Estabelecimento de um modelo de exposição à polpa murina com uma nova mordaça bucal para pesquisa de pulpite

Summary

Este artigo apresenta um protocolo simplificado para estabelecer um modelo de pulpite em camundongos usando um mordaça bucal inovador, seguido de análise histológica subsequente.

Abstract

A pulpite, uma causa comum de perda natural do dente, leva à necrose e perda de bioatividade na polpa dentária inflamada. Desvendar os mecanismos subjacentes à pulpite e seu tratamento eficiente é um foco contínuo da pesquisa endodôntica. Portanto, entender o processo inflamatório dentro da polpa dentária é vital para melhorar a preservação da polpa. Comparado a outros experimentos in vitro , um modelo de pulpite murina oferece um contexto mais autêntico e geneticamente diverso para observar a progressão patológica da pulpite. No entanto, o uso de camundongos, apesar de sua relação custo-benefício e acessibilidade, apresenta dificuldades devido ao seu pequeno tamanho, má coordenação e baixa tolerância, dificultando os procedimentos intrabucais e odontológicos. Este protocolo apresenta um novo design e aplicação de uma mordaça bucal para expor a polpa do camundongo, facilitando procedimentos intraorais mais eficientes. A mordaça bucal, composta por uma arcada dentária prontamente disponível para a maioria dos dentistas e pode agilizar significativamente a preparação cirúrgica, mesmo para procedimentos iniciais. Micro-CT, coloração de hematoxilina-eosina (HE) e coloração de imunofluorescência foram usadas para identificar alterações na morfologia e expressão celular. O objetivo deste artigo é ajudar os pesquisadores a estabelecer um procedimento mais reprodutível e menos exigente para criar um modelo de inflamação pulpar usando esta nova mordaça bucal.

Introduction

A polpa dentária, parte integrante do dente, é responsável por múltiplas funções essenciais, como fornecimento de nutrientes, formação de dentina, função sensorial e reações de defesa¹. No entanto, a polpa dentária, circundada por tecido duro, é suscetível a lesões e danos causados por cárie profunda, pulpite, trauma ou terapias subsequentes ^2,3. A ausência de polpa dentária funcional aumenta o risco de fragilidade dentária⁴. Além disso, a perda de vitalidade pulpar em dentes permanentes jovens pode afetar adversamente a maturação dentária, e as técnicas atuais de prótese dentária não conseguem restaurar o feedback neural oferecido pela polpa saudável⁴. Essa situação levou os pesquisadores a explorar soluções alternativas para o manejo da polpa inflamada além da mera remoção.

Em 2007, Murray et al. iniciaram a aplicação da engenharia de tecidos na endodontia regenerativa, despertando assim um interesse crescente na preservação e regeneração pulpar⁵. No entanto, o tecido pulpar inflamado representa um desafio, pois as células liberam fatores inflamatórios, como a IL-6, que recrutam células inflamatórias e resultam em necrose celular, perda de vitalidade pulpar e complicações na recuperação funcional ^6,7. Compreender a inflamação e a morte celular associada é, portanto, crucial para avanços na preservação da polpa vital. Há uma série de experimentos que foram conduzidos para explorar a biologia molecular da polpa inflamada in vivo ou in vitro ^8,9. Embora experimentos in vitro como culturas de células 2D ou 3D tenham sido desenvolvidos há anos e estejam se tornando maduros e amplamente utilizados para testar reações de células pulpares a fatores inflamatórios, esses experimentos não podem refletir a interação entre o tecido pulpar e o sistema imunológico sistêmico¹⁰. Se o fenômeno que está sendo estudado for derivado de células de outra origem tecidual, como sistema imunológico, vascular e nervoso, a cultura de células pulpares puras levará a um beco sem saída. Portanto, experimentos in vivo são muito necessários e referenciais.

Os camundongos têm se tornado cada vez mais uma escolha comum na pesquisa de inflamação in vivo devido à sua relação custo-benefício, alta fertilidade e vitalidade. No entanto, um protocolo abrangente para o modelo de pulpite de camundongos está ausente atualmente, o que pode servir como referência. O pequeno tamanho dos camundongos e sua sensibilidade à estimulação representam desafios significativos durante os procedimentos experimentais. Observar os dentes minúsculos escondidos profundamente na boca do camundongo geralmente requer o uso de um microscópio cantilever, apesar da presença mais comum de microscópios de mesa em laboratórios. A ausência de um abridor de boca requer ajuda de outras pessoas. Para resolver isso, o grupo desenvolveu uma mordaça bucal usando materiais prontamente disponíveis que visa fornecer um protocolo padronizado e reprodutível para a construção do modelo de pulpite de camundongos. Este artigo detalha o procedimento, abrangendo preparação pré-operatória, imobilização, cirurgia de exposição pulpar e coleta de amostras em camundongos C57. Esse protocolo recomenda o uso da mordaça bucal, fornecendo informações sobre sua estrutura, produção e aplicação para facilitar a replicação do procedimento por outros pesquisadores.

Protocol

Os procedimentos experimentais neste estudo foram aprovados pelo comitê de ética da Escola de Estomatologia da China Ocidental, Universidade de Sichuan (WCHSIRB-D-2021-125). Camundongos C57BL/6 adultos foram obtidos da Gempharmatech Experimental Animals Company, Chengdu, China. Toda a coroa do primeiro molar superior entra em erupção 21 dias após o nascimento. Os camundongos para cirurgia devem ter mais de 21 dias com vitalidade normal¹¹. Aqui, camundongos de 6 a 8 semanas de idade foram usados para modelagem. A Figura 1 é um fluxograma que mostra o protocolo utilizado.

1. Preparo pré-operatório (Figura 2)

1. Obtenha os seguintes instrumentos: microscópio estereoscópico, placa de fixação, fita médica, mordaça bucal, broca dentária minimamente invasiva com diâmetro de 0,6 mm, peça de mão odontológica odontológica de alta velocidade, lima 8# C+, almofada de aquecimento, seringa de 1 mL, bola de algodão estéril, pinça ocular.
2. Obtenha os seguintes medicamentos: mistura de anestesia, pomada veterinária.

2. Preparação da mordaça bucal

1. Pese e anestesie o camundongo por injeção intraperitoneal de solução de mistura anestésica (cloridrato de cetamina a 10% + xilazina a 5% + solução salina isotônica estéril a 85%) a 0,007 mL / g de peso corporal e confirme a anestesia adequada através do método de pinça do dedo do pé. Aplique pomada lubrificante oftálmica nos olhos para evitar lesões oculares devido à dessecação durante a operação.
   NOTA: Chapéus médicos, máscaras, luvas e macacões e outras proteções básicas são necessários. Certifique-se de que o ambiente cirúrgico e a câmara do mouse estejam limpos e seguros. É necessária uma almofada térmica para suporte térmico durante todo o procedimento.
2. Prepare o mordaça bucal conforme descrito abaixo (Figura 3).
   1. Obtenha os seguintes materiais: Fio de arco ortodôntico com diâmetro de 8 μm, alicate de dobra de laço jovem, cortador de fio pesado, caneta marcadora, tampa de borracha com comprimento de 3 mm e diâmetro de seção transversal de 1 mm.
   2. Primeiro, endireite o fio do arco com a mão esquerda para fixação e o polegar, o dedo indicador da mão direita dobre levemente contra o arco do fio. Repita esta ação várias vezes, isso facilitará a flexão para o ângulo tridimensional correto.
   3. Use o alicate de dobra de laço Yong para dobrar a borda superior (Figura 3G, ai) do trapézio (Figura 3C, al-kb) com cerca de 8 mm de comprimento no ponto médio do fio do arco. Certifique-se de que o ponto a (Figura 3) esteja na borda do bico do alicate.
   4. Segure o alicate com a mão esquerda, prenda a extremidade livre do fio do arco com o polegar direito e o indicador e dobre o fio do arco do ponto a para fazer um ângulo de cerca de 120 °. Duplique a ação anterior no ponto i (Figura 3G). Verifique se o fio do arco está em um plano, colocando-o em uma mesa horizontal sem forçar a alavanca.
   5. Deixe cerca de 9 mm de comprimento de cada lado (Figura 3D, ab, lk) e dobre a extremidade livre em um ângulo de 75 ° usando a mesma habilidade da etapa 2.2.4, garantindo que cada borda esteja em um plano. Dobre este ângulo agudo com a ponta do bico do alicate.
   6. Encontre o ponto c a cerca de 5 mm do ponto b. Siga a mesma habilidade para dobrar um ângulo de 105° no ponto c. Dobre outro ângulo de 105° no ponto d a 5 mm do ponto c. Deixe cerca de 4,5 mm do ponto d e encontre o ponto e. Dobre a extremidade livre no ponto e para formar um ângulo de cerca de 100 -105° (Figura 3E).
      NOTA: Os camundongos C57 de 6 a 8 semanas que usamos tinham cerca de 20 g. O espaçamento de 5 mm não só poderia emperrar as mandíbulas superior e inferior dos camundongos sem se mover, mas também não pressionaria a pele dos camundongos e causaria desconforto. Se outras espécies ou idades de camundongos forem usadas, ajuste o comprimento das partes cd e ih de acordo com a situação real (Figura 3E, G).
   7. Dobre um abaixador de língua extra para a parte mandibular (Figura 3G, j-i-h-g).
   8. Etapas de dobra duplicadas da peça ABC na peça LKJ. Prenda as peças i-k e k-j ao mesmo tempo e dobre a extremidade livre no ponto j para torná-la vertical em relação ao plano i-k-j. Clamp ponto i que fica a 5 mm do ponto j, dobre a extremidade livre para torná-la paralela ao plano i-k-j e à parte cd (Figura 3H).
   9. Deixe 5 mm de comprimento do ponto i, no ponto h, dobre o arco verticalmente para a parte i-h e paralelo ao plano j-i-h. Encontre o ponto g a 5 mm do ponto h. Prenda o plano j-i-h-g e dobre a extremidade livre simétrica à parte k-j. Em seguida, a extremidade livre após o ponto f deve ser simétrica à extremidade livre do ponto e (Figura 3H).
   10. Coloque tampas de borracha na extremidade livre (Figura 3F).

3. Imobilização

1. Fixe o mouse em decúbito dorsal na placa de fixação com os membros presos por fita adesiva. Comprima as pontas livres da mordaça bucal com o polegar e o indicador.
2. Fixe os incisivos frontais do mouse na ranhura trapezoidal de dois braços. Certifique-se de que o braço com abaixador de língua seja para mandibula. Ajuste a mordaça bucal para garantir que a língua do rato esteja imobilizada, mas não isquêmica.

4. Avaliação dentária

1. Certifique-se de que o primeiro molar superior para cirurgia esteja livre de cáries dentárias, traumas e odontogênese. Certifique-se de que não haja vermelhidão, inchaço ou fístula na gengiva circundante. Certifique-se de que os dentes opostos estejam saudáveis e disponíveis para atuar como o grupo de controle saudável.

5. Exposição pulpar

1. Use a broca dentária para perfurar o lado oclusal do primeiro molar superior a uma velocidade de 20.000 rpm. Certifique-se de que o esmalte seja removido. Mantenha a operação com peça de mão odontológica apenas em camada rasa de dentina para evitar estimulação térmica excessiva no tecido pulpar dentário¹².
2. Ao mesmo tempo, evite o superaquecimento usando uma seringa para colocar solução salina normal no dente a cada 3 minutos durante a operação.
3. Coloque uma lima 8# ou 10# C+ na posição mais baixa do poço perfurado e perfure a última dentina para expor a câmara pulpar. Será uma sensação óbvia de queda quando a dentina local for completamente removida. Não prob muito fundo, ou o tecido da polpa dentária pode ser retirado da câmara pulpar.
4. Limpe os fragmentos ao redor do dente. Tire a mordaça na boca; A cirurgia está terminada. Use o primeiro molar maxilar oposto como controle sem operação.

6. Cuidados pós-operatórios

1. Após a cirurgia, administre carprofeno (5 mg/kg) por via subcutânea e coloque o camundongo na almofada de aquecimento quimiotérmico em decúbito ventral até a recuperação da anestesia. Alimente os ratos e forneça água potável. O processo de recuperação deve ser supervisionado. Nenhum outro animal deve estar na mesma câmara até que o camundongo esteja totalmente recuperado.

7. Coleta e armazenamento de amostras

1. Eutanasiar o camundongo com luxação cervical sob condição anestésica profunda 24 h após a operação ou qualquer outro momento conforme experimento⁹. Corte os músculos do esqueleto ligados à maxila e ao zigoma com uma tesoura oftálmica. Remova o esqueleto, o osso frontal e os tecidos moles e retire a lâmina gnotosgotegita com os molares superiores.
   NOTA: De acordo com He et al., recomenda-se que a amostra de pulpite seja coletada menos de 72 h após a cirurgia para evitar necrose extensa no tecido pulpar dentário¹³.
2. Divida sagitalmente o gnatosgotegito ao meio e armazene o tecido em paraformaldeído a 4% em PBS, pH 7,4, a 4 ° C para fixação de 24 horas.

8. Análise histológica

1. Lave o tecido com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e descalcifique-o em solução descalcificante alterada diariamente de EDTA a 5% e sacarose a 4% em PBS, pH 7,4, a 4 °C por 2-4 semanas¹⁰.
2. Incorpore a 1/2 gontostegita em parafina e certifique-se de que a face sagital sem dentes esteja na parte inferior dos de tecido.
3. Corte o bloco de parafina em fatias de 5 μm de espessura com um micrótomo de parafina. Ajuste o ângulo do bloco de parafina de acordo com a relação proximal, distal, superior e inferior observada ao microscópio para garantir que a polpa da coroa completa e a perfuração do primeiro molar possam ser cortadas.

Representative Results

O procedimento descrito acima foi realizado no primeiro molar superior direito de camundongos C57BL/6 de 3, 6-8 semanas de idade, enquanto os primeiros molares superiores esquerdos foram preservados como controle. Os resultados histológicos e de imunofluorescência do controle em branco, amostras de pulpite de 12 h e pulpite de 24 h foram utilizados para demonstração.

Seguindo o protocolo de análise de TC de Goldman et ^al.15, a exposição pulpar foi confirmada por meio de micro-CT e modelagem de reconstrução na Figura 4 A-C. Os cortes sagitais dos primeiros molares superiores, tanto do lado controle quanto do lado cirúrgico, foram submetidos à coloração HE (Figura 5). Necrose do tecido pulpar e desintegração da morfologia celular na margem da ferida foram mostradas. A necrose concentrou-se principalmente no tecido pulpar próximo à perfuração, e a forma do tecido pulpar no lado fechado foi normal. Às 24 h, a maioria dos tecidos pulpares, incluindo a polpa radicular, estava morfologicamente intacta. (Figura 5).

A expressão de IL-6¹⁴ foi baixa no controle, e uma pequena quantidade de IL-6 pôde ser observada ao redor da ferida em 12 h, enquanto a expressão de IL-6 foi significativamente aumentada em 24 h. Além disso, a expressão de IL-6 concentrou-se principalmente na margem da ferida e no corno da polpa média (Figura 6). Na Figura 6 D, E, o número de células da polpa dentária IL-6+ e a proporção de células IL-6+ para células da polpa dentária totais aumentam ao longo do tempo em três pontos de tempo. Pode-se considerar que a área desenvolve inflamação gradualmente e se agrava após a exposição pulpar.

Convidamos 5 colegas que nunca realizaram cirurgia em dentes maxilares de camundongos C57 para calcular o tempo necessário para imobilizar a mandíbula superior e inferior de camundongo (Estágio 1) e expor o primeiro molar superior do camundongo (Estágio 2) seguindo o procedimento tradicional com dois elásticos referente ao protocolo publicado por Goldman et al. ou nosso protocolo com a mordaça bucal¹⁵. O tempo para colocação correta da broca no primeiro molar superior do camundongo ao microscópio também foi calculado para análise. Os resultados da Figura 3 J,K sugeriram que o tempo de fixação da boca e o achado do primeiro molar superior dos camundongos com a mordaça foram significativamente reduzidos em comparação com a forma tradicional (P<0,05). O uso de mordaça bucal pode melhorar a eficiência da operação e reduzir a dificuldade de operação.

Figura 1: Fluxograma do procedimento de exposição pulpar. (A) Após a fixação com mordaça bucal, o primeiro molar superior do camundongo deve ser totalmente exposto ao microscópio. (B) Use uma peça de mão odontológica de alta velocidade com broca dentária minimamente invasiva para remover o esmalte oclusal e a dentina superficial do primeiro molar, mas tome cuidado para não penetrar diretamente na dentina para evitar influência excessiva na polpa causada por superaquecimento. (C) Use a lima 8# C+ para penetrar na dentina restante e expor a polpa. (D) As amostras foram coletadas 24 h após a cirurgia. A coloração de HE e imunofluorescência provou que um modelo de pulpite poderia ser estabelecido neste momento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Equipamento para procedimento de exposição pulpar. (A) Microscópio estereoscópico e motor de peça de mão odontológica de alta velocidade. (B) A lima 8 # C +, broca dentária minimamente invasiva, mordaça bucal, pinça e peça de mão odontológica de alta velocidade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Fazendo a mordaça bucal. (A) Dobre o fio para fazer dois braços de trabalho da mordaça bucal. (B-C) Etapas de espátula de língua de flexão para mandíbula. (D-E) Sem espátula de língua para maxila. (F, H) Tampas de borracha ou extremidades dobradas são necessárias para proteger os ferimentos de picadas. (G) Três pontos de vista da mordaça bucal para referência. (I) Uso clínico de mordaça bucal. (J) O tempo médio para iniciantes fixarem as mandíbulas superior e inferior (Estágio 1) usando o método tradicional de fixação e mordaça bucal, respectivamente. (K) O tempo médio para iniciantes encontrarem claramente o primeiro molar superior (Estágio 2) usando o método tradicional de fixação e mordaça bucal, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Análise de micro-TC do primeiro molar operado com perfuração marcada por linha pontilhada vermelha. (A) Plano sagital do dente, certifique-se de que não existe perfuração no assoalho da câmara pulpar. (B) Plano coronal. Correspondendo à perfuração em (A), pode-se observar penetração completa da dentina do esmalte circundada com linha pontilhada vermelha. (C) Plano oclusal do modelo de reconstrução da TC. A localização da perfuração circulada com linha pontilhada vermelha é confirmada de forma mais intuitiva e o assoalho da câmara pulpar pode ser observado através da perfuração. (DG) Fotos intraoperatórias do tratamento. (D) Verifique o primeiro molar superior do camundongo para garantir que não haja cáries ou malformações. (E) Usando uma broca minimamente invasiva para remover esmalte e dentina rasa. Como pode ser visto na imagem, uma fossa (circulada com linha branca tracejada) pode ser observada na face oclusal do dente sem perfuração. (F) Usando a lima 8# C+ para penetrar na dentina restante, a lima pode ficar presa no dente sem apoio para as mãos. (G) Quando a lima é removida, o dente tem uma perfuração rosa, indicando exposição pulpar bem-sucedida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Coloração de hematoxilina-eosina. (A) Visão holística do primeiro molar não tratado para controle. (A-1,2,3) Figuras de alta ampliação correspondentes a 1, 2, 3 no painel (A). A forma do tecido pulpar dentário em 3 posições estava intacta e os odontoblastos estavam em um arranjo ordenado. (B) Visão holística dos dentes 12 h após a cirurgia. (B-1,2,3) Figuras de alta ampliação correspondentes a 1, 2, 3 no painel (B). A forma do tecido pulpar dentário nas posições 1 e 2 estava geralmente intacta. Necrose pode ser observada perto da perfuração. (C) Visão holística dos dentes 24 h após a cirurgia. (C-1,2,3) Figuras de alta ampliação correspondentes a 1, 2, 3 pol no painel (C). A necrose se estende de um único chifre pulpar até o tecido pulpar próximo. Mas a maioria dos tecidos pulpares, incluindo a polpa da raiz, estão morfologicamente intactos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Coloração por imunofluorescência. (A) Visão holística do primeiro molar não tratado para controle. (A-1,2,3) Figuras de alta ampliação correspondentes a 1, 2, 3 no painel (A). Quase nenhuma expressão de IL-6 pôde ser observada. (B) Visão holística dos dentes 12 h após a cirurgia. (B-1, 2, 3) Figuras de alta ampliação correspondentes a 1, 2, 3 no painel (B). O aumento da IL-6 concentrou-se no tecido próximo à perfuração mostrada em B-3. Nenhuma mudança óbvia foi observada em B-1,2. (C) Visão holística dos dentes 24 h após a cirurgia. (C-1, 2, 3) Figuras de alta ampliação correspondentes a 1, 2, 3 pol no painel (C). A expressão de IL-6 foi significativamente aumentada em C-2,3. (D) Quantidade total de células da polpa dentária IL-6⁺ no controle, exposição pulpar de 12 h, resultados de coloração de imunofluorescência de exposição pulpar de 24 h. (E) Proporção de células IL-6+ para a quantidade total de células da polpa dentária no controle, exposição pulpar de 12 h, resultados de coloração de imunofluorescência de exposição pulpar de 24 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Como o único tecido mole dentro dos dentes, a polpa dentária desempenha um papel crucial na manutenção da bioatividade do dente, mas permanece altamente sensível. A preservação dessa polpa vital tornou-se a abordagem inicial preferida em tratamentos endodônticos recentes, necessitando de uma compreensão abrangente dos mecanismos inflamatórios da polpa dentária¹⁶. A flutuação espaço-temporal do microambiente inflamatório e as interações entre os tipos de células residentes na pulpite dificultam sua investigação por meio de estudos in vitro ¹¹. Em vez disso, os estudos in vivo oferecem benefícios ao replicar o ambiente fisiológico encontrado em humanos. A utilização de camundongos experimentais, especificamente aqueles com genes superexpressos ou derrubados, fornece um instrumento eficaz para a validação de hipóteses. Os camundongos C57 frequentemente usados em laboratórios, no entanto, apresentam desafios devido ao seu pequeno tamanho e falta de coordenação, tornando problemática a aplicação de estímulos em seus dentes¹⁷. Para resolver esse problema, uma explicação abrangente do novo boca-gag é necessária para ajudar os pesquisadores a realizar procedimentos nas cavidades orais de camundongos. Além disso, este artigo descreve o protocolo para estabelecer um modelo de pulpite por meio da exposição pulpar no primeiro molar dos camundongos usando a mordaça bucal, oferecendo assim um guia valioso para pesquisas subsequentes.

Após inúmeras iterações, uma mordaça bucal escalável que é simples de construir foi projetada com sucesso. As dimensões e um esquema de três vistas da mordaça bucal são fornecidos na Figura 3. O protocolo simplificou significativamente o processo de dobra do arame, adotando um design trapezoidal em vez de um arco. A mordaça bucal usa um fio de arco ortodôntico de 0,8 mm de diâmetro, que equilibra a necessidade de evitar o deslizamento da boca do mouse e fornecer força de abertura suficiente. Além disso, a elasticidade do fio do arco ortodôntico protege a articulação temporomandibular dos camundongos. O mordaça bucal é compacto, resistente à corrosão e pode ser armazenado em um tubo de centrífuga de 50 mL com álcool para uso repetido. Apesar da pressão de mordida de um camundongo, a mordaça permanece estável na boca, permitindo que os pesquisadores operem sem ajuda sob um microscópio. Deve-se notar que o tamanho da mordaça pode ser ajustado para caber em diferentes tamanhos de corpo de camundongo. Se a boca estiver esticada além do limite do camundongo, a mordaça bucal deve ser removida imediatamente para evitar lesões na articulação temporomandibular (DTM) ou nos músculos maxilofaciais.

O relato de He et al. indica que a necrose pode ser detectada 24 h após a exposição pulpar, com a maioria do tecido pulpar tornando-se necrótico após 72 h¹⁸. Portanto, é essencial coletar o tecido pulpar dentro dessa janela de 72 h para evitar conclusões experimentais inválidas devido ao excesso de células mortas. Ao inserir a lima C+ na câmara pulpar, a rotação repetida e o empurrão profundo devem ser evitados para evitar danos excessivos ao tecido pulpar. Se ocorrer sangramento intenso durante o procedimento, recomenda-se remover suavemente o sangue usando uma pequena bola de algodão para evitar a tosse. A operação deve ser realizada apenas em um lado da maxila do camundongo devido ao potencial impacto negativo na precisão do modelo da modelagem simultânea em ambos os lados, o que pode causar complicações na ingestão alimentar. Após a cirurgia, é aconselhável não administrar anti-inflamatórios ou antibióticos aos camundongos.

A mordaça bucal, embora eficaz em manter a boca do camundongo aberta, tem limitações em relação ao local da cirurgia. Os dentes posteriores inferiores, protegidos pela língua pressionada com um abaixador de língua, muitas vezes não são claramente visíveis. Portanto, o procedimento é adequado apenas para operações nos dentes maxilares ou nos dentes anteriores inferiores. Se a cirurgia exceder 20 minutos, recomenda-se dar uma pausa ao camundongo a cada 10 minutos, pois a estabilidade da mordaça depende de antagonizar a força oclusal dos camundongos. Os camundongos C57, escolhidos por sua rápida reprodução e disponibilidade, são sensíveis a vários estímulos; portanto, uma leve overdose de drogas ou estímulos pode ser letal. Além disso, o tamanho pequeno de seus dentes requer um nível de habilidade mais alto para fatiar tecidos.

Em conclusão, a inflamação e necrose pulpar representam desafios prementes na regeneração pulpar. Este estudo oferece uma demonstração abrangente da criação de um modelo de pulpite em camundongos, com resultados de imunofluorescência verificando os fatores inflamatórios. Este artigo propõe um design novo e conveniente de mordaça bucal, que fornece ao operador uma visão desobstruída, mantendo a boca do mouse aberta sem interferência da língua. No entanto, as operações nos dentes posteriores inferiores continuam sendo um desafio. Considerando as vantagens do uso de camundongos experimentais, a modelagem endodôntica em camundongos é uma promessa significativa e está planejado antecipar novas reduções no limiar técnico.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Animal
C57/B6J mice	Gempharmatech Experimental Animals Company	C57/B6J	For the establishment of pulp exposure
Equipment
1 mL syringe	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD.	SB1-074(IV)	Apply in drug injection.
8# C+ file	Readysteel	0010047	Apply in exposing the roof of pulp chamber.
Anesthesia Mix solution			10% ketamine hydrochloride+ 5% xylazine + 85% sterile isotonic saline.
DAPI Staining Solution	Beyotime	C1005	Apply in immunofluorescence staining for counter-staining of nucleus.
Dental high-speed dental handpiece	Jing yuan electronic commerce technology	WJ-422	Apply in pulp exposure.
Heavy wire cutter	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply inarc cutting.
Hematoxylin and Eosin Stain kit	Biosharp	BL700B	For the histological analysis of the slides.
IL-6 antibody	Novus	NBP2-89149	Apply in immunofluorescence staining to detect the inflammation of the dental pulp.
Ketamine(Ketamine hydrochloride)	Vet One, Boise, Idaho, USA	C3N VT1	100mg/kg, IP. Apply in nesthetization.
Medical tap	3M	1530	Apply in mice immobilization.
Orthodontic arch wire	Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD.	K417	Diameter of 8µm
Round dental burr (0.6 mm)	Shofu global	072208	Apply in removing enamel and shallow layer of dentin.
Young loop bending plier	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	none	Apply in arc bending.