C e 1 min a 72 °C. Execute uma etapa final de extensão de 10 min a 72 °C. Adicionar os primers a uma concentração final de 0,2 μM.
- Purificar o fragmento utilizando um kit de purificação convencional do produto PCR ou precipitação padrão de acetato de sódio e etanol, conforme descrito em outra parte33.
- Inserção da eGFP no vetor de expressão pLEXSY-2.1
- Corte as extremidades do produto eGFP-PCR usando BglII e KpnI, seguindo as instruções do fabricante.
- Primeiro, configurar a reação para a enzima que requer a menor concentração de sal (neste caso, KpnI), de acordo com as instruções do fabricante, e incubar a 37 °C por 1 h.
- Em seguida, adicione 100 mM de NaCl e 10 unidades de BglII e incube por 15 min. Purificar a reacção, tal como descrito no passo 1.1.4.
- Digerir o vetor de expressão pLEXSY com BglII e KpnI, seguindo o protocolo de digestão sequencial descrito na etapa 1.2.1.
- Ligate o vetor pLEXSY e o gene eGFP com a ligase T4 usando uma razão molar de 1:3 (vetor:inserção). Adicionar brevemente 100 ng de pLEXSY digerido e 28 ng de produto eGFP digerido a uma reação de 20 μL contendo tampão ligase em uma concentração final de 1x e 3 unidades de T4 DNA ligase. Incubar durante a noite a 4 °C.
- Transformar células competentes de E. coli , como XL-10, DH5α ou DH10B, com o produto de ligadura obtido na etapa 1.2.3 usando protocolos de transformação padrão33. Plaquear as células transformadas em ágar Luira-Bertani (LB)-ampicilina e incubar por 24 h a 30 °C para selecionar clones recombinantes (plasmídeos pLEXSY são mais estáveis em E. coli a 30 °C do que a 37 °C).
- Rastrear a presença da inserção nos plasmídeos por PCR de colônia.
- Colher colônias individuais, ressuspender em 20 μL de água livre de nucleases, aquecer a 95 °C por 15 min e tomar 1 μL do lisado como molde de DNA para PCR de colônia. Use o primer forward para amplificação eGFP, descrito na etapa 1.1.2 (neste exemplo, EGFP1), e o primer A264 (5'-CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAAG-3') como um primer reverso29.
- O primer A264 é projetado para recozer 80 pb após o códon de parada da inserção em vetores de expressão pLEXSY-2.1. Como exemplo, para o par de primers EGFP1 + A264, use um protocolo de ciclagem de PCR que consiste em uma desnaturação inicial de 2 min a 94 °C, seguida por 30 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 50 °C e 1 min a 72 °C. Execute uma etapa final de extensão de 10 min a 72 °C. Os primers são adicionados a uma concentração final de 0,2 μM.
NOTA: O produto esperado usando este conjunto de primers é de 859 pb de comprimento. Os locais de recozimento dos primers EGFP1 e A264 estão representados na Figura 2.
- Preparar o DNA plasmidial purificado de um clone positivo para posterior transfecção usando um kit comercial de isolamento de plasmídeos ou precipitação alcalina padrão33. Utilizar 50 mL de cultura noturna a 30 °C para isolamento de um mínimo de 10 μg de plasmídeo/clone positivo.
- Corte as extremidades do produto eGFP-PCR usando BglII e KpnI, seguindo as instruções do fabricante.
2. Linearização do plasmídeo de expressão de pLEXSY
- Use pelo menos 10 μg do plasmídeo purificado pLEXSY-eGFP para digestão com SwaI (local de reconhecimento: 5'-ATTTAAAT-3'). Digerir durante 3-4 h a 25 °C e inactivar o calor a 65 °C durante 20 min.
- Execute o produto da digestão em eletroforese em gel de agarose para separar os fragmentos resultantes. Esta digestão gerará dois fragmentos, um fragmento de 2,9 kbp representando os elementos necessários para replicação e seleção em E. coli, e um fragmento de 7-8 kbp representando o de expressão linearizada.
- Purificar o de expressão usando um kit comercial de extração em gel de agarose.
3. Transfecção de L. panamensis e L. donovani por eletroporação
OBS: A cultura de Leishmania é realizada conforme descrito anteriormente34. Neste exemplo, promastigotas de L. panamensis e L . donovani foram cultivadas em meio de insetos Schneider, suplementadas com 20% (v/v) de soro fetal bovino (SFB) e 50 μg/mL de gentamicina, e incubadas a 26 °C.
- Cultivar as culturas do parasita até que haja promastigotas suficientes em fase logarítmica ou fase estacionária inicial para usar aproximadamente 4 x 107 parasitas por transfecção. A densidade celular máxima por frasco de cultura antes de atingir a fase estacionária pode variar dependendo da espécie de Leishmania e da adaptação das cepas às condições de laboratório. Agrupe o conteúdo de vários frascos de cultura, se necessário.
- Centrifugar a cultura do parasito a 2.000 x g por 3 min à temperatura ambiente (TR).
- Ressuspender o pellet em tampão de eletroporação a 4 °C (21 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na2HPO4 e 6 mM glicose; pH 7,5)27 para obter uma concentração de 1 x 108 parasitas/mL. Coloque no gelo por 10 min.
NOTA: O tampão de eletroporação deve ser esterilizado por filtragem antes do uso. - Em paralelo, tubos de pré-resfriamento com 2-10 μg de pLEXSY-eGFP linearizado são construídos em um volume máximo de 50 μL de água ou 10 mM de tampão tris (pH 8,0) e cubetas de eletroporação de d = 2 mm.
- Adicionar 350 μL de parasitas pré-resfriados ao tubo com o plasmídeo linearizado e transferir todos os 400 μL para a cubeta de eletroporação sobre gelo. Em paralelo, eletroporar as células do parasita sem DNA plasmidial como controle negativo.
- Eletroporato usando um destes dois protocolos:
Decaimento exponencial: 450 V, 450 μF, um pulso.
Constante de tempo: 450 V, T = 3,5 ms, um pulso.
NOTA: Estes protocolos foram executados usando um pulverizador genético comercial (Tabela de Materiais) com módulos PC e CE. - Colocar a cubeta novamente no gelo por 10 min e transferir os parasitas eletroporados para 5 mL do meio de cultura apropriado. Este exemplo usou o meio de inseto de Schneider suplementado com 20% (v/v) de FBS. Incubar a 26 °C durante 20 h.
4. Seleção policlonal em cultura
- Aproximadamente 20 h após a eletroporação, observar as culturas ao microscópio. Pelo menos metade da população parasitária deve apresentar boa morfologia e motilidade (promastigotas em forma de gota com flagelo oscilante movendo-se através da mídia e/ou formando agregados parasitários ativos). Adicionar o antibiótico seletivo apropriado dependendo do plasmídeo pLEXSY usado. Neste exemplo, é usado o pLEXSY-sat2.1, que contém estreptoligocracina acetiltransferase como marcador de seleção. Portanto, use nourseotricina como antibiótico seletivo na concentração de 0,1 mg/mL.
- Seguir microscopicamente as culturas até que uma clara diferença entre os parasitas eletroporados com e sem DNA plasmidial seja observada.
- Verificar a fluorescência do parasita através de citometria de fluxo.
- Centrifugar 1 mL da cultura de fase estacionária a 2.000 x g por 3 min em RT. Lavar duas vezes em PBS e ressuspender o pellet final em 1 mL de PBS.
NOTA: A fluorescência da eGFP pode ser detectada no canal FL1 da maioria dos citômetros comerciais. Configurações de ganho para dispersão frontal e lateral, e o canal FL1 pode variar entre os citômetros. Para este exemplo, um citômetro de espaço CyFlow (Sysmex) foi usado. - Execute as amostras, coletando 20.000 eventos a uma velocidade de 0,5 μL/s, e defina os valores de ganho para os canais de dispersão direta (FSC), dispersão lateral (SSC) e fluorescência 1 (FL-1) como 225,0, 200,0 e 520,0, respectivamente. Executar uma amostra controle com parasitas não fluorescentes para determinar a população de parasitas em um dot-plot FSC versus SSC.
- Criar uma porta (G1) contendo a população de parasitos e filtrar o canal FL-1 através dessa porta para determinar a autofluorescência de promastigotas e definir uma porta de alcance (G2) para o canal FL-1.
- Execute os parasitas transfectados para verificar se há fluorescência. Registrar a porcentagem de parasitos fluorescentes no G1 e a média da intensidade da fluorescência no G2.
- Centrifugar 1 mL da cultura de fase estacionária a 2.000 x g por 3 min em RT. Lavar duas vezes em PBS e ressuspender o pellet final em 1 mL de PBS.
5. Confirmação da integração genômica
NOTA: A integração do de expressão pLEXSY-eGFP pode ser confirmada por PCR diagnóstica, usando um primer forward hibridizando para o de expressão (varia dependendo do vetor pLEXSY-2.1 usado) e o primer reverso F3002 (5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3') hibridizando-se para uma sequência cromossômica ssu-flanqueando ausente no de expressão. Neste exemplo, o primer F2999 (5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3') é usado como ele hibridiza no de expressão pLEXSY-sat2.1. Uma representação esquemática dos sítios de de expressão integrada e recozimento de primers para PCR diagnóstica é mostrada na Figura 2.
- Purificar o DNA genômico de 2-5 mL de uma cultura de parasita em fase estacionária por extração convencional de fenol/clorofórmio35 ou com um kit comercial.
- Realizar a PCR diagnóstica para pLEXSY-sat2.1 usando um protocolo de ciclagem que consiste em uma desnaturação inicial de 2 min a 94 °C, seguida por 30 ciclos de 30 s a 94 °C, 30 s a 53 °C e 1 min a 72 °C. Execute uma etapa final de extensão de 10 min a 72 °C. Os primers são adicionados a uma concentração final de 0,2 μM.
Figura 2: Representação esquemática do de expressão integrada. Caixas rotuladas como Chr-S (cinza) representam as sequências cromossômicas adjacentes do locus 18S rRNA (ssu) no qual o de expressão está integrado. O de expressão integrada consiste de sequências 5' e 3' (azul) para recombinação homóloga no locus ssu, um promotor ribossomal adicional de Leishmania (vermelho) para aumentar a produção de proteínas, o gene eGFP (verde), um gene marcador de seleção (amarelo) e três regiões não traduzidas (cinza claro), a saber, utr1, 2 e 3, que fornecem os sinais de splicing para processamento pós-transcricional de RNAm para expressão otimizada de eGFP e marcador de seleção em parasitas de Leishmania. Os locais de recozimento dos primers para a frente e para a inversão utilizados para a verificação da presença da inserção por PCR de colónia (passo 1.2.5) são marcados pelas setas pretas rotuladas como cpcr-fwd (primer EGFP1) e cpcr-rev (primer A264), respectivamente, que delimitam um produto de 859 pb. Os sítios de anelamento dos primers forward e reverse utilizados para a verificação da integração genômica por PCR diagnóstica (etapa 5) são marcados pelas setas pretas marcadas como sat-fwd (primer F2999) e ssu-rev (primer F3002), respectivamente, que delimitam um produto de 2.271 pb. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
6. Clonagem limitando a diluição (opcional)
- Após a confirmação da fluorescência por citometria de fluxo, preparar uma diluição de parasitas recombinantes na concentração de cinco promastigotas/mL36.
- Adicionar 100 μL desta diluição em cada poço de uma placa de 96 poços. Dessa forma, as placas são semeadas a uma densidade média de 0,5 promastigotas/poço, o que garante que alguns poços recebam um único parasita, minimizando a probabilidade de haver mais de um parasita por poço36.
- Deixe a placa intacta por pelo menos 12 h. Seguir a placa microscopicamente em um aumento mínimo de 100x até que poços com crescimento parasitário sejam detectados.
- Quando um poço de placa estiver cheio de parasitas, use o conteúdo para inocular uma cultura de 5 mL. Isso leva 1-2 semanas.
- Quando as culturas de clones atingirem a fase estacionária, verificar a fluorescência por citometria de fluxo, conforme descrito na etapa 4.3. Selecionar os clones a serem utilizados para ensaios posteriores in vitro e in vivo com base na porcentagem de parasitos fluorescentes e na intensidade média de fluorescência medida no canal FL-1. Apontar para clones com 98%-99% de parasitas fluorescentes e selecionar aqueles com maior intensidade média de fluorescência.
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Representative Results
Depois de construir a construção pLEXSY-eGFP e transformar células de E. coli competentes, as colônias contendo a construção com a inserção de eGFP gerarão um produto de aproximadamente 859 pb após a execução da PCR de colônia descrita na seção 1.2 (Figura 3A). A digestão total do plasmídeo purificado das colônias positivas usando SwaI deve dar dois fragmentos característicos em eletroforese em gel, um fragmento de 2,9 kbp que é a porção do vetor PLEXSY contendo todos os elementos necessários para replicação e seleção em E. coli, e um fragmento de 7-8 kpb representando o de expressão linearizada que é usado para transfecção (Figura 3B).
Após a transfecção, a seleção policlonal é feita principalmente qualitativamente. O status das culturas de parasitos durante a seleção com antibióticos é monitorado microscopicamente, trazendo especial atenção à morfologia e motilidade do parasito. Após a recuperação bem-sucedida de uma cultura de parasitas transfectados, aqueles que expressam efetivamente eGFP devem ser detectados no canal FL-1 de um citômetro de fluxo (Figura 4A); as eficiências de transfecção podem variar entre as diferentes espécies de Leishmania . Neste trabalho, após seleção policlonal, 98,44% dos parasitos de L. donovani analisados por citometria de fluxo foram fluorescentes em comparação com 82,00% de L. panamensis (Figura 4B). Se o de expressão pLEXSY-eGFP tiver sido integrado com sucesso no locus ssu , um produto de 2,3 kbp deve ser observado após a execução da PCR diagnóstica descrita na seção 5 (Figura 4C). Estes resultados garantem que parasitas recombinantes sejam obtidos que expressem constitutivamente eGFP como um transgene integrado e permanecerão estáveis nas passagens subsequentes da cultura do parasito.
A clonagem por diluição limitante permite o enriquecimento da população de parasitos fluorescentes com menor eficiência de transfecção, como L. panamensis, bem como a seleção de clones com as maiores intensidades de fluorescência. Quatro clones foram obtidos para cada uma das espécies de Leishmania utilizadas neste trabalho (Tabela 1), a saber: Lpan-A7, F11, F12 e H2 para L. panamensis, e Ldon-C1, G4, F2 e H1 para L. donovani. Clones com maior porcentagem de parasitos fluorescentes (Lpan-F11 = 95,74%; Ldon-C1 = 99,16%) e intensidade média de fluorescência (Lpan-F11 = 35,63 unidades fluorescentes relativas [RFU]; Ldon-C1 = 14,12 RFU) foram selecionados para uso posterior em ensaios de triagem de drogas.
Figura 3: Resultados representativos da preparação do construto pLEXSY-eGFP para transfecção. (A) Resultados representativos da PCR da colônia. Faixa 1: escada de 1 kb (unidades em pares de base); faixas 2, 10 e 12: amostras negativas para a presença da inserção de GFPe; faixas 3-9 e 13-14: amostras positivas para a presença da inserção de eGFP. (B) Resultados da linearização com SwaI. Faixa 1: escada de 1 kb (unidades em pares de bases); faixas 2-4: reações de digestão de plasmídeos purificados de três colônias diferentes positivas para a presença da inserção de eGFP. Um fragmento de 2,9 kbp representando os elementos necessários para replicação e seleção em E. coli, e um fragmento de 7-8 kpb representando o de expressão linearizada são observados. Ambos os géis foram preparados na concentração de agarose de 1%. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Resultados representativos da confirmação da expressão de eGFP e inserção cromossômica do de expressão . (A) Histograma de citometria de fluxo no canal FL-1. Vermelho: células selvagens sem eGFP; Azul: parasitas transfectados de L. panamensis com 82,00% da população expressando eGFP. (B) Comparação dos resultados de transfecção entre L. panamensis (Lpan-1) e L. donovani (Ldon-1). Uma maior eficiência de transfecção foi observada em L. donovani (98,44%) do que em L. panamensis (82,00%) após seleção policlonal. (C) Resultados da PCR para confirmação da integração genômica. L: escada de 100 pb (unidades em pares de bases); pistas 1-4: amostras de quatro clones diferentes de L. panamensis mostrando um produto característico de 2,3 kbp para integração do pLEXSY-sat2.1 no locus ssu . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Espécie | Código de clonagem | Porcentagem de parasitas fluorescentes | Intensidade média da fluorescência* |
| L. panamense | Lpan-A7 | 90.00 | 24.70 |
| Lpan-F11 | 95.74 | 35.63 | |
| Lpan-F12 | 92.85 | 34.44 | |
| Lpan-H2 | 85.00 | 20.66 | |
| L. donovani | Ldon-C1 | 99.16 | 14.12 |
| Ldon-G4 | 99.21 | 13.96 | |
| Ldon-F2 | 97.96 | 11.67 | |
| Ldon-H1 | 98.97 | 12.90 |
Tabela 1: Clones obtidos por diluição limitante. Quatro clones foram obtidos por diluição limitante para cada uma das espécies de Leishmania utilizadas neste trabalho. A porcentagem de parasitos fluorescentes e a intensidade média de fluorescência são relatadas para cada clone. *A fluorescência é expressa em unidades de fluorescência relativa (RFU).
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Discussion
As vantagens e desvantagens de vários genes repórteres têm sido estudadas em vários protozoários parasitas. Dentre elas, a GFP e a eGFP são intrinsecamente fluorescentes e permitem fácil quantificação e obtenção de imagens. A atividade fluorescente dessas proteínas pode ser detectada com manipulação mínima usando microscopia de fluorescência, fluorimetria ou citometria de fluxo. Poucos estudos foram realizados para gerar L expressando GFP. (Viannia), apesar da robustez demonstrada da GFP e seus derivados como genes repórteres em espécies de Leishmania do Velho Mundo15,16,18,24. Varela et al.37 desenvolveram cepas de L. panamensis que expressam GFP como um transgene epissomal. A análise por citometria de fluxo de promastigotas axênicos e amastigotas intracelulares mostrou a utilidade desses parasitas para ensaios de triagem de drogas. No entanto, a fluorescência foi muito heterogênea, e o número de parasitos fluorescentes na população transfectada foi dependente da pressão seletiva constante com o antibiótico tunicamicina. Esses fatos restringem o uso desses parasitas como amastigotas intracelulares para ensaios de triagem de drogas, uma vez que a tunicamicina não pode ser adicionada a macrófagos infectados38, deixando parasitas com baixa fluorescência presente na população de amastigotas intracelulares que poderiam enviesar a quantificação de macrófagos infectados.
O uso de vetores como o pLEXSY constitui uma ferramenta poderosa e confiável para a modificação estável de parasitas de espécies de Leishmania através da integração de transgenes por meio de recombinação homóloga28. O pLEXSY é integrado ao locus 18S rRNA (ssu), cuja transcrição está sob o controle do promotor forte da RNA polimerase I, levando a maiores taxas de transcrição20. O uso desse sistema tem demonstrado permitir a expressão estável e homogênea da proteína-alvo27. Essas características favorecem a expressão de eGFP e seu uso em ensaios intracelulares com níveis homogêneos de fluorescência em células infectadas, bem como seu uso para infecções experimentais em modelos murinos. A família de vetores pLEXSY-2.1 utilizada neste protocolo foi projetada com um promotor ribossomal adicional de Leishmania na frente do de expressão, aumentando a produção de proteína29,30.
Neste protocolo, existem várias etapas críticas para a obtenção de resultados ótimos. Em primeiro lugar, a clonagem do gene alvo deve ser realizada usando uma polimerase de alta fidelidade33, e a digestão do DNA alvo e do vetor de expressão deve ser feita usando um protocolo de digestão sequencial quando se usa a combinação BglII/KpnI para clonagem. Este último ocorre porque não há tampão no qual tanto a BglII quanto a KpnI exibem atividade ótima, embora ambas as enzimas sejam otimamente ativas na mesma temperatura (37 °C). Em segundo lugar, a seleção de clones recombinantes após transformação em E. coli deve ser realizada a 30 °C, uma vez que plasmídeos pLEXSY são mais estáveis nessa temperatura em E. coli28,29. Adicionalmente, as taxas de crescimento de L. panamensis e L. donavani podem ser bastante diferentes. Durante a realização dos experimentos descritos neste artigo, L. panamensis geralmente levou mais tempo para atingir a fase estacionária. As taxas de crescimento também podem variar de cepa para cepa em diferentes laboratórios; Portanto, é necessário caracterizar as taxas de crescimento das linhagens de laboratório para estimar o tempo necessário para atingir a concentração parasitária necessária para a eletroporação. O uso do tampão relatado por Bolhassani et al.27 para eletroporação é uma modificação importante que aumenta significativamente a sobrevivência dos parasitas eletroporados em comparação com a eletroporação direta em meio de cultura, como sugerido pelo protocolo original da Jena Bioscience. Durante a seleção policlonal, é extremamente importante não deixar que as culturas eletroporadas cresçam antes de adicionar o antibiótico seletivo; caso contrário, os parasitas não recombinantes superarão os recombinantes27. Será necessária uma ou duas passagens consecutivas (inóculo 1:10) em meio fresco com o antibiótico apropriado para obter uma cultura turva de parasitas recombinantes resistentes a antibióticos e um controle negativo claro. As passagens devem ser feitas dentro de 5 dias após a primeira adição de antibiótico. Finalmente, há diferenças notáveis na eficiência de transfecção e integração do de expressão pLEXSY entre L. panamensis e L. donovani24,37. Enquanto em L. donovani quase 98% da população total analisada por citometria de fluxo após seleção policlonal mostra fluorescência, em L. panamesis a porcentagem de parasitos fluorescentes é de cerca de 80%. Por esta razão, a etapa opcional da clonagem limitando a diluição é uma modificação mais necessária para obter uma população de L. panamensis onde mais de 95% dos parasitas analisados por citometria de fluxo são fluorescentes. O uso de plasmídeos pLEXSY é limitado à modificação genômica de espécies de Leishmania, uma vez que eles foram originalmente projetados para usar L. tarentolae como plataformas de produção de proteína28. Embora o pLEXSY tenha provado funcionar em várias espécies de Leishmania diferentes de L. tarentolae21,24,27, é importante verificar a conservação da sequência ssu ao trabalhar com uma nova espécie de Leishmania para garantir que os sítios de recombinação no plasmídeo pLEXSY funcionem.
O método descrito neste artigo permite a produção de parasitas recombinantes de Leishmania com expressão constitutiva e estável de eGFP ou qualquer outro repórter de interesse. Nesses parasitas, a fluorescência é homogênea e mantida nas formas intracelulares. Portanto, cepas geradas por esse processo poderiam ser usadas para padronizar ensaios de triagem de drogas de alto rendimento para avaliar a potencial atividade anti-leishmania de moléculas de origem natural e sintética.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Secretaria Nacional de Ciência, Tecnologia e Innovación (SENACYT), Panamá, processo número NI-177-2016, e Sistema Nacional de Investigación (SNI), Panamá, números de processo SNI-169-2018, SNI-008-2022 e SNI-060-2022.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Microplates | Corning | CLS3340 | Flat bottom clear, black polystyrene, sterile, lid |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A4718 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A8351 | BioXtra, suitable for cell culture |
| BglII restriction enzyme | New England BioLabs | R0144S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Cell Culture Flasks | Corning | CLS430168 | Surface area 25 cm2, canted neck, cap (plug seal) |
| ChemiDoc Imaging System | Bio-Rad | 17001401 | |
| CyFlow Space | Sysmex | Not available | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | powder, BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99.5% |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Gel Loading Buffer | Sigma-Aldrich | G2526 | The rate of migration varies with gel composition. Dilute 1:3 to 1:6 with sample before loading. |
| Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | The system is composed of a main unit, two accessory modules, the capacitance extender (CE module) and the pulse controller (PC module), and a ShockPod cuvette chamber. |
| Gene Pulser/MicroPulser Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652086 | Pkg of 50, 0.2 cm–gap sterile electroporation cuvette, for use with the Gene Pulser and MicroPulser Systems, for mammalian and other eukaryotic cells |
| Gentamicin solution | Sigma-Aldrich | G1397 | 50 mg/mL in deionized water, liquid, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| GoTaq Long PCR Master Mix | Promega | M4021 | |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | 1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| Inverted microscope | Olympus | IXplore Standard | |
| KpnI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3142S | 4,000 units. 20,000 units/mL |
| LB Broth with agar | Sigma-Aldrich | L3147 | Highly-referenced nutrient-rich microbial growth powder medium with Agar, suitable for regular E.coli culture. |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L2542 | Liquid microbial growth medium |
| Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio-Rad | 1640300 | Mini horizontal electrophoresis system, includes 8- and 15-well combs, 7 cm x 10 cm UV-transparent tray |
| pEGFP-N1-1x | Addgene | 172281 | Expressing eGFP mRNA fused with 1 tandem repeat of a 50-base sequence |
| pLEXSYcon2.1 expression kit | Jena Bioscience | EGE-1310sat | Contains integrative constitutive expression vector pLEXSY-sat2.1. Antibiotic selection of transfectants with Nourseothricin (NTC, clonNAT). Contains all primers for diagnostic PCRs and sequencing. |
| Potassium Chloride | Millipore | 529552 | Molecular Biology Grade - CAS 7447-40-7 - Calbiochem |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1222 | Up to 15 μg of Transfection-Ready Plasmid from 3 mL cultures. |
| Schneider′s Insect Medium | Sigma-Aldrich | S0146 | Medium used in our laboratory for culturing Leishmania. |
| SOC Medium | Sigma-Aldrich | S1797 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥99% (titration) |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | RDD038 | BioReagent, suitable for cell culture, suitable for insect cell culture, ≥99.0%, free-flowing, Redi-Dri |
| SwaI restriction enzyme | New England BioLabs | R0604S | 2,000 units. 10,000 units/mL |
| Syringe filters | Corning | CLS431212 | regenerated cellulose membrane, diam. 4 mm, pore size 0.2 μm |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1861096 | Thermal cycler system, includes 96-well thermal cycler, power cord, tube support ring |
| T4 DNA Ligase | Promega | M1801 | Joins two DNA strands with cohesive or blunt ends |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | BioReagent, suitable for electrophoresis, 10× concentrate |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9285 | |
| XL10-Gold Ultracompetent Cells | Agilent | 200317 | XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0.1 mL. Features the kanamycin-resistance gene on the F' episome, for extremely demanding cloning in chloramphenicol-resistant vectors. Efficiency: > 5 x 10 9 transformants/µg pUC18 DNA. |
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