Summary
Questo articolo presenta un protocollo semplificato per stabilire un modello di pulpite nei topi utilizzando un innovativo bavaglio orale, seguito da una successiva analisi istologica.
Abstract
La pulpite, una causa comune di perdita naturale dei denti, porta alla necrosi e alla perdita di bioattività nella polpa dentale infiammata. Svelare i meccanismi alla base della pulpite e il suo trattamento efficace è un obiettivo costante della ricerca endodontica. Pertanto, comprendere il processo infiammatorio all'interno della polpa dentale è fondamentale per migliorare la conservazione della polpa. Rispetto ad altri esperimenti in vitro , un modello di pulpite murina offre un contesto più autentico e geneticamente diversificato per osservare la progressione patologica della pulpite. Tuttavia, l'uso dei topi, nonostante la loro economicità e accessibilità, pone difficoltà a causa delle loro piccole dimensioni, scarsa coordinazione e bassa tolleranza, complicando le procedure intraorali e dentistiche. Questo protocollo introduce un nuovo design e l'applicazione di un bavaglio per esporre la polpa di topo, facilitando procedure intraorali più efficienti. Il bavaglio, composto da un'arcata dentale prontamente disponibile per la maggior parte dei dentisti, può accelerare notevolmente la preparazione chirurgica, anche per le prime procedure. La micro-CT, la colorazione con ematossilina-eosina (HE) e la colorazione in immunofluorescenza sono state utilizzate per identificare i cambiamenti nella morfologia e nell'espressione cellulare. Lo scopo di questo articolo è quello di aiutare i ricercatori a stabilire una procedura più riproducibile e meno impegnativa per la creazione di un modello di infiammazione della polpa utilizzando questo nuovo bavaglio.
Introduction
La polpa dentale, parte integrante del dente, è responsabile di molteplici funzioni essenziali come l'apporto di nutrienti, la formazione della dentina, la funzione sensoriale e le reazioni di difesa1. Tuttavia, la polpa dentale, circondata da tessuto duro, è suscettibile di lesioni e danni da carie profonde, pulpiti, traumi o terapie successive 2,3. L'assenza di polpa dentale funzionale aumenta il rischio di fragilità dei denti4. Inoltre, la perdita di vitalità della polpa nei denti permanenti giovani può influire negativamente sulla maturazione dei denti e le attuali tecniche di protesi non riescono a ripristinare il feedback neurale offerto dalla polpa sana4. Questa situazione ha portato i ricercatori a esplorare soluzioni alternative per la gestione della polpa infiammata oltre la semplice rimozione.
Nel 2007, Murray et al. hanno avviato l'applicazione dell'ingegneria tissutale nell'endodonzia rigenerativa, suscitando così un crescente interesse per la conservazione e la rigenerazione della polpa5. Tuttavia, il tessuto pulpare infiammato rappresenta una sfida poiché le cellule rilasciano fattori infiammatori come l'IL-6, che reclutano le cellule infiammatorie e provocano necrosi cellulare, perdita di vitalità della polpa e complicazioni nel recupero funzionale 6,7. Comprendere l'infiammazione e la morte cellulare associata è, quindi, fondamentale per i progressi nella conservazione della polpa vitale. Ci sono una serie di esperimenti che sono stati condotti per esplorare la biologia molecolare della polpa infiammata in vivo o in vitro 8,9. Sebbene gli esperimenti in vitro come le colture cellulari 2D o 3D siano stati sviluppati per anni e stiano diventando maturi e ampiamente utilizzati per testare le reazioni delle cellule pulpari ai fattori infiammatori, questi esperimenti non possono riflettere l'interazione tra il tessuto pulpare e il sistema immunitario sistemico10. Se il fenomeno studiato deriva da cellule di altra origine tissutale come il sistema immunitario, vascolare e nervoso, allora la coltura di cellule di polpa pura porterà a un vicolo cieco. Pertanto, gli esperimenti in vivo sono molto necessari e referenziali.
I topi sono diventati sempre più una scelta comune nella ricerca sull'infiammazione in vivo grazie al loro rapporto costo-efficacia, all'elevata fertilità e alla vitalità. Tuttavia, attualmente manca un protocollo completo per il modello di pulpite dei topi, che possa fungere da riferimento. Le piccole dimensioni dei topi e la loro sensibilità alla stimolazione pongono sfide significative durante le procedure sperimentali. L'osservazione dei minuscoli denti nascosti in profondità all'interno della bocca del topo richiede spesso l'uso di un microscopio a sbalzo, nonostante la presenza più comune di microscopi da tavolo nei laboratori. L'assenza di un apribocca richiede l'assistenza di altri. Per affrontare questo problema, il gruppo ha ideato un bavaglio orale utilizzando materiali prontamente disponibili che mira a fornire un protocollo standardizzato e riproducibile per la costruzione del modello di pulpite dei topi. Questo articolo descrive in dettaglio la procedura, coprendo la preparazione preoperatoria, l'immobilizzazione, la chirurgia dell'esposizione della polpa e la raccolta di campioni su topi C57. Questo protocollo raccomanda l'uso del bavaglio, fornendo informazioni sulla sua struttura, produzione e applicazione per facilitare altri ricercatori nella replica della procedura.
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Protocol
Le procedure sperimentali in questo studio sono state approvate dal comitato etico della West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2021-125). I topi adulti C57BL/6 sono stati ottenuti dalla Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, Cina. L'intera corona del primo molare mascellare erutta 21 giorni dopo la nascita. I topi per l'intervento chirurgico dovrebbero avere più di 21 giorni con una vitalità normale11. Qui, per la modellazione venivano utilizzati topi di età compresa tra 6 e 8 settimane. La Figura 1 è un diagramma di flusso che mostra il protocollo utilizzato.
1. Preparazione preoperatoria (Figura 2)
- Procurarsi i seguenti strumenti: microscopio stereoscopico, piastra di fissaggio, nastro medicale, bavaglio orale, fresa dentale minimamente invasiva con un diametro di 0,6 mm, manipolo dentale ad alta velocità, lima 8# C+, termoforo, siringa da 1 ml, batuffolo di cotone sterile, pinza oculare.
- Ottenere i seguenti farmaci: miscela per anestesia, unguento veterinario.
2. Preparazione del bavaglio
- Pesare e anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di una soluzione di miscela per anestesia (10% ketamina cloridrato + 5% xilazina + 85% soluzione salina isotonica sterile) a 0,007 ml/g di peso corporeo e confermare la corretta anestesia attraverso il metodo del pizzicamento delle dita. Applicare un unguento lubrificante oftalmico sugli occhi per evitare lesioni agli occhi dovute all'essiccazione durante il funzionamento.
NOTA: Sono necessari cappelli medici, maschere, guanti e tute e altre protezioni di base. Assicurati che sia l'ambiente chirurgico che la camera del mouse siano puliti e sicuri. È necessario un cuscinetto termico per il supporto termico durante tutta la procedura. - Preparare il bavaglio come descritto di seguito (Figura 3).
- Procurarsi i seguenti materiali: filo ortodontico per arco con diametro di 8 μm, pinza per piegare ad anello giovane, tronchese pesante, pennarello, cappuccio in gomma con una lunghezza di 3 mm e un diametro della sezione trasversale di 1 mm.
- Per prima cosa, raddrizza il filo dell'arco con la mano sinistra per il fissaggio e il pollice, l'indice della mano destra si piega leggermente contro l'arco del filo. Ripeti questa azione più volte, faciliterà la flessione al corretto angolo tridimensionale.
- Utilizzare la pinza piegatrice ad anello Yong per piegare il bordo superiore (Figura 3G, a-i) del trapezio (Figura 3C, a-l-k-b) lungo circa 8 mm nel punto medio del filo dell'arco. Assicurarsi che il punto a (Figura 3) si trovi sul bordo del becco della pinza.
- Tenere le pinze con la mano sinistra, bloccare l'estremità libera del filo dell'arco con il pollice e l'indice destro e piegare il filo dell'arco dal punto a per formare un angolo di circa 120°. Duplicare l'azione precedente nel punto i (Figura 3G). Controlla se il filo dell'arco è su un piano mettendolo su un tavolo orizzontale senza fare leva.
- Lasciare circa 9 mm di lunghezza su ciascun lato (Figura 3D, a-b, l-k) e piegare l'estremità libera a un angolo di 75° utilizzando la stessa abilità del passaggio 2.2.4, assicurandosi che ogni bordo sia su un piano. Piega questo angolo acuto con la punta del becco della pinza.
- Trova il punto c a circa 5 mm dal punto b. Segui la stessa abilità per piegare un angolo di 105° sul punto c. Piegare un altro angolo di 105° al punto d a 5 mm dal punto c. Lasciare circa 4,5 mm dal punto d e trovare il punto e. Piegare l'estremità libera nel punto e per formare un angolo di circa 100 -105° (Figura 3E).
NOTA: I topi C57 di 6-8 settimane che abbiamo usato erano di circa 20 g. La spaziatura di 5 mm non solo poteva inceppare le mascelle superiore e inferiore dei topi senza muoversi, ma non premeva nemmeno la pelle dei topi e causava disagio. Se vengono utilizzate altre specie o età di topi, regolare la lunghezza delle parti cd e ih in base alla situazione reale (Figura 3E, G). - Piegare un abbassalingua in più per la parte mandibolare (Figura 3G, j-i-h-g).
- Duplicare i passaggi di piegatura della parte a-b-c sulla parte l-k-j. Bloccare contemporaneamente le parti i-k e k-j e piegare l'estremità libera nel punto j per renderla verticale rispetto al piano i-k-j. Clamp il punto i che si trova a 5 mm dal punto j, piegare l'estremità libera per renderla parallela sia al piano i-k-j che alla parte c-d (Figura 3H).
- Lasciare 5 mm di lunghezza dal punto i, al punto h, piegare l'arco verticalmente alla parte i-h e parallelamente al piano j-i-h. Trova il punto g a 5 mm dal punto h. Bloccare il piano j-i-h-g e piegare l'estremità libera simmetricamente alla parte k-j. Quindi l'estremità libera dopo il punto f dovrebbe essere simmetrica al punto e-estremità libera (Figura 3H).
- Mettere i cappucci di gomma sull'estremità libera (Figura 3F).
3. Immobilizzazione
- Fissare il mouse supino sulla piastra di fissaggio con gli arti fissati con nastro adesivo. Comprimere le estremità libere del bavaglio con il pollice e l'indice.
- Fissare gli incisivi anteriori del mouse nella scanalatura trapezoidale di due bracci. Assicurarsi che il braccio con abbassalingua sia per la mandibola. Regola il bavaglio per assicurarti che la lingua del topo sia immobilizzata ma non ischemica.
4. Valutazione dei denti
- Assicurarsi che il primo molare mascellare per l'intervento chirurgico sia privo di carie dentali, traumi e odontogenesi. Assicurarsi che non vi siano arrossamenti, gonfiori o fistole sulla gengiva circostante. Assicurati che i denti opposti siano sani e disponibili ad agire come gruppo di controllo sano.
5. Esposizione alla polpa
- Utilizzare la fresa dentale per perforare il lato occlusale del primo molare mascellare a una velocità di 20.000 giri/min. Assicurarsi che lo smalto sia stato rimosso. Mantenere l'operazione con il manipolo dentale solo in uno strato superficiale di dentina per evitare un'eccessiva stimolazione termica sul tessuto pulpare dentale12.
- Allo stesso tempo, prevenire il surriscaldamento utilizzando una siringa per far cadere la soluzione fisiologica normale sul dente ogni 3 minuti durante l'operazione.
- Mettere una lima C+ 8# o 10# nella posizione più bassa della fossa perforata e perforare l'ultima dentina per esporre la camera pulpare. Sarà un'evidente sensazione di caduta quando la dentina locale sarà completamente rimossa. Non pompare troppo in profondità, altrimenti il tessuto pulpare dentale potrebbe essere portato fuori dalla camera pulpare.
- Pulisci i frammenti intorno al dente. Togliete il bavaglio; L'intervento è terminato. Utilizzare il primo molare mascellare opposto come controllo senza operazione.
6. Assistenza post-operatoria
- Dopo l'intervento chirurgico, somministrare carprofene (5 mg/kg) per via sottocutanea e posizionare il mouse sul termoforo chemiotermico in posizione prona fino al recupero dall'anestesia. Dai da mangiare ai topi e fornisci acqua potabile. Il processo di recupero deve essere supervisionato. Nessun altro animale dovrebbe trovarsi nella stessa camera fino a quando il topo non si sarà completamente ripreso.
7. Raccolta e conservazione dei campioni
- Eutanasia del topo con lussazione cervicale in condizioni di anestesia profonda 24 ore dopo l'operazione o in qualsiasi altro momento come da esperimento9. Tagliare i muscoli dello scheletro attaccati alla mascella e allo zigoma con le forbici oftalmiche. Rimuovere lo scheletro, l'osso frontale e i tessuti molli ed estrarre la lamina gnatostegite con i molari mascellari.
NOTA: Secondo He et al., si raccomanda che il campione di pulpite debba essere raccolto meno di 72 ore dopo l'intervento chirurgico per evitare un'estesa necrosi nel tessuto pulpare dentale13. - Dividere agittalmente la gnatostegite a metà e conservare il tessuto in paraformaldeide al 4% in PBS, pH 7,4, a 4 °C per fissazione 24h.
8. Analisi istologica
- Lavare il tessuto con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e decalcificarlo in una soluzione decalcificante cambiata giornalmente al 5% di EDTA e 4% di saccarosio in PBS, pH 7,4, a 4 °C per 2-4 settimane10.
- Incorporare 1/2 gnathostegite nella paraffina e assicurarsi che la faccia sagittale senza denti sia sul fondo delle cassette di tessuto.
- Tagliare il blocco di paraffina a fette spesse 5 μm con un microtomo di paraffina. Regolare l'angolo del blocco di paraffina in base alla relazione prossimale, distale, superiore e inferiore osservata al microscopio per garantire che la polpa della corona completa e la perforazione del primo molare possano essere tagliate.
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Representative Results
La procedura sopra descritta è stata eseguita sul primo molare mascellare destro di topi C57BL/6 di 3, 6-8 settimane, mentre i primi molari mascellari sinistri sono stati conservati come controllo. Per la dimostrazione sono stati utilizzati i risultati istologici e di immunofluorescenza del controllo in bianco, campioni di pulpite di 12 ore e pulpite di 24 ore.
Seguendo il protocollo di analisi TC di Goldman et al.15, l'esposizione alla polpa è stata confermata attraverso la micro-CT e la modellazione della ricostruzione nella Figura 4 A-C. Le fette sagittali dei primi molari mascellari, sia dal lato di controllo che da quello chirurgico, sono state sottoposte a colorazione HE (Figura 5). Sono state mostrate necrosi del tessuto pulpare e disintegrazione della morfologia cellulare al margine della ferita. La necrosi era concentrata principalmente nel tessuto pulpare vicino alla perforazione e la forma del tessuto pulpare sul lato non aperto era normale. A 24 ore, la maggior parte dei tessuti pulpari, compresa la polpa radicale, erano morfologicamente intatti. (Figura 5).
L'espressione di IL-614 era bassa nel controllo e una piccola quantità di IL-6 poteva essere osservata intorno alla ferita a 12 ore, mentre l'espressione di IL-6 era significativamente aumentata a 24 ore. Inoltre, l'espressione di IL-6 era concentrata principalmente nel margine della ferita e nel corno della polpa media (Figura 6). Nella Figura 6 D,E, il numero di cellule della polpa dentale IL-6+ e il rapporto tra le cellule IL-6+ e le cellule della polpa dentale totale aumentano nel tempo in tre punti temporali. Si può considerare che l'area sviluppi gradualmente l'infiammazione e si aggravi dopo l'esposizione alla polpa.
Abbiamo invitato 5 colleghi che non hanno mai eseguito interventi chirurgici sui denti mascellari di topi C57 a calcolare il tempo necessario per immobilizzare la mascella superiore e inferiore del topo (Stadio 1) ed esporre il primo molare mascellare del topo (Stadio 2) seguendo la procedura tradizionale con due elastici facendo riferimento al protocollo pubblicato da Goldman et al. o al nostro protocollo con il bocca-bavaglio15. Per l'analisi è stato calcolato anche il tempo necessario per posizionare correttamente la fresa sul primo molare mascellare del topo al microscopio. I risultati nella Figura 3 J,K hanno suggerito che il tempo di fissazione della bocca e di ricerca del primo molare mascellare dei topi con il bavaglio della bocca erano significativamente più brevi rispetto al modo tradizionale (P<0,05). L'uso del bavaglio orale può migliorare l'efficienza operativa e ridurre la difficoltà operativa.
Figura 1: Diagramma di flusso della procedura di esposizione della polpa. (A) Dopo la fissazione con il bavaglio, il primo molare mascellare del topo deve essere completamente esposto al microscopio. (B) Utilizzare un manipolo dentale ad alta velocità con fresa dentale minimamente invasiva per rimuovere lo smalto occlusale e la dentina superficiale del primo molare, ma fare attenzione a non penetrare direttamente nella dentina per evitare un'eccessiva influenza sulla polpa causata dal surriscaldamento. (C) Utilizzare una lima 8# C+ per penetrare nella dentina rimanente ed esporre la polpa. (D) I campioni sono stati raccolti 24 ore dopo l'intervento chirurgico. L'HE e la colorazione in immunofluorescenza hanno dimostrato che un modello di pulpite poteva essere stabilito in questo momento. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Attrezzatura per la procedura di esposizione della polpa. (A) Microscopio stereoscopico e motore del manipolo dentale dentale ad alta velocità. (B) La lima 8# C+, fresa dentale minimamente invasiva, bavaglio orale, pinzette e manipolo dentale dentale ad alta velocità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Realizzazione del bavaglio. (A) Piegare il filo per formare due bracci funzionanti del bavaglio. (B-C) Passaggi di piegatura della spatola della lingua per la mandibola. (D-E) Nessuna spatola per la lingua per la mascella. (F, H) Sono necessari cappucci di gomma o estremità piegate per proteggere le lesioni dalla puntura. (G) Tre punti di vista del bavaglio per riferimento. (I) Uso clinico del bavaglio orale. (J) Il tempo medio per i principianti per fissare la mascella superiore e inferiore (Fase 1) utilizzando rispettivamente il metodo di fissazione tradizionale e il bavaglio. (K) Il tempo medio impiegato dai principianti per trovare chiaramente il primo molare mascellare (stadio 2) utilizzando rispettivamente il metodo di fissazione tradizionale e il bavaglio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi micro-CT del molare del pugno operato con perforazione contrassegnata da una linea tratteggiata rossa. (A) Piano sagittale del dente, assicurarsi che non esista alcuna perforazione sul pavimento della camera pulpare. (B) Piano coronale. In corrispondenza della perforazione in (A), si può osservare la penetrazione completa della dentina dello smalto cerchiata con una linea tratteggiata rossa. (C) Piano occlusale del modello di ricostruzione TC. La posizione della perforazione cerchiata con una linea tratteggiata rossa è confermata in modo più intuitivo e il pavimento della camera pulpare può essere osservato attraverso la perforazione. (D-G) Foto intraoperatorie del trattamento. (D) Controllare il primo molare mascellare del topo per assicurarsi che non vi siano carie o malformazioni. (E) Utilizzo di una fresa minimamente invasiva per rimuovere lo smalto e la dentina superficiale. Come si può vedere nell'immagine, si può osservare una fossa (cerchiata con una linea bianca tratteggiata) sulla faccia occlusale del dente senza perforazione. (F) Utilizzando la lima 8# C+ per penetrare nella dentina rimanente, la lima può rimanere bloccata nel dente senza supporto per le mani. (G) Quando la lima viene rimossa, il dente presenta una perforazione rosa, che indica l'avvenuta esposizione della polpa. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Colorazione con ematossilina-eosina. (A) Visione olistica del primo molare non trattato per il controllo. (A-1,2,3) Valori ad alto ingrandimento corrispondenti a 1, 2, 3 pollici nel pannello (A). La forma del tessuto pulpare dentale in 3 posizioni era intatta e gli odontoblasti erano disposti in modo ordinato. (B) Visione olistica dei denti 12 ore dopo l'intervento chirurgico. (B-1,2,3) Valori ad alto ingrandimento corrispondenti a 1, 2, 3 pollici nel pannello (B). La forma del tessuto pulpare dentale in posizione 1 e 2 era generalmente intatta. La necrosi poteva essere osservata vicino alla perforazione. (C) Visione olistica dei denti 24 ore dopo l'intervento chirurgico. (C-1,2,3) Valori ad alto ingrandimento corrispondenti a 1, 2, 3 pollici nel pannello (C). La necrosi si estende da un singolo corno pulpare al tessuto pulpare vicino. Ma la maggior parte dei tessuti pulpare, compresa la polpa radicale, sono morfologicamente intatti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Colorazione in immunofluorescenza. (A) Visione olistica del primo molare non trattato per il controllo. (A-1,2,3) Valori ad alto ingrandimento corrispondenti a 1, 2, 3 pollici nel pannello (A). Non è stato osservato quasi nessuna espressione di IL-6. (B) Visione olistica dei denti 12 ore dopo l'intervento chirurgico. (B-1, 2, 3) Valori ad alto ingrandimento corrispondenti a 1, 2, 3 pollici nel pannello (B). Aumento dell'IL-6 concentrato nel tessuto vicino alla perforazione mostrata in B-3. Non sono stati osservati cambiamenti evidenti in B-1,2. (C) Visione olistica dei denti 24 ore dopo l'intervento chirurgico. (C-1, 2, 3) Valori ad alto ingrandimento corrispondenti a 1, 2, 3 pollici nel pannello (C). L'espressione di IL-6 è risultata significativamente aumentata nel C-2,3. (D) Quantità totale di cellule pulpari dentali IL-6+ in controllo, 12 ore di esposizione alla polpa, 24 ore di esposizione alla polpa e risultati di colorazione in immunofluorescenza. (E) Rapporto tra le cellule IL-6+ e la quantità totale di cellule della polpa dentale nel controllo, 12 ore di esposizione alla polpa, 24 ore di esposizione alla polpa e risultati della colorazione in immunofluorescenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Essendo il tessuto molle solitario all'interno dei denti, la polpa dentale svolge un ruolo cruciale nel mantenimento della bioattività del dente, ma rimane altamente sensibile. La conservazione di questa polpa vitale è diventata l'approccio iniziale preferito nei recenti trattamenti endodontici, richiedendo una comprensione completa dei meccanismi infiammatori della polpa dentale16. La fluttuazione spazio-temporale del microambiente infiammatorio e le interazioni tra i tipi di cellule residenti nella pulpite complicano la sua indagine attraverso studi in vitro 11. Invece, gli studi in vivo offrono benefici replicando l'ambiente fisiologico trovato negli esseri umani. L'utilizzo di topi sperimentali, in particolare quelli con geni sovraespressi o abbattuti, fornisce uno strumento efficace per la convalida delle ipotesi. I topi C57 frequentemente utilizzati nei laboratori, tuttavia, pongono sfide a causa delle loro piccole dimensioni e della mancanza di coordinazione, rendendo problematica l'applicazione di stimoli ai loro denti17. Per affrontare questo problema, è necessaria una spiegazione completa del nuovo bavaglio orale per aiutare i ricercatori a eseguire procedure all'interno delle cavità orali dei topi. Inoltre, questo articolo delinea il protocollo per stabilire un modello di pulpite attraverso l'esposizione della polpa sul primo molare del topo utilizzando il bavaglio, offrendo così una guida preziosa per la ricerca successiva.
Dopo numerose iterazioni, è stato progettato con successo un bavaglio scalabile e semplice da costruire. Le dimensioni e uno schema a tre viste del bavaglio della bocca sono fornite nella Figura 3. Il protocollo ha semplificato notevolmente il processo di piegatura del filo adottando un design trapezoidale al posto di un arco. Il bavaglio utilizza un filo dell'arco ortodontico di 0,8 mm di diametro, che bilancia la necessità di prevenire lo scivolamento dalla bocca del topo e fornisce una forza di apertura sufficiente. Inoltre, l'elasticità del filo dell'arco ortodontico salvaguarda l'articolazione temporo-mandibolare dei topi. Il bavaglio è compatto, resistente alla corrosione e può essere conservato in una provetta da centrifuga da 50 ml con alcol per un uso ripetuto. Nonostante la pressione del morso di un topo, il bavaglio rimane stabile in bocca, consentendo ai ricercatori di operare senza assistenza al microscopio. Va notato che le dimensioni del bavaglio possono essere regolate per adattarsi alle diverse dimensioni del corpo del mouse. Se la bocca è allungata oltre il limite del topo, il bavaglio deve essere immediatamente rimosso per evitare lesioni all'articolazione temporo-mandibolare (TMD) o ai muscoli maxillo-facciali.
Il rapporto di He et al. indica che la necrosi può essere rilevata 24 ore dopo l'esposizione alla pulpa, con la maggior parte del tessuto pulpare che diventa necrotico dopo 72 ore18. Pertanto, è essenziale raccogliere il tessuto pulpare entro questa finestra di 72 ore per evitare conclusioni sperimentali non valide a causa di un eccesso di cellule morte. Quando si inserisce la lima C+ nella camera pulpare, è necessario evitare rotazioni ripetute e spinte profonde per evitare danni eccessivi al tessuto pulpare. Se si verifica un forte sanguinamento durante la procedura, si consiglia di rimuovere delicatamente il sangue utilizzando un batuffolo di cotone per evitare la tosse. L'operazione deve essere eseguita solo su un lato della mascella del topo a causa del potenziale impatto negativo sull'accuratezza del modello derivante dalla modellazione simultanea su entrambi i lati, che può causare complicazioni dell'assunzione dietetica. Dopo l'intervento chirurgico, si consiglia di non somministrare farmaci antinfiammatori o antibiotici ai topi.
Il bavaglio, pur essendo efficace nel mantenere aperta la bocca del topo, presenta limitazioni riguardanti il sito chirurgico. I denti posteriori mandibolari, protetti dalla lingua premuta con un abbassalingua, spesso non sono chiaramente visibili. Pertanto, la procedura è adatta solo per operazioni sui denti mascellari o sui denti anteriori mandibolari. Se l'intervento supera i 20 minuti, si consiglia di dare al topo una pausa ogni 10 minuti poiché la stabilità del bavaglio dipende dall'antagonismo della forza occlusale dei topi. I topi C57, scelti per la loro rapida riproduzione e disponibilità, sono sensibili a vari stimoli; Quindi, una leggera overdose di farmaci o stimoli può essere letale. Inoltre, le piccole dimensioni dei loro denti richiedono un livello di abilità più elevato per l'affettatura dei tessuti.
In conclusione, l'infiammazione e la necrosi pulpare rappresentano sfide pressanti nella rigenerazione pulpare. Questo studio offre una dimostrazione completa della creazione di un modello di pulpite nei topi, con risultati di immunofluorescenza che verificano i fattori infiammatori. Questo articolo propone un nuovo e comodo design del bavaglio per la bocca, che fornisce all'operatore una vista senza ostacoli mantenendo la bocca del mouse aperta senza interferenze con la lingua. Tuttavia, le operazioni sui denti posteriori mandibolari rimangono una sfida. Considerando i vantaggi dell'utilizzo di topi sperimentali, la modellazione endodontica nei topi è molto promettente e si prevede di anticipare ulteriori riduzioni della soglia tecnica.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China U21A20368 (L. Y.), 82101000 (H. W.) e 82100982 (F. L.) e dal Sichuan Science and Technology Program 2023NSFSC1499 (H. W.). Tutti i dati e le immagini originali sono inclusi in questo documento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| C57/B6J mice | Gempharmatech Experimental Animals Company | C57/B6J | For the establishment of pulp exposure |
| Equipment | |||
| 1 mL syringe | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD. | SB1-074(IV) | Apply in drug injection. |
| 8# C+ file | Readysteel | 0010047 | Apply in exposing the roof of pulp chamber. |
| Anesthesia Mix solution | 10% ketamine hydrochloride+ 5% xylazine + 85% sterile isotonic saline. | ||
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | Apply in immunofluorescence staining for counter-staining of nucleus. |
| Dental high-speed dental handpiece | Jing yuan electronic commerce technology | WJ-422 | Apply in pulp exposure. |
| Heavy wire cutter | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | none | Apply inarc cutting. |
| Hematoxylin and Eosin Stain kit | Biosharp | BL700B | For the histological analysis of the slides. |
| IL-6 antibody | Novus | NBP2-89149 | Apply in immunofluorescence staining to detect the inflammation of the dental pulp. |
| Ketamine(Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | 100mg/kg, IP. Apply in nesthetization. |
| Medical tap | 3M | 1530 | Apply in mice immobilization. |
| Orthodontic arch wire | Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD. | K417 | Diameter of 8µm |
| Round dental burr (0.6 mm) | Shofu global | 072208 | Apply in removing enamel and shallow layer of dentin. |
| Young loop bending plier | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | none | Apply in arc bending. |
References
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