Summary
O presente protocolo descreve a reprogramação do Adenocarcinoma Ductal Pancreático (ADP) e de células epiteliais ductais pancreáticas normais em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Fornecemos um procedimento otimizado e detalhado, passo a passo, desde a preparação do lentivírus até o estabelecimento de linhas iPSC estáveis.
Abstract
A geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando fatores de transcrição tem sido obtida a partir de quase qualquer tipo celular diferenciado e tem se mostrado altamente valiosa para pesquisas e aplicações clínicas. Curiosamente, a reprogramação iPSC de células cancerosas, como o adenocarcinoma ductal pancreático (ADP), demonstrou reverter o fenótipo invasivo de ADP e anular o epigenoma do câncer. A diferenciação de iPSCs derivadas do PDAC pode recapitular a progressão do ADP a partir de seu precursor precoce da neoplasia intraepitelial pancreática (PanIN), revelando as mudanças moleculares e celulares que ocorrem precocemente durante a progressão do ADP. Portanto, iPSCs derivadas do PDAC podem ser usadas para modelar os estágios iniciais do PDAC para a descoberta de marcadores diagnósticos de detecção precoce. Isso é particularmente importante para pacientes com ADP, que geralmente são diagnosticados nos estágios metastáticos tardios devido à falta de biomarcadores confiáveis para os estágios iniciais da PanIN. No entanto, a reprogramação de linhagens de células cancerosas, incluindo PDAC, em pluripotência permanece desafiadora, trabalhosa e altamente variável entre diferentes linhagens. Aqui, descrevemos um protocolo mais consistente para gerar iPSCs a partir de várias linhagens celulares PDAC humanas usando vetores lentivirais bicistrônicos. As linhagens iPSC resultantes são estáveis, não mostrando dependência da expressão exógena de fatores reprogramadores ou drogas induzíveis. Em geral, esse protocolo facilita a geração de uma ampla gama de iPSCs derivadas do PDAC, o que é essencial para a descoberta precoce de biomarcadores mais específicos e representativos dos casos de ADP.
Introduction
O adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é uma das neoplasias malignas mais fatais, e o diagnóstico precoce permanece desafiador devido à natureza assintomática da doença. A maioria dos pacientes com ADP é diagnosticada na fase metastática avançada, quando opções de tratamento muito limitadas estão disponíveis 1,2. Isso se deve principalmente à falta de biomarcadores confiáveis para os estágios iniciais, como aqueles que poderiam ser convenientemente detectados como proteínas liberadas na corrente sanguínea.
O ADP pode disseminar-se muito precocemente durante sua progressão, e um melhor prognóstico tem sido associado à detecção precoce do câncer quando o ADP está localizado no pâncreas3. Entretanto, menos de um décimo dos pacientes com ADP são diagnosticados com prognóstico favorável, permitindo a ressecção cirúrgica. No entanto, aqueles poucos com tumores ressecáveis também são propensos à recorrência tumoral em 12meses4.
Nas últimas cinco décadas, melhorias notáveis foram feitas nas técnicas cirúrgicas, no atendimento ao paciente e nas modalidades de tratamento 5,6. No entanto, a taxa de sobrevida em 5 anos em pacientes com ADP ressecados cirurgicamente mal subiu para 17%. No entanto, este ainda é melhor do que em pacientes não ressecados, que permaneceu praticamente inalterado (0,9%)4,7. A quimioterapia é a única outra alternativa de tratamento para o ADP. No entanto, essa opção é muito limitada, pois a grande maioria dos pacientes com ADP apresenta forte resistência a medicamentos quimioterápicos como a Gencitabina 7,8. Outros fármacos, como o erlotinibe, estão disponíveis apenas para um pequeno grupo de pacientes com ADP com mutações específicas, a maioria dos quais apresenta resistência ao erlotinibe9. Os efeitos adversos associados à quimioterapia na maioria dos pacientes com ADP são outra desvantagem desse tratamento10. Recentemente, estratégias promissoras têm mostrado que inibidores de checkpoints imunes (ICIs) e inibidores de pequenas moléculas quinases (SMKIs) podem ser eficazes no tratamento de ADP, mas respostas duráveis a essas terapias-alvo permanecem limitadas a uma minoria de pacientes11,12. Em geral, a descoberta de biomarcadores precoces específicos para o PDAC pode pavimentar novos caminhos para o diagnóstico e tratamento precoces.
O ADP desenvolve-se a partir de lesões precursoras de neoplasias intraepiteliais pancreáticas (PanIN) que resultam de proliferações epiteliais não invasivas dos ductos pancreáticos13,14. Enquanto a formação de PanIN é iniciada por mutações oncogênicas como KRAS, alterações genéticas e epigenéticas adicionais são necessárias para a progressão para PDAC. Projeta-se que a progressão da NIPan através dos diferentes estágios para ADP invasiva leva cerca de 10 anos 13,15,16,17. Esse período oferece uma grande oportunidade de se beneficiar do diagnóstico precoce de ADP. Portanto, extensas pesquisas têm sido realizadas para estabelecer modelos animais de xenoenxerto tumoral e culturas organoides para estudar a progressão do ADP18,19,20,21. Esses modelos têm sido muito úteis para estudar os estágios invasivos do ADP, embora não a transição das fases iniciais da PanIN. Portanto, é importante desenvolver modelos experimentais que possam recapitular a progressão precoce dos estágios de PanIN para permitir a descoberta de biomarcadores de detecção precoce.
A reprogramação de células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) usando os quatro fatores de transcrição OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC (OSKM) ilustrou a extensão da plasticidade celular22. A plasticidade das células cancerosas tem sido bem documentada, e a reprogramação de células cancerosas humanas em iPSCs tem sido usada com sucesso para redefinir as células ao seu estado celular original, removendo muitos dos insultos epigenéticos que se acumularam durante a progressão do câncer 23,24,25,26,27,28,29. A possibilidade de utilizar essa estratégia de reprogramação para manipular a identidade das células cancerígenas tem, portanto, se apresentado como grande promessa no tratamento docâncer30,31. De fato, mostramos anteriormente que a diferenciação de iPSCs derivadas de PDACs pode recapitular a progressão da PDAC através dos estágios iniciais da PanIN32. Por meio da identificação de genes e vias específicas para os estágios iniciais a intermediários da ADP, foram identificados biomarcadores candidatos que podem ser utilizados clinicamente para o diagnóstico precoce da ADP32,33. No entanto, os biomarcadores descobertos usando uma única linhagem iPSC mostraram cobertura limitada na maioria dos pacientes com ADP32. Os desafios de gerar linhas iPSC de outros pacientes com ADP interromperam a capacidade de descobrir biomarcadores mais confiáveis. Isso se deve a muitos fatores técnicos, incluindo a heterogeneidade da liberação de OSKM, já que apenas uma pequena porção de células PDAC primárias humanas continha todos os quatro fatores e respondia com sucesso à reprogramação. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para reprogramação de células PDAC primárias usando uma entrega lentiviral dupla mais eficiente e consistente de OSKM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da OHSU. Todos os métodos foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentações pertinentes. Todos os trabalhos em animais para tumores PDX foram realizados com a aprovação do Comitê Institucional de Uso e Cuidado Animal da OHSU (IACUC). Este protocolo foi testado em células PDAC primárias de xenoenxerto derivado do paciente (PDX), linhagem celular BxPc3 exibindo morfologia epitelial que foi isolada do tecido pancreático de uma paciente de 61 anos com adenocarcinoma, linhagem celular epitelial imortalizada H6C7 derivada de epitélio normal do ducto pancreático humano normal e fibroblastos humanos primários derivados de biópsia de pele de indivíduos saudáveis. Espécimes humanos de PDAC foram obtidos sob o estudo Oregon Pancreas Tissue Registry (IRB00003609). Consentimento informado foi obtido de todos os sujeitos. Fibroblastos humanos primários foram derivados em RBiomedical, Edimburgo, Reino Unido, a partir de amostras de pele de doadores anônimos submetidos a cirurgia de rotina na Edinburgh Royal Infirmary, Little France, Reino Unido, sob seu consentimento e aprovação ética (09/MRE00/91). Todos os trabalhos com lentivírus foram realizados no âmbito da actividade de investigação da classe 2 (GM207/16.6) e aprovados pelo Departamento de Saúde e Segurança da Universidade de Edimburgo e notificados à autoridade competente em matéria de HSE do Governo escocês. Todos os experimentos de reprogramação usando células pancreáticas humanas foram realizados sob a aprovação ética do comitê de ética da Faculdade de Ciências Biológicas da Universidade de Edimburgo (referência # asoufi-0002).
1. Preparação de lentivírus
- Para a preparação de lentivírus, preparar embalagens de alta qualidade e plasmídeos de expressão (livres de endotoxinas) com concentrações entre 1-2 μg/μL, incluindo psPAX2, pMDG34 e dois vetores bicistrônicos contendo RES; a codificação pSIN4-EF1a-O2S para a expressão de OCT4 e SOX2 impulsionada pelo promotor EF-1α e a expressão pSIN4-CMV-K2M para a expressão de KLF4 e c-MYC sob o potenciador/promotor CMV35 (ver Tabela de Materiais). Além disso, prepare o plasmídeo pWPT-GFP para ser usado como um controle de transfecção.
- Descongelar linhagem celular de rim embrionário humano (293T) e cultura em meio essencial mínimo (GMEM) de Glasgow, suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (FCS), 1x aminoácidos não essenciais, 1 mM de piruvato de sódio e 1 mM de glutamina a (ver Tabela de Materiais) a 37 °C e 5% de CO2.
NOTA: Recomenda-se o uso de células 293T dentro de quatro passagens após o descongelamento. - Semente 293T a uma densidade de 3 milhões de células por placa de 15 cm, 24 h antes da transfecção. Um total de três pratos são necessários. É preferível semear células no final da tarde ~16:00.
- No dia seguinte (~16:00), quando as células atingirem ~40%-50% de confluência, prepare o seguinte para três reações de transfecção:
Observação : sempre contabilizar o erro de pipetagem adicionando 10% de volume extra.- Rotular três tubos plásticos de 15 mL com o nome apropriado do lentivírus (pSIN4-EF1a-O2S, pSIN4-CMV-K2M e pwPT-GFP controle). Adicionar 1,710 ml de soro reduzido (ver Tabela de Materiais) a cada tubo.
- Diluir 90 μL de reagente de transfecção (ver Tabela de Materiais) em meio de soro reduzido de 1,710 mL, misturar por vértice por 2 s e incubar à temperatura ambiente por 5 min.
- Misture os vetores de embalagem; 5,1 μg de psPAX2 e 2,4 μg de pMDG (7,5 μg total).
- Adicionar a mistura vectorial da embalagem ao meio de transfecção (a partir do passo 1.4.2) e o vórtice durante 2 s.
- Adicionar 7,5 μg de cada vetor de reprogramação: pSIN4-EF1a-O2S e pSIN4-CMV-K2M e o controle pwPT-GFP à mistura de transfecção da etapa (1.4.4) e vórtice por 2 s.
NOTA: Use a expressão vetor: vetor viral na proporção de 1:1.
- Incubar os tubos de transfecção por 15 min à temperatura ambiente.
- Transfectar as células 293T com cada lentivírus adicionando diretamente a mistura transfecção-DNA da etapa (1.4.5) ao meio de forma gota a gota. Agite o prato para garantir uma distribuição uniforme em toda a superfície.
- Incubar as células transfectadas numa incubadora a 37 °C, 5% CO2 durante a noite.
NOTA: Use resíduos específicos para vírus, um balde de descarte de metal, saco duplo com sacos de autoclave e pegue um recipiente de lixo líquido para vírus e adicione um comprimido desinfetante. Descarte todas as pipetas, pontas e tubos em uma caçamba de metal. Descarte mídias antigas em um recipiente de resíduos líquidos. Evite o uso de pipetas de vidro e vidraria para eliminar a contaminação acidental por vírus. - Após 14-16 h pós-transfecção, substituir o meio por 30 mL de meio fresco de 293T.
- Incubar as células transfectadas a 37 °C, 5% CO2 por 60-72 h após a troca do meio. Observe as células diariamente e verifique a eficiência da transfecção por fluorescência da GFP.
NOTA: Idealmente, a eficiência da transfecção deve ser de >90% pela GFP. Para os outros vírus, deve-se observar claras alterações morfológicas das células 293T, pois elas tendem a se tornar mais redondas ao produzir partículas virais. - Coletar o meio de cada cultura de transfecção de vírus em tubos de 50 mL e girar para baixo para limpar os restos celulares a 1932 x g por 10 min a 4 °C.
- Filtrar cada sobrenadante de lentivírus através de um filtro de seringa de 0,45 μM para remover detritos menores e coletá-los em novos tubos de 50 mL.
- Divida cada sobrenadante de lentivírus em alíquotas de 6 mL e congele cada uma delas em nitrogênio líquido.
- Conservar as alíquotas de lentivírus a -80 °C até estar pronto a utilizar.
2. Reprogramação da transdução de lentivírus
- Descongelar células PDAC primárias e cultura em meio livre de soro de queratinócitos (KSFM) completamente definido, suplementado com extrato de hipófise bovina (BPE), fator de crescimento epidérmico humano recombinante (EGF) a 5 ng/mL e toxina da cólera a 50 ng/mL em incubadora a 37 °C, 5% CO2 e 5% O2 (hipóxia) (ver Tabela de Materiais).
- Descongelar BxPc3, uma linhagem celular de adenocarcinoma ductal pancreático escamoso, e cultura em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (SFC) a 37 °C e 5% de CO2.
- Descongelar células H6C7, células epiteliais ductais pancreáticas e cultura em KSFM suplementado com BPE e EGF a 5 ng/mL, a 37 °C e 5% CO2.
- Descongelamento de fibroblastos humanos (hFib) e cultura em meio essencial mínimo (GMEM) de Glasgow, suplementado com 10% de SFB, 1x aminoácidos não essenciais, 1 mM de piruvato de sódio e 1 mM de glutamina e 0,05 mM (final) de beta-mercaptoetanol a 37 °C e 5% de CO2.
- Um dia antes da transdução do lentivírus (de preferência no final da tarde), prepare dois poços de uma placa de 6 poços contendo 100.000 células por poço de cada uma das células PDAC, BxPc3, H6C7 e hFib. Infecte um poço com lentivírus OSKM e use o segundo como um controle não infectado.
Observação : use uma placa separada para cada tipo de célula. - No dia seguinte, à tarde (aproximadamente 24 h depois), certifique-se de que a confluência celular atinja pelo menos 70% antes de prosseguir para a próxima etapa de infecção por lentivírus.
3. Transdução de lentivírus do PDAC
- Descongelar 5 mL de cada sobrenadante de lentivírus em uma incubadora de vírus a 37 °C.
- Preparar dois tubos de 15 mL, cada um contendo 2 mL de meio de cultura PDAC pré-aquecido.
- Ao primeiro tubo, adicionar 6 mL de cada lentivírus de reprogramação (pSIN4-CMV-K2M e pSIN4-EF1a-O2S) e 12 μL de polibreno 4,5 mg/mL (4,5 μg/mL final, ver Tabela de Materiais) e misturar.
- Ao segundo tubo, adicionar 2 μL de polibreno 4,5 mg/mL (final 4,5 μg/mL).
- Descarte o meio de cada poço e lave uma vez com PBS à temperatura ambiente.
- Adicione o meio de infecção de reprogramação (tubo 1) ao primeiro poço.
- Adicione a mistura do tubo 2 ao segundo poço. Este será o controle de não infectados.
- Incubar as células PDAC em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2 e 5% O2 (hipóxia) durante a noite.
- No dia seguinte, à tarde, descarte o meio de ambos os poços e substitua-o por meio de cultura PDAC fresco.
- Incubar as células a 37 °C, 5% CO2 e 5% O2 (hipóxia) por 48 h.
4. Transdução de lentivírus de células BxPc3
- Descongelar 3 mL de cada sobrenadante de lentivírus em uma incubadora de vírus a 37 °C.
- Preparar dois tubos de 15 mL, cada um contendo 2 mL de meio de cultura BxPc3.
- Ao primeiro tubo, adicionar 3 mL de cada lentivírus de reprogramação (pSIN4-CMV-K2M e pSIN4-EF1a-O2S) e 6 μL de polibreno 4,5 mg/mL (final 4,5 μg/mL) e misturar.
- Ao segundo tubo, adicionar 2 μL de polibreno 4,5 mg/mL (final 4,5 μg/mL).
- Descarte o meio de cada poço e lave uma vez com PBS.
- Adicione o meio de infecção de reprogramação (tubo 1) ao primeiro poço.
- Adicione a mistura do tubo 2 ao segundo poço. Este será o controle de não infectados.
- Incubar as células BxPc3 infectadas a 37 °C de vírus e 5% de CO2 durante a noite.
- No dia seguinte, à tarde, descarte o meio de ambos os poços e substitua-o por meio de cultura BxPc3 fresco.
- Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2 durante 48 h.
5. Transdução de lentivírus da infecção por células H6c7
- Descongelar 4 mL de cada sobrenadante de lentivírus em uma incubadora de vírus a 37 °C.
- Preparar dois tubos de 15 mL, cada um contendo 2 mL de meio de cultura H6c7.
- Ao primeiro tubo, adicionar 4 mL de cada lentivírus de reprogramação (pSIN4-CMV-K2M e pSIN4-EF1a-O2S) e 8 μL de polibreno 4,5 mg/mL (4,5 μg/mL final) e misturar.
- Ao segundo tubo, adicionar 2 μL de polibreno 4,5 mg/mL (final 4,5 μg/mL).
- Descarte o meio de ambos os poços e lave uma vez com PBS.
- Adicione o meio de infecção de reprogramação (tubo 1) ao primeiro poço.
- Adicione a mistura do tubo 2 ao segundo poço. Este será o controle de não infectados.
- Incubar as células H6C7 infectadas a 37 °C do vírus e 5% de CO2 durante a noite.
- No dia seguinte, à tarde, descarte os meios de ambos os poços e substitua-os por um novo meio de cultura H6c7.
- Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2 durante 48 h.
6. Transdução de lentivírus de células hFib
- Descongelar 2 mL de cada sobrenadante de lentivírus em uma incubadora de vírus a 37 °C.
- Preparar dois tubos de 15 mL, cada um contendo 2 mL de meio de cultura de hFib.
- Ao primeiro tubo, adicionar 2 mL de cada vírus de reprogramação (pSIN4-CMV-K2M e pSIN4-EF1a-O2S) e adicionar 4 μL de polibreno 4,5 mg/mL (final 4,5 μg/mL) e misturar.
- Ao segundo tubo, adicionar 2 μL de polibreno 4,5 mg/mL (final 4,5 μg/mL) e misturar.
- Descarte o meio de cada poço e lave uma vez com PBS.
- Adicione o meio de infecção de reprogramação (tubo 1) ao primeiro poço.
- Adicione a mistura do tubo 2 ao segundo poço. Este será o controle de não infectados.
- Incubar as células hFib infectadas a 37 °C e 5% de CO2 durante a noite.
- No dia seguinte, à tarde, descarte o meio de ambos os poços e substitua-o por meio de cultura hFib fresco.
- Incubar as células a 37 °C e 5% de CO2 por mais 48 h.
NOTA: Para uma transdução eficiente de lentivírus, titule a quantidade de lentivírus cuidadosamente, pois isso varia muito entre os diferentes tipos de células. Transduções múltiplas de lentivírus podem ser necessárias para alguns tipos celulares. As linhagens celulares PDAC requerem até três doses, enquanto uma dose foi suficiente para reprogramar as linhagens BxPc3, H6C7 e hFib.
7. Preparação de células alimentadoras iMEF
- Preparar 40 ml de solução de gelatina a 0,2% diluindo a solução-mãe de gelatina a 1% com PBS.
- Revestir quatro placas de 6 poços cobrindo cada poço com 2 mL de solução de gelatina a 0,2%.
- Incubar as placas revestidas com gelatina a 37 °C e 5% de CO2 durante, pelo menos, 30 minutos.
- Aspirar o excesso de solução de gelatina e deixar as placas secar sob a coifa.
- Descongelar dois frascos (~ 4 milhões de células por frasco) de fibroblasto embrionário de rato irradiado (iMEFs) rodopiando-o num banho-maria a 37 °C.
OBS: Para reduzir a possibilidade de contaminação, tenha cuidado para evitar que a água respinge perto da abertura da tampa. Seque o frasco para injetáveis com um papel toalha e pulverize-o com etanol a 70%. - Na capa de cultura de tecidos, pipetar o conteúdo de cada frasco para injetáveis de iMEFs descongelados em um tubo de 15 mL contendo 10 mL de meio de cultura de hFib pré-aquecido em gota a gota e misturar bem invertendo suavemente o tubo.
- Gire a suspensão da célula a 309 x g por 3 min à temperatura ambiente e remova o sobrenadante de cada tubo. Ressuspender cada pastilha celular em meio de 12 mL de hFib.
- Placa de 2 mL da suspensão celular por poço das placas de 6 poços revestidas com gelatina. Distribua uniformemente as células, agitando suavemente as placas em todas as direções.
- Incubar as placas a 37 °C e 5% CO2 durante a noite.
NOTA: Preparar placas iMEF frescas 24 h antes de serem usadas para o experimento de reprogramação.
8. Transferência das células infectadas para a camada alimentadora iMEF
- Descarte a mídia das células PDAC, BxPc3, H6c7 e hFib infectadas e não infectadas. Lave cada poço duas vezes com PBS à temperatura ambiente.
- Dissociar as células da placa adicionando 0,5 mL de tripsina a cada poço. Incubar as células PDAC em estufa a 37 °C, 5% CO2 e 5% O2 (hipóxia) por 15 min.
- Incubar células BxPc3 a 37 °C e 5% CO2 por 5 min.
- Incubar células H6c7 e hFib a 37 °C e 5% CO2 por 4 min.
- Transfira a suspensão de células dissociadas de cada poço para tubos de 15 mL rotulados de acordo como infectados ou não infectados.
- Colher as células por centrifugação da seguinte forma: para PDAC, girar a suspensão celular a 300 x g por 5 min; para BxPc3, girar a suspensão celular a 120 x g por 5 min; para H6C7, girar a suspensão celular a 112 x g por 4 minutos; para hFib, girar a suspensão celular a 161 x g por 3 min. Realizar todas as centrifugações à temperatura ambiente.
- Ressuspender cada pastilha de tipo celular em 1 mL do meio de cultura apropriado.
- Lavar duas vezes as placas iMEF preparadas na etapa 7 com cada meio de cultura de tipo celular. ou seja, lavar uma placa com meio PDAC, uma com meio BxPc3, uma com meio H6C7 e outra com meio hFib.
- Placa de 50.000 células infectadas por poço em cinco poços de placa iMEF de 6 poços. Placa 50.000 células de controle não infectadas no poço restante da placa iMEF de 6 poços.
NOTA: Otimize o número de células infectadas a serem plaqueadas de 1.000 para 50.000 células por poço. - Incubar células PDAC a 37 °C, 5% CO2 e 5% O2 (hipóxia) durante a noite.
- Incubar células BxPc3, H6C7 e hFib a 37 °C e 5% CO2 durante a noite.
- No dia seguinte, prepare o meio de reprogramação da seguinte forma: adicionar 100 mL de soro nocaute de reposição (25% final), 5 mL de glutamina 200 mM (final 1 mM), 5 mL de aminoácidos não essenciais 100x (final 100 μM), 1,5 mL de Beta-mercaptoetanol (0,1 mM final) a 400 mL de Meio Águia Modificado (DMEM).
- Conservar o meio de reprogramação em alíquotas de 100 ml a 4 °C até 4 semanas ou a -20 °C durante mais tempo.
- Quando estiver pronto para uso, adicionar 100 μL de fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) (10 ng/mL final) a uma alíquota de 100 mL de meio de reprogramação.
- Aqueça o meio de reprogramação em banho-maria a 37 °C.
- Lave as células que crescem nos alimentadores iMEFs com meios de reprogramação pré-aquecidos duas vezes.
Adicionar 2 mL de meio de reprogramação a cada poço. - Transfira as placas de reprogramação para uma incubadora a 37 °C, 5% CO2e 3% O2 (hipóxia).
NOTA: O dia em que a mídia de reprogramação é adicionada é considerado o dia 1 da reprogramação. - Alimente as células diariamente com novos meios de reprogramação até que as colônias iPSC comecem a aparecer.
NOTA: Identificar colônias iPSC por sua morfologia ESC-like (colônias compactas com bordas bem definidas e compostas por células com alta relação núcleo/citoplasma). - Monitorar as colônias iPSC diariamente e, após a formação de um número adequado, passá-las como uma piscina.
NOTA: Certifique-se de que as colônias iPSC não se tocam, pois isso resultaria em diferenciação e afetaria sua estabilidade a longo prazo. - Para estabelecer linhas clonais, passe pelo pool iPSC cerca de 5 vezes e, em seguida, escolha colônias robustas que mantenham sua morfologia semelhante à ESC.
- Para identificar colônias iPSC totalmente reprogramadas, realizar coloração viva com TRA-160 (ver Tabela de Materiais) e colher RNA de colônias iPSC para caracterização da expressão gênica.
9. Passagem de colônias iPSC
- Preparar placas alimentadoras iMEF suficientes 24 h antes de passar as colônias iPSC, conforme descrito na etapa 7.
- Lave as placas dosadoras iMEF duas vezes com meios de reprogramação pré-aquecidos.
- Adicionar 2 mL de meio de reprogramação suplementado com inibidor de ROCK (Y2) (10 μM) a cada poço da placa iMEF.
- Incubar as placas iMEF em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2 e 3% O2 até que estejam prontas para uso.
- Preparar a solução de ácido etilenodiaminotetracético/solução salina tamponada com fosfato (EDTA/PBS) diluindo 0,5 M EDTA 1:1000 em PBS (0,5 mM final).
- Substitua o meio de cultura de reprogramação por 0,5 mL de EDTA/PBS em cada poço.
- Incubar em estufa a 37 °C, 5% CO2 e 3% O2 ou à temperatura ambiente, dependendo do tipo celular. As iPSCs BxPc3 e PDAC requerem 15 min de incubação a 37 °C. As iPSCs de H6C7 e hFib precisam ser incubadas à temperatura ambiente por 5 min.
- Verifique as células iPSCs ao microscópio até que elas comecem a se dissociar uniformemente da camada alimentadora em toda a colônia.
- Recolher a suspensão dissociada de células iPSC num tubo de centrifugação de 15 ml. Gire para baixo a 300 x g por 5 min à temperatura ambiente.
- Ressuspender o pellet celular em 1 mL de meio de reprogramação suplementado com Y2 (10 μM).
- Plaquear as células na camada alimentadora iMEF transferindo cada 1 mL de suspensão de células iPSC para três poços da placa iMEF.
NOTA: A razão de divisão pode variar dependendo do número de colônias iPSC colhidas. - Incubar em estufa a 37 °C, 5% CO2 e 3% O2 .
10. Coloração viva de colônias iPSC com TRA-1-60
- Preparar 0,5 mL por poço de 4 μg/mL de anticorpo TRA-1-60 em meios de reprogramação.
- Descarte o meio de reprogramação e substitua-o por 0,5 mL de mistura de anticorpos em cada poço. Incubar em estufa a 37 °C, 5% CO2 e 3% O2 durante 30 min.
- Lave as células duas vezes com a mídia de reprogramação.
- Capture imagens de fluorescência com um sistema de imagem celular usando o filtro GFP.
- Verifique a qualidade da imagem considerando o canal de controle negativo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Imagens representativas mostrando a morfologia de colônias iPSC derivadas de células PDAC, BXPc3, H6C7 e hFib são mostradas na Figura 1. As colônias PDAC-iPSC começaram a se formar no dia 25 de reprogramação. Colônias robustas de iPSC com morfologia ESC-like mais estabelecida foram identificadas no 40º dia de reprogramação (Figura 1). Da mesma forma, a formação de BxPc3-iPSCs começou no dia 23 e se tornou mais estabelecida no dia 35. A formação de H6C7-iPSC foi semelhante à de PDAC-iPSCs e começou a se estabelecer no 45º dia. As colônias hFib-iPSC começaram a se formar no dia 15 de reprogramação.
Figura 1: Imagens representativas das colônias iPSC. As imagens mostram morfologia estabelecida semelhante à hESC derivada de (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 e (D) hFib. Os dias de reprogramação são indicados acima de cada imagem. Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Linhagens clonais de iPSC foram estabelecidas a partir de cada reprogramação de células PDAC, BxPc3, H6C7 e hFib. Todas as linhagens iPSC estabelecidas foram positivas para TRA-1-60, um marcador indiferenciado da superfície celular da hESC, confirmando sua reprogramação para pluripotência (Figura 2).
Figura 2: Imagens representativas das linhas clonais de iPSC. As imagens são derivadas de (A) PDAC, (B) BxPc3, (C) H6c7 e (D) hFib mostrando morfologia ESC-like (painéis superiores) e coloração positiva para TRA-1-60 (painel inferior). Barras de escala = 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Para facilitar o uso da reprogramação iPSC para estudar a progressão do câncer, um protocolo robusto foi estabelecido para reprogramação de células de câncer de pâncreas. A reprogramação de células cancerosas em pluripotência tem se mostrado muito desafiadora até o momento, pois poucos estudos conseguiram gerar iPSCs a partir de células cancerosas32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46 . A maioria desses estudos utilizou linhagens de células cancerosas imortalizadas para gerar linhagens de iPSC, e não células primárias derivadas do paciente 36,37,38,40,42,43,44,46. Por exemplo, a reprogramação de quatro linhagens celulares diferentes de câncer de fígado foi tentada usando a introdução retroviral de fatores OSKM, mas apenas uma única linhagem celular foi reprogramada com sucesso41. No entanto, a linhagem iPSC de câncer de fígado gerada mostrou uma perda de haste após algumas passagens, destacando a alta resistência das células cancerosas à reprogramação de OSKM41. Anteriormente, tentativas foram feitas para reprogramar células PDAC usando a entrega lentiviral de OSKM individualmente; no entanto, apenas uma única linha iPSC foi gerada, dependente da expressão exógena de OSKM e, portanto, não totalmente reprogramada37. Outro estudo usou vetores epissomais para entregar fatores OSKM sem integração genômica, mas só conseguiu gerar um único clone iPSC do PDAC39. O sucesso limitado na reprogramação de células cancerosas se soma aos muitos desafios que dificultam o uso da tecnologia iPSC na pesquisa do câncer.
Aqui, a geração de iPSCs a partir de amostras primárias de PDAC derivadas de dois pacientes diferentes e uma linhagem celular PDAC estabelecida (BxPc3) é explicada. Além disso, iPSCs também foram geradas a partir de H6c7, uma linhagem celular epitelial ductal pancreática. Até onde sabemos, este é o primeiro relato de linhagens iPSC estáveis derivadas com sucesso de BxPc3 e H6c7. Seguindo esse protocolo, iPSCs também foram geradas com sucesso a partir de fibroblastos humanos primários derivados de indivíduos saudáveis, expandindo a aplicabilidade do método para além da pesquisa do câncer.
Um dos elementos-chave por trás do sucesso do protocolo é o uso de vetores lentivirais bicistrônicos para co-expressar fatores OS e KM. Esses vetores contêm o sítio de entrada interno do ribossomo 2 (IRES2) para expressar OCT4 e SOX2 em um vetor e KLF4 e cMYC no outro. Múltiplos estudos utilizando vetores monocistrônicos onde cada fator de reprogramação foi entregue individualmente mostraram que a captação de cada vetor é diferente, afetando a estequiometria OSKM e a eficiência da reprogramação47. O uso de vetores bicistrônicos pode ajudar a mitigar esse problema. Além disso, o uso do IRES em vetores lentivirais mostrou um aumento significativo na eficiência da reprogramação48. Neste sistema lentivírus, a expressão do SO é conduzida pelo promotor EF1a, enquanto a expressão KM está sob o controle de um promotor CMV. Sabe-se que o promotor do CMV pode ser submetido a silenciamento altamente eficiente por metilação do DNA e desacetilação de histonas, ao contrário do EF1a49,50. Portanto, o silenciamento precoce da GC antes da EO durante a reprogramação pode ser um fator chave para o sucesso do protocolo. Isso é consistente com estudos anteriores mostrando a importância da dinâmica de expressão de OSKM durante a reprogramação 51,52,53,54,55. Assim, o vetor bicistrônico também é mais vantajoso que o vetor policistrônico, onde todos os fatores OSKM são expressos a partir de um único promotor56. Outros fatores que contribuem para o sucesso do protocolo incluem as doses de infecção por lentivírus e o número de células infectadas utilizadas para reprogramação, que foram personalizadas para cada tipo celular.
Em resumo, um método otimizado para reprogramação de células PDAC primárias juntamente com outras linhagens celulares e células normais é apresentado. Este método ajudará a expandir o uso da reprogramação iPSC para modelar a progressão do câncer e, neste caso, descobrir biomarcadores PDAC precoces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Acknowledgments
A.S e J.K gostariam de agradecer à Cancer Research UK e à OHSU pelo financiamento (CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A A.S é apoiada por um prêmio de desenvolvimento de carreira da MRC (MR/N024028/1). A.A é financiado por uma bolsa de doutorado (Bolsa ref. 1078107040) da Cidade Rei Abdulaziz para Ciência e Tecnologia. J.K é financiado pelo MRF New Investigator Grant (GCNCR1042A) e Knight CEDAR grant (68182-933-000, 68182-939-000). Agradecemos ao Prof. Keisuke Kaji por gentilmente fornecer o vetor de reprogramação pSIN4-EF1a-O2S e pSIN4-CMV-K2M. Para fins de acesso aberto, o autor aplicou uma licença Creative Commons Attribution (CC BY) a qualquer versão do Manuscrito Aceito pelo Autor decorrente desta submissão.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Thermo Fisher | 31350010 | |
| Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R | BioLegend | 330613 | |
| Bovine Pituitary Extract (BPE) | Thermo Fisher | 13028014 | |
| BxPc3 | ATCC | CRL-1687 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Merck | C8052-1MG | |
| Collagen, Type I solution from rat tail | Merck | C3867 | |
| Completed Defined K-SFM | Thermo Fisher | 10744-019 | |
| Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates | Merck | CLS3516 | |
| Corning syringe filters | Merck | CLS431231 | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Merck | CLS430599 | |
| Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets | Thermo Fisher | 12328667 | |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | D8537 | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Thermo Fisher | 10270-106 | |
| Fugene HD Transfection Reagent | Promega | E2312 | |
| Gelatin solution, Type B, 2% in H2O | Merck | G1393-100ML | |
| Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) | Merck | G5154 | |
| Human EGF Recombinant Protein | Thermo Fisher | PHG0311 | |
| Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech | Thermo Fisher | 100-18B | |
| Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) | Kerafast | ECA001-FP | |
| iMEF feeder cells | iXcells Biotechnologies | 10MU-001-1V | |
| Keratinocyte Serum Free Media (KSFM) | Thermo Fisher | 17005-042 | |
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| KnockOut serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Thermo Fisher | 25030-024 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) | Merck | SLHP033RS | |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Thermo Fisher | 31985062 | |
| pMDG | AddGene | 187440 | |
| Polybrene (Hexadimethrine bromide) | Merck | H9268-5G | |
| pSIN4-CMV-K2M | AddGene | 21164 | |
| pSIN4-EF2-O2S | AddGene | 21162 | |
| psPAX2 | AddGene | 12260 | |
| pWPT-GFP | AddGene | 12255 | |
| RPMI 1640 Medium (ATCC modification) | Thermo Fisher | A1049101 | |
| Sodym Pyruvate | Thermo Fisher | 11360-039 | |
| Sterile Syringes for Single Use (60 mL) | Thermo Fisher | 15899152 | |
| TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red | Thermo Fisher | 12605036 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72304 |
References
- Rahib, L., et al. Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States. Cancer Research. 74 (11), 2913-2921 (2014).
- Hu, J. X., et al. Pancreatic cancer: A review of epidemiology, trend, and risk factors. World Journal of Gastroenterology. 27 (27), 4298 (2021).
- Howlader, N., et al. SEER cancer statistics review, 1975-2013. National Cancer Institute. 19, Bethesda, MD. (2016).
- Bengtsson, A., Andersson, R., Ansari, D. The actual 5-year survivors of pancreatic ductal adenocarcinoma based on real-world data. Scientific Reports. 10 (1), 16425 (2020).
- He, J., et al. 2564 resected periampullary adenocarcinomas at a single institution: trends over three decades. HPB. 16 (1), 83-90 (2014).
- Dusch, N., et al. Factors predicting long-term survival following pancreatic resection for ductal adenocarcinoma of the pancreas: 40 years of experience. Journal of Gastrointestinal Surgery. 18 (4), 674-681 (2014).
- Principe, D. R., et al. The current treatment paradigm for pancreatic ductal adenocarcinoma and barriers to therapeutic efficacy. Frontiers in Oncology. 11, 688377 (2021).
- Papademetrio, D. L., et al. Interplay between autophagy and apoptosis in pancreatic tumors in response to gemcitabine. Targeted Oncology. 9 (2), 123-134 (2014).
- Ng, S. S., Tsao, M. S., Nicklee, T., Hedley, D. W. Effects of the epidermal growth factor receptor inhibitor OSI-774, Tarceva, on downstream signaling pathways and apoptosis in human pancreatic adenocarcinoma 1 supported by the National Cancer Institute of Canada and the Pat Myhal Fund for Pancreatic Cancer Research. Molecular Cancer Therapeutics. 1 (10), 777-783 (2002).
- Sultana, A., et al. Meta-analyses of chemotherapy for locally advanced and metastatic pancreatic cancer. Journal of Clinical Oncology. 25 (18), 2607-2615 (2007).
- Sun, J., Russell, C. C., Scarlett, C. J., McCluskey, A. Small molecule inhibitors in pancreatic cancer. RSC Medicinal Chemistry. 11 (2), 164-183 (2020).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nature Medicine. 22 (8), 851-860 (2016).
- Hruban, R. H., et al. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. The American Journal of Surgical Pathology. 25 (5), 579-586 (2001).
- Maitra, A., Hruban, R. H.
- Vincent, A., Herman, J., Schulick, R., Hruban, R. H., Goggins, M.
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
- Lennon, A. M., et al. The early detection of pancreatic cancer: what will it take to diagnose and treat curable pancreatic neoplasia. Cancer Research. 74 (13), 3381-3389 (2014).
- Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
- Li, C., et al. Identification of pancreatic cancer stem cells. Cancer Research. 67 (3), 1030-1037 (2007).
- Hermann, P. C., et al. Distinct populations of cancer stem cells determine tumor growth and metastatic activity in human pancreatic cancer. Cell Stem Cell. 1 (3), 313-323 (2007).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Suvà, M. L., et al. Reconstructing and reprogramming the tumor-propagating potential of glioblastoma stem-like cells. Cell. 157, 580-594 (2014).
- Kotini, A. G., et al. Stage-specific human induced pluripotent stem cells map the progression of myeloid transformation to transplantable leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
- Stricker, S. H., et al. Widespread resetting of DNA methylation in glioblastoma-initiating cells suppresses malignant cellular behavior in a lineage-dependent manner. Genes Development. 27 (6), 654-669 (2013).
- Chao, M. P., et al. Human AML-iPSCs reacquire leukemic properties after differentiation and model clonal variation of disease. Cell Stem Cell. 20 (3), 329-344 (2017).
- Aparicio, L. A., et al. Clinical implications of epithelial cell plasticity in cancer progression. Cancer letters. 366 (1), 1-10 (2015).
- Grimont, A., Leach, S. D., Chandwani, R. Uncertain beginnings: acinar and ductal cell plasticity in the development of pancreatic cancer. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 13 (2), 369-382 (2022).
- Greenspan, L. J., Weinstein, B. M. To be or not to be: endothelial cell plasticity in development, repair, and disease. Angiogenesis. 24 (2), 251-269 (2021).
- Papapetrou, E. P. Patient-derived induced pluripotent stem cells in cancer research and precision oncology. Nature Medicine. 22 (12), 1392-1401 (2016).
- Zhang, X., Cruz, F. D., Terry, M., Remotti, F., Matushansky, I. Terminal differentiation and loss of tumorigenicity of human cancers via pluripotency-based reprogramming. Oncogene. 32 (18), 2249-2260 (2013).
- Kim, J., et al. An iPSC line from human pancreatic ductal adenocarcinoma undergoes early to invasive stages of pancreatic cancer progression. Cell Reports. 3 (6), 2088-2099 (2013).
- Kim, J., et al. Detection of early pancreatic ductal adenocarcinoma with thrombospondin-2 and CA19-9 blood markers. Science Translational Medicine. 9 (398), (2017).
- Susac, L., et al. Structure of a fully assembled tumor-specific T cell receptor ligated by pMHC. Cell. 185 (17), 3201-3213 (2022).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Carette, J. E., et al. Generation of iPSCs from cultured human malignant cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 115 (20), 4039-4042 (2010).
- Choi, S. M., et al. Reprogramming of EBV-immortalized B-lymphocyte cell lines into induced pluripotent stem cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 118 (7), 1801-1805 (2011).
- Hochedlinger, K., et al. Reprogramming of a melanoma genome by nuclear transplantation. Genes & Development. 18 (15), 1875-1885 (2004).
- Hu, K., et al. Efficient generation of transgene-free induced pluripotent stem cells from normal and neoplastic bone marrow and cord blood mononuclear cells. Blood, The Journal of the American Society of Hematology. 117 (14), e109-e119 (2011).
- Iskender, B., Izgi, K., Canatan, H. Reprogramming bladder cancer cells for studying cancer initiation and progression. Tumor Biology. 37, 13237-13245 (2016).
- Khoshchehreh, R., et al. Epigenetic reprogramming of primary pancreatic cancer cells counteracts their in vivo tumourigenicity. Oncogene. 38 (34), 6226-6239 (2019).
- Kim, H. J., et al. Establishment of hepatocellular cancer induced pluripotent stem cells using a reprogramming technique. Gut and Liver. 11 (2), 261 (2017).
- Lin, S. L., et al. Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotent ES-cell-like state. RNA. 14 (10), 2115-2124 (2008).
- Miyoshi, N., et al. Defined factors induce reprogramming of gastrointestinal cancer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (1), 40-45 (2010).
- Singovski, G., et al. In vivo epigenetic reprogramming of primary human colon cancer cells enhances metastases. Journal of Molecular Cell Biology. 8 (2), 157-173 (2016).
- Zhao, H., et al. A highly optimized protocol for reprogramming cancer cells to pluripotency using nonviral plasmid vectors. Cellular Reprogramming (Formerly" Cloning and Stem Cells". 17 (1), 7-18 (2015).
- Lo, C. A., et al. Quantification of protein levels in single living cells). Cell Reports. 13 (11), 2634-2644 (2015).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
- Prösch, S., et al. Inactivation of the very strong HCMV immediate early promoter by DNA CpG methylation in vitro. Biological Chemistry Hoppe-Seyler. 377 (3), 195-201 (1996).
- Mehta, A. K., Majumdar, S. S., Alam, P., Gulati, N., Brahmachari, V. Epigenetic regulation of cytomegalovirus major immediate-early promoter activity in transgenic mice. Gene. 428 (1-2), 20-24 (2009).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Chronis, C., et al. Cooperative binding of transcription factors orchestrates reprogramming. Cell. 168 (3), 442-459 (2017).
- Li, D., et al. Chromatin accessibility dynamics during iPSC reprogramming. Cell Stem Cell. 21 (6), 819-833 (2017).
- Soufi, A., Donahue, G., Zaret, K. S. Facilitators and impediments of the pluripotency reprogramming factors' initial engagement with the genome. Cell. 151 (5), 994-1004 (2012).
- Carey, B. W., et al. Reprogramming of murine and human somatic cells using a single polycistronic vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 157-162 (2009).
