Summary
この記事では、革新的なマウスギャグを使用してマウスの歯髄炎モデルを確立するための合理化されたプロトコルと、その後の組織学的分析について説明します。
Abstract
歯髄炎は、自然な歯の喪失の一般的な原因であり、炎症を起こした歯髄の壊死と生理活性の喪失につながります。歯髄炎の根底にあるメカニズムとその効率的な治療を解明することは、歯内療法研究の継続的な焦点です。したがって、歯髄内の炎症過程を理解することは、歯髄の保存を改善するために不可欠です。他の in vitro 実験と比較して、マウス歯髄炎モデルは、歯髄炎の病理学的進行を観察するための、より本物で遺伝的に多様な状況を提供します。しかし、マウスの使用は、費用対効果が高く、アクセスしやすいにもかかわらず、サイズが小さく、協調性が低く、耐性が低いため困難を伴い、口腔内および歯科治療を複雑にします。このプロトコルは、マウスの髄を露出させるためのマウスギャグの新しい設計と適用を導入し、より効率的な口腔内処置を促進します。マウスギャグは、ほとんどの歯科医がすぐに利用できる歯列弓で構成されており、初めての手術でも手術の準備を大幅に迅速化できます。マイクロCT、ヘマトキシリン-エオシン(HE)染色、および免疫蛍光染色を使用して、形態と細胞発現の変化を特定しました。この記事の目的は、研究者がこの新しい口ギャグを使用して歯髄炎症モデルを作成するための、より再現性が高く、要求の少ない手順を確立するのを支援することです。
Introduction
歯の不可欠な部分である歯髄は、栄養供給、象牙質形成、感覚機能、防御反応など、複数の重要な機能を担っています1。それにもかかわらず、硬組織に囲まれた歯髄は、深部虫歯、歯髄炎、外傷、またはその後の治療による損傷や損傷を受けやすいです2,3。機能的な歯髄がないと、歯の脆弱性のリスクが高まります4。さらに、若い永久歯の歯髄の活力の喪失は歯の成熟に悪影響を与える可能性があり、現在の義歯技術は健康な歯髄によって提供される神経フィードバックを回復できません4。このような状況により、研究者は、単なる除去だけでなく、炎症を起こした歯髄を管理するための代替ソリューションを模索するようになりました。
2007年、Murrayらは再生歯内療法における組織工学の応用を開始し、それによって歯髄の保存と再生5への関心が高まりました。しかし、炎症を起こした歯髄組織は、細胞がIL-6などの炎症性因子を放出し、炎症細胞を動員し、細胞の壊死、歯髄の活力の喪失、および機能回復の合併症を引き起こすため、課題となります6,7。したがって、炎症とそれに伴う細胞死を理解することは、生命パルプの保存を進歩させるために非常に重要です。in vivoまたはin vitroで炎症果肉の分子生物学を探求するために実施された多くの実験があります8,9。2Dまたは3D細胞培養のようなin vitro実験は長年にわたって開発され、成熟しつつあり、炎症因子に対する歯髄細胞の反応をテストするために広く使用されつつあるが、これらの実験は歯髄組織と全身免疫系との間の相互作用を反映することはできない10。研究されている現象が免疫系、血管系、神経系などの他の組織起源の細胞に由来する場合、純粋な歯髄細胞培養は行き詰まりにつながります。したがって、in vivo実験は非常に必要であり、参考になります。
マウスは、その費用対効果、高い生殖能力、および活力により、 in vivoでの炎症研究においてますます一般的な選択肢になっています。ただし、マウスの歯髄炎モデルの包括的なプロトコルは現在存在しておらず、参照として役立ちます。マウスのサイズが小さく、刺激に対する感受性が高いため、実験手順では大きな課題が生じます。マウスの口の奥深くに隠された極小の歯を観察するには、実験室で卓上顕微鏡がより一般的に存在するにもかかわらず、カンチレバー顕微鏡の使用が必要になることがよくあります。開口器がないため、他の人の助けが必要です。これに対処するために、グループは、マウスの歯髄炎モデルを構築するための標準化された再現可能なプロトコルを提供することを目的とした、容易に入手できる材料を使用したマウスギャグを考案しました。この記事では、C57マウスの術前準備、固定化、歯髄曝露手術、およびサンプル採取を含む手順について詳しく説明します。このプロトコルでは、マウスギャグの使用を推奨し、その構造、製造、および適用に関する情報を提供して、他の研究者が手順を再現するのを容易にします。
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Protocol
この研究の実験手順は、四川大学西中国口腔病学院の倫理委員会(WCHSIRB-D-2021-125)によって承認されました。成体C57BL/6マウスは、Gempharmatech Experimental Animals Company(中国・成都)から入手しました。上顎第一大臼歯の冠全体は、生後21日で噴出します。手術を受けるマウスは、生後21日以上で、活力は正常であるべきである 11.ここでは、6週齢から8週齢のマウスをモデリングに用いました。 図1 は、使用されるプロトコルを示すフロー図です。
1. 術前準備(図2)
- 次の器具を入手してください:立体顕微鏡、固定プレート、医療用テープ、口ギャグ、直径0.6mmの低侵襲歯科用バリ、歯科用高速歯科用ハンドピース、8#C +ファイル、加熱パッド、1mLシリンジ、滅菌綿球、目の鉗子。
- 次の薬を入手してください:麻酔ミックス、獣医軟膏。
2.口ギャグの準備
- 麻酔ミックス溶液 (10% ケタミン塩酸塩 + 5% キシラジン + 85% 滅菌等張生理食塩水) の腹腔内注射によりマウスの体重を量り、麻酔をかけ、0.007 mL/g 体重でマウスを秤量し、つま先つまみ法で適切な麻酔を確認します。眼科用潤滑軟膏を目に塗布して、手術中の乾燥による眼の損傷を防ぎます。
注:医療用帽子、マスク、手袋、オーバーオール、その他の基本的な保護具が必要です。手術環境とマウスチャンバーの両方が清潔で安全であることを確認してください。手順全体を通して熱サポートのためのヒートパッドが必要です。 - 以下に説明するようにマウスギャグを準備します(図3)。
- 次の材料を入手してください:直径8μmの歯列矯正アーチワイヤー、ヤングループ曲げプライヤー、ヘビーワイヤーカッター、マーカーペン、長さ3mm、断面直径1mmのゴムキャップ。
- まず、固定用の左手でアーチワイヤーをまっすぐにし、親指で右手の人差し指をワイヤーの円弧に対してわずかに曲げます。このアクションを数回繰り返すと、正しい3次元角度への曲げが容易になります。
- Yongループベンディングプライヤーを使用して、弓ワイヤーの中点で長さ約3mmの台形(図3C、a-l-k-b)の上端(図3G、a-i)を曲げます。ポイントa(図3)がペンチのくちばしの端にあることを確認してください。
- ペンチを左手で持ち、cl 右手の親指と人差し指で弓ワイヤーの自由端を固定し、弓ワイヤーをa点から曲げて約120°の角度にします。ポイント i で前のアクションを繰り返します (図 3G)。アーチワイヤーが1つの平面上にあるかどうか、こじ開けずに水平テーブルに置いて確認します。
- 各辺に約9 mmの長さを残し(図3D、a-b、l-k)、各エッジが1つの平面上にあることを確認しながら、手順2.2.4と同じスキルを使用してフリーエンドを75°の角度に曲げます。ペンチのくちばしの先端でこの鋭角を曲げます。
- 点bから約5mmの点cを見つけます。同じスキルに従って、ポイントcで105°の角度で曲げます。点 d で 5mm の点でさらに 105° の角度で曲げます。ポイントdから約4.5mm離れて、ポイントeを見つけます。ポイントeで自由端を曲げて、約100〜105°の角度を形成します(図3E)。
注:使用した6〜8週齢のC57マウスは約20gでした。5mmの間隔は、動かずにマウスの上顎と下顎を詰まらせるだけでなく、マウスの皮膚を圧迫して不快感を引き起こすこともありません。他のマウス種や年齢を使用する場合は、実際の状況に応じてc-dおよびi-h部分の長さを調整してください(図3E、G)。 - 下顎部分用の余分な舌圧子を曲げます(図3G、j-i-h-g)。
- a-b-cパーツのl-k-jパーツの曲げステップを複製します。i-kパーツとk-jパーツを同時にクランプし、ポイントjで自由端を曲げて、i-k-j平面に対して垂直にします。点 j から 5 mm のところにあるクランプ点 i で、自由端を曲げて i-k-j 平面と c-d 部品の両方に平行にします (図 3H)。
- 点iから5mmの長さを残し、点hでアーチをi-h部分に垂直に曲げ、j-i-h平面に平行に曲げます。点hから5mmの地点で点gを見つけます。j-i-h-g平面をクランプし、自由端をk-j部品に対して対称に曲げます。次に、点fの後の自由端は、点e-自由端に対して対称である必要があります(図3H)。
- 自由端にゴム製のキャップを取り付けます(図3F)。
3. 固定化
- マウスの仰臥位を固定プレートに固定し、手足をスキンテープで固定します。口のギャグの自由端を親指と人差し指で圧縮します。
- マウスの前切歯を2本の腕の台形の溝に固定します。舌圧子付きのアームが下顎骨用であることを確認してください。マウスの舌が固定されているが虚血していないことを確認するために、口のギャグを調整します。
4.歯の評価
- 手術用の上顎第一大臼歯に虫歯、外傷、歯形成がないことを確認してください。周囲の歯肉に赤み、腫れ、瘻孔がないことを確認してください。反対側の歯が健康で、健康な対照群として行動できることを確認してください。
5. パルプばく露
- デンタルバリを使用して、上顎第一大臼歯の咬合側を20,000rpmの速度でドリルします。エナメル質が取り除かれていることを確認します。デンタルハンドピースを使用した操作は、歯髄組織12への過度の熱刺激を防ぐために、象牙質の浅い層にのみ保管してください。
- 同時に、手術中は3分ごとに注射器を使用して通常の生理食塩水を歯に落とすことにより、過熱を防ぎます。
- ドリルで開けたピットの最も低い位置に8#または10#のC +ファイルを置き、最後の象牙質に穴を開けてパルプチャンバーを露出させます。局所的な象牙質を徹底的に取り除くと明らかな転倒感になります。深く探りすぎると、歯髄組織が歯髄チャンバーから持ち出される可能性があります。
- 歯の周りの破片をきれいにします。口のギャグを外します。手術は終了しました。操作せずに、反対側の上顎第一大臼歯をコントロールとして使用します。
6. 術後のケア
- 手術後、カルプロフェン(5 mg / kg)を皮下投与し、麻酔から回復するまでマウスを腹臥位で化学温熱加熱パッドに置きます。.マウスに餌を与え、飲料水を提供します。回復プロセスは監視する必要があります。マウスが完全に回復するまで、他の動物を同じチャンバーに置かないでください。
7. サンプルの収集および貯蔵
- 実験9 に従って、手術の 24 時間後またはその他の任意の時点で、深い麻酔条件下で頸部脱臼を起こしたマウスを安楽死させます。上顎と頬骨に付着している骨格筋を眼ハサミで切断します。骨格、前頭骨、軟部組織を切除し、上顎大臼歯で椎弓板を取り出します。
注:Heらによると、歯髄組織の広範な壊死を避けるために、歯髄炎のサンプルは手術後72時間以内に収集する必要があることが推奨されています13。 - グナトステギトを矢状的に半分に分割し、組織をPBS、pH 7.4、4°Cの4%パラホルムアルデヒドに24時間固定します。
8. 組織学的解析
- 組織をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、5%EDTAおよびPBSの4%スクロースの日替わり脱灰溶液、pH 7.4で4°Cで2〜4週間脱灰します10。
- 1/2 gnathostegite をパラフィンに埋め込み、歯のない矢状面が組織カセットの底にあることを確認します。
- パラフィンブロックをパラフィンミクロトームで5 μmの厚さにスライスします。顕微鏡で観察される近位、遠位、上部、下部の関係に応じてパラフィンブロックの角度を調整し、完全なクラウンパルプと第一大臼歯の穿孔を切断できるようにします。
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Representative Results
上記の手順は、3、6〜8週齢のC57BL / 6マウスの右上顎第一大臼歯で行われましたが、左上顎第一大臼歯はコントロールとして保存されました。ブランクコントロール、12時間歯髄炎および24時間歯髄炎サンプルからの組織学および免疫蛍光結果をデモンストレーションに利用しました。
Goldman et al.15 の CT 解析のプロトコルに従って、図 4 A-C のマイクロ CT および再構成モデリングにより、歯髄曝露が確認されました。上顎第一大臼歯の矢状切片は、対照側と手術側の両方からHE染色を受けました(図5)。創傷縁部における歯髄組織の壊死および細胞形態の崩壊が示された。壊死は主に穿孔部付近の歯髄組織に集中しており、未開封側の歯髄組織の形状は正常であった。24時間後、根髄を含むほとんどの歯髄組織は形態学的に無傷でした。(図 5)。
IL-614 の発現はコントロールが低かったため、12時間後には創傷の周囲に少量のIL-6が観察されたが、IL-6の発現は24時間で有意に増加した。また、IL-6の発現は主に創傷縁と中髄角に集中していました(図6)。 図6 D、Eでは、IL-6+歯髄細胞の数と、全歯髄細胞に対するIL-6+細胞の比率は、3つの時点で時間とともに増加します。この領域は、パルプ曝露後に徐々に炎症を発症し、悪化すると考えることができる。
C57マウスの上顎歯の手術を行ったことがない5人の同僚を招待して、マウスの上顎と下顎を固定するのに必要な時間(ステージ1)とマウスの上顎第一大臼歯の露出(ステージ2)を、ゴールドマンらによって公開されたプロトコルまたはマウスギャグ15を使用したプロトコルを参照して、2つの輪ゴムを使用した従来の手順に従って計算しました.顕微鏡下でマウスの上顎第一大臼歯にドリルを正しく配置する時間も、分析のために計算されました。 図3の J,K の結果から、マウスの口の固定時間とマウスの上顎第一大臼歯の発見時間が、従来の方法と比較して有意に短縮されたことが示唆された(P<0.05)。マウスギャグを使用すると、操作効率が向上し、操作の難しさが軽減されます。
図1:歯髄曝露手順のフロー図。 (A)マウスギャグで固定した後、マウスの上顎第一大臼歯を顕微鏡下で完全に露出させる必要があります。(B)低侵襲の歯科用バリを備えた高速歯科用ハンドピースを使用して、第一大臼歯の咬合エナメル質と表在性象牙質を取り除きますが、過熱による歯髄への過度の影響を避けるために、象牙質に直接浸透しないように注意してください。(C)8#C +ファイルを使用して、残りの象牙質を貫通し、歯髄を露出させます。(D)サンプルは手術の24時間後に採取されました。HE染色と免疫蛍光染色により、この時点で歯髄炎モデルを確立できることが証明されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:歯髄曝露処置用機器 (A)歯科用高速歯科用ハンドピースの立体顕微鏡とモーター。(B)8#C +ファイル、低侵襲歯科用バリ、口ギャグ、ピンセット、および歯科用高速歯科用ハンドピース。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:マウスギャグの作り方 (A) ワイヤーを曲げて、マウスギャグの2つのアームを作ります。(B-C)下顎骨のために舌のへらを曲げるステップ。(D-E)上顎骨の舌スパチュラはありません。(F、H)刺さるのを防ぐために、ゴム製のキャップまたは曲がった端が必要です。(G)参考までに口口ギャグの3つのビュー。(I)口ギャグの臨床使用。(J)初心者が上顎と下顎を固定する平均時間(ステージ1)は、それぞれ従来の固定方法と口蓋ギャグを使用して固定します。(K)初心者が上顎第一大臼歯(ステージ2)を従来の固定方法と口口ギャグでそれぞれ明確に見つける平均時間。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:赤い点線でマークされた穿孔のある操作された拳大臼歯のマイクロCT分析。 (A)歯の矢状面、歯髄室の床に穿孔が存在しないことを確認します。(B)コロナル平面。(A)の穿孔に対応して、赤い点線で囲ったエナメル象牙質の完全な浸透が観察できる。(C)CT再構成モデルの咬合面。赤い点線で囲まれたミシン目の位置は、より直感的に確認でき、ミシン目を通してパルプチャンバーの床面を観察することができます。(D-G)治療の術中写真。(D)マウスの上顎第一大臼歯をチェックして、虫歯や奇形がないことを確認します。(E)低侵襲のバリを使用して、エナメル質と浅い象牙質を取り除きます。画像からわかるように、歯の咬合面には穿孔のないくぼみ(白い破線で囲まれた部分)が見られます。(F)8#C +ファイルを使用して残りの象牙質を貫通すると、手のサポートがないとファイルが歯に詰まる可能性があります。(G)ヤスリを取り外すと、歯にピンク色の穿孔があり、歯髄への曝露が成功したことを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ヘマトキシリン-エオシン染色 (A)未処理の第一大臼歯の全体像。(A-1,2,3)パネル(A)の1、2、3に対応する高倍率の数値。3つの位置の歯髄組織の形状は無傷で、歯芽細胞は整然と配置されていました。(B)手術後12時間の歯の全体像。(B-1,2,3)パネル(B)の1、2、3に対応する高倍率の数値。位置1と2の歯髄組織の形状は概ね無傷でした。壊死は穿孔の近くで観察することができました。(C)手術後24時間の歯の全体像。(C-1,2,3)パネル(C)の1、2、3に対応する高倍率の数値。壊死は、単一の歯髄角から近くの歯髄組織にまで及びます。しかし、根髄を含むほとんどの歯髄組織は形態学的に無傷です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:免疫蛍光染色(A)コントロールのための未処理の第一大臼歯の全体像。(A-1,2,3)パネル(A)の1、2、3に対応する高倍率の数値。IL-6の発現はほとんど観察できませんでした。(B)手術後12時間の歯の全体像。(B-1、2、3)パネル(B)の1、2、3に対応する高倍率の数値。IL-6の増加は、B-3に示されている穿孔近くの組織に集中しています。B-1,2では明らかな変化は観察されませんでした。(C)手術後24時間の歯の全体像。(C-1、2、3)パネル(C)の1、2、3に対応する高倍率の数値。IL-6の発現はC-2,3で有意に増加しました。(D)対照のIL-6+歯髄細胞の総量、12時間歯髄曝露、24時間歯髄曝露免疫蛍光染色結果。(E)制御中の歯髄細胞の総量に対するIL-6+細胞の比率、12時間歯髄ばく露、24時間歯髄ばく露免疫蛍光染色結果。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
歯髄は、歯の中の孤立した軟組織として、歯の生理活性を維持する上で重要な役割を果たしていますが、依然として非常に敏感です。この重要な歯髄の保存は、最近の歯内療法において好ましい初期アプローチとなっており、歯髄の炎症メカニズムを包括的に理解する必要があります16。炎症性微小環境の時空間変動と歯髄炎の常在細胞型間の相互作用は、 in vitro 研究を通じてその研究を複雑にします11。それどころか、 in vivo 研究は、ヒトに見られる生理学的環境を再現することで利益をもたらします。実験マウス、特に遺伝子が過剰発現またはノックダウンされたマウスを利用することは、仮説検証のための効果的な手段を提供します。しかし、実験室で頻繁に使用されるC57マウスは、サイズが小さく協調性に欠けているために課題があり、歯への刺激の適用が問題になります17。この問題に対処するためには、研究者がマウスの口腔内で手技を行うのを支援するために、新規マウスギャグの包括的な説明が必要です。さらに、この記事では、マウスの第一大臼歯にマウスの口ギャグを使用して歯髄をばく露することにより、歯髄炎モデルを確立するためのプロトコルを概説し、それによってその後の研究に貴重なガイドを提供します。
何度も繰り返した後、簡単に構築できるスケーラブルなマウスギャグが成功裏に設計されました。マウスギャグの寸法と3ビューの概略図を 図3に示します。このプロトコルは、アークの代わりに台形設計を採用することにより、ワイヤの曲げプロセスを大幅に簡素化しました。マウスギャグは直径0.8mmの歯列矯正アーチワイヤーを使用しており、マウスの口からの滑りを防ぐ必要性と十分な開放力をバランスよく供給しています。さらに、歯列矯正アーチワイヤーの弾力性は、マウスの顎関節を保護します。マウスギャグはコンパクトで腐食に強く、アルコールを入れた50mLの遠心分離チューブに保管して繰り返し使用できます。マウスの噛む圧力にもかかわらず、口内ギャグは口の中で安定しているため、研究者は顕微鏡下で補助なしで操作できます。なお、マウスギャグのサイズは、マウスの体の大きさに合わせて調整することができます。マウスの限界を超えて口を伸ばしている場合は、顎関節(TMD)または顎顔面筋の損傷を避けるために、マウスギャグをすぐに取り外す必要があります。
彼らの報告は、壊死は歯髄曝露後24時間で検出でき、歯髄組織の大部分は72時間後に壊死することを示しています18。したがって、過剰な死細胞による無効な実験的結論を避けるために、この72時間のウィンドウ内で歯髄組織を収集することが不可欠です。C+ファイルを歯髄チャンバーに挿入するときは、歯髄組織への過度の損傷を防ぐために、回転を繰り返したり、深く押したりしないようにする必要があります。処置中に大量の出血が発生した場合は、咳を防ぐために小さな綿球を使用して血液をやさしく取り除くことをお勧めします。手術は、マウス上顎の片側でのみ行うべきであり、両側での同時モデリングによるモデル精度への悪影響が、食事摂取の合併症を引き起こす可能性があるためです。手術後は、マウスに抗炎症薬や抗生物質を投与しないことをお勧めします。
マウスギャグは、マウスの口を開いたままにしておくのに効果的ですが、手術部位に関しては制限があります。下顎の後歯は、舌圧子で押された舌によって保護されているため、多くの場合、はっきりと見えません。したがって、この手順は、上顎歯または下顎前歯の手術にのみ適しています。手術が20分を超える場合は、マウスの咬合力に拮抗することにマウスギャグの安定性に依存するため、マウスに10分ごとに休憩を与えることをお勧めします。C57マウスは、その迅速な繁殖と利用可能性のために選択され、さまざまな刺激に敏感です。したがって、薬物や刺激のわずかな過剰摂取は致命的になる可能性があります。さらに、彼らの歯のサイズが小さいため、組織スライスにはより高いスキルレベルが必要です。
結論として、歯髄の炎症と壊死は、歯髄再生における差し迫った課題を表しています。この研究では、マウスで歯髄炎モデルを作成し、免疫蛍光法の結果により炎症性因子を検証する包括的なデモンストレーションを提供します。この記事では、マウスの口を舌の干渉なしに開いたままにすることで、オペレーターに遮るもののない視界を提供する、斬新で便利なマウスギャグデザインを提案します。しかし、下顎後歯の手術は依然として課題です。実験マウスを使用する利点を考慮すると、マウスの歯内療法モデリングは大きな期待が寄せられており、技術的な閾値のさらなる低下が期待されます。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、National Natural Science Foundation of China U21A20368 (L. Y.)、82101000 (H. W.)、82100982 (F. L.)、およびSichuan Science and Technology Program 2023NSFSC1499 (H. W.)からの助成金によって資金提供されました。この論文には、すべての元のデータと画像が含まれています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal | |||
| C57/B6J mice | Gempharmatech Experimental Animals Company | C57/B6J | For the establishment of pulp exposure |
| Equipment | |||
| 1 mL syringe | Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instruments Co. LTD. | SB1-074(IV) | Apply in drug injection. |
| 8# C+ file | Readysteel | 0010047 | Apply in exposing the roof of pulp chamber. |
| Anesthesia Mix solution | 10% ketamine hydrochloride+ 5% xylazine + 85% sterile isotonic saline. | ||
| DAPI Staining Solution | Beyotime | C1005 | Apply in immunofluorescence staining for counter-staining of nucleus. |
| Dental high-speed dental handpiece | Jing yuan electronic commerce technology | WJ-422 | Apply in pulp exposure. |
| Heavy wire cutter | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | none | Apply inarc cutting. |
| Hematoxylin and Eosin Stain kit | Biosharp | BL700B | For the histological analysis of the slides. |
| IL-6 antibody | Novus | NBP2-89149 | Apply in immunofluorescence staining to detect the inflammation of the dental pulp. |
| Ketamine(Ketamine hydrochloride) | Vet One, Boise, Idaho, USA | C3N VT1 | 100mg/kg, IP. Apply in nesthetization. |
| Medical tap | 3M | 1530 | Apply in mice immobilization. |
| Orthodontic arch wire | Shanghai Wei Rong Medical Apparatus Co. LTD. | K417 | Diameter of 8µm |
| Round dental burr (0.6 mm) | Shofu global | 072208 | Apply in removing enamel and shallow layer of dentin. |
| Young loop bending plier | Jirui Medical Instrument Co., Ltd. | none | Apply in arc bending. |
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