Summary
细胞外囊泡在生物医学应用方面具有巨大的前景，但目前的分离方法对于临床应用来说既耗时又不切实际。在这项研究中，我们提出了一种微流体装置，该装置能够以最少的步骤以连续的方式从大量生物流体中直接分离细胞外囊泡。
Abstract
细胞外囊泡 （EV） 在各种生物医学应用中具有巨大的潜力，包括诊断、药物递送和再生医学。然而，目前用于隔离电动汽车的方法存在重大挑战，例如复杂性、时间消耗和对笨重设备的需求，这阻碍了它们的临床转化。为了解决这些局限性，我们旨在开发一种基于环烯烃共聚物-化学计量-硫醇-烯 （COC-OSTE） 的创新微流控系统，用于从大体积样品中连续高效分离 EV。通过利用基于尺寸和浮力的分离，与现有的尿液和细胞培养基样品方法相比，本研究中使用的技术实现了明显更窄的尺寸分布，从而能够在未来的应用中靶向特定的 EV 尺寸分数。我们创新的COC-OSTE微流控装置设计利用分叉非对称流场-流动分离技术，为大体积样品提供了一种简单、连续的EV分离方法。此外，这种微流控设备的大规模制造潜力提供了可扩展性和一致性，使得将 EV 隔离集成到常规临床诊断和工业流程中成为可能，在这些流程中，高一致性和吞吐量是基本要求。
Introduction
细胞外囊泡 （EV） 是细胞衍生的膜结合颗粒，包括两种主要类型：外泌体 （30-200 nm） 和微囊泡 （200-1000 nm）1。外泌体通过多囊泡体 （MVB） 内内体膜向内出芽形成，在与质膜融合后将腔内囊泡 （ILV） 释放到细胞外空间1。相反，微囊泡是由细胞膜的向外出芽和裂变产生的2.EV 通过转运蛋白质、核酸、脂质和代谢物，在细胞间通讯中发挥至关重要的作用，反映了细胞的生理状态，包括生长、血管生成、转移、增殖和治疗耐药性3。因此，它们已成为包括癌症在内的疾病的有前途的生物标志物和治疗靶点，凸显了它们在诊断和药物递送系统中的潜力4。
为了在疾病诊断和治疗中充分利用电动汽车，从各种生物流体中有效分离至关重要5.常用方法包括超速离心 （UC）、密度梯度离心、体积排阻色谱 （SEC）、过滤和免疫分离6。UC 是一种广泛使用的技术，但可能会产生密度相似的颗粒，这些颗粒不是 EV，并且可以产生 EV 聚集体7。SEC 之所以广受欢迎，是因为它能够通过根据大小而不是密度8 排除颗粒来提供更高纯度的样品。然而，仔细选择SEC色谱柱的适当孔径和优化色谱条件对于最大限度地减少乳糜微粒和低密度脂蛋白等不需要的颗粒的共分离至关重要8。尽管它们很有效，但这两种方法都非常耗时且难以实现自动化，特别是对于细胞培养基或尿液等大体积样品，这限制了它们在工业应用中的可扩展性9。
近年来，非对称场流场分馏（A4F）已发展成为一种强大的分离技术，用于基于尺寸和浮力的微纳米级颗粒分离10。A4F的工作原理依赖于在其底部具有多孔膜的微流体通道，从而产生施加在膜上的力，称为横流10。当与系统固有的布朗运动和泊塞耶流相结合时，由于流动动力学中颗粒位置的变化，错流有助于有效的颗粒分离11。尽管有这些优点，但该方法仅限于微升范围12 内的样品体积，并且需要额外的聚焦步骤，从而延长了过程10的持续时间。
在过去十年中，微流控技术作为快速、高效和临床上可靠的 EV 分离工具而备受瞩目13。然而，大多数设计用于 EV 分离的微流控方法都针对小体积、高浓度 EV 样品进行了优化，或者依赖于复杂的分离程序14。此外，在微流控领域，聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 因其光学透明度、生物相容性和易用性而被公认为黄金标准材料15。然而，其已知的吸收亲脂性小分子（包括 EV）的倾向可能对其在 EV 领域的应用造成问题13。
环烯烃共聚物 （COC） 由于具有生物相容性、分子吸收小和耐化学性高等优点，是微流控中常用的材料15。然而，COC器件的制造往往涉及复杂的工艺或专用设备16。另外，非化学计量巯基烯 （OSTE） 是 PDMS 的一种很有前途的替代品，因为它减少了对小分子的吸收、优异的化学稳定性、易于制造和可扩展的制造工艺17,18。然而，由于与管道的复杂连接，设备可能容易泄漏19.
本研究的目的是设计和制造一种结合 OSTE 和 COC 以及分叉 A4F 原理的微流控装置，用于从大体积样品（如尿液或细胞培养基）中分离 EV。
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Protocol
拉脱维亚大学生命与医学科学研究伦理委员会批准了样本采集（第N0-71-35/54号决定）
注：本研究中使用的材料包含在 材料表 文件中。
1. 三维（3D）打印模具制造
- 在CAD软件中设计一个蛇形双负模具，顶部通道的尺寸如下：高0.5mm，宽1mm，长210mm。对于底部通道，使用相同的设计，宽度为 1.5 mm，高度为 0.6 mm，长度为 210 mm。模具宽度、长度、高度和设计等距图等尺寸如 图 1 所示。将设计另存为 .stl 文件。
- 在 Z-Suite 中准备文件;无需添加任何支持。使用带有坚韧黑色树脂的紫外液晶显示器 （UV LCD） 3D 打印机打印模具。
- 打印后，小心地从打印机表面取下模具。在异丙醇（IPA）超声处理中洗涤模具20分钟。
- 用 N2 吹干模具。
- 使用ND33过滤器将模具暴露在洪水中810秒，然后将它们放入60°C的烘箱中48小时。
2. PDMS模具的制备
- 以 10：1 w/w 的比例对 PDMS 进行称重（对于每个模具，使用 16 g 弹性体基和 1.6 g 交联剂）。在行星离心混合器中混合组分，以500RPM混合1分钟。
- 将混合的PDMS浇铸到3D打印的模具中，并在-800mbar的真空干燥器中脱气30分钟或直到没有观察到气泡。
- 小心地将 100 μm 厚的聚氯乙烯衬里放在液体 PDMS 的顶部。
注意： 将衬垫从一侧慢慢涂抹到另一侧以避免气泡形成。 - 将带有PDMS的模具插入到现成模夹具中，并使用设置为0.3 Nm的扭矩扳手拧紧夹具。
- 将夹具放入60°C烘箱中3小时以固化PDMS。
- 使用六角扳手拆卸夹具，然后从夹具上取下 3D 打印模具。
- 小心地将PDMS模具从3D打印的母模中脱模，用手术刀在模具边缘运行，然后用镊子取出模具。
注意： 为了更容易去除霉菌，可以使用 IPA;然而，模具需要在60°C下加热10分钟，以蒸发掉多余的IPA。
3. OSTE-COC顶部通道的制备
- 重量 OSTE 以 1.09：1 w/w 比（对于 5 个设备，需要 1.56 g A 部分和 1.44 g B 部分）。在行星离心混合器中混合组分：以750RPM混合5分钟，然后在750RPM下脱气5分钟。
- 将混合的OSTE转移到离心管中，并在真空干燥器中以-800mbar脱气30分钟。
- 用 2 x 16 迷你鲁尔连接器清洁 COC 载玻片，在 IPA 中超声处理 10 分钟。用N2小心干燥载玻片。
- 将干净的COC载玻片放入等离子体中，使平坦的表面向上放置，并用800SCCM氧等离子体在700W功率和0.133mbar压力下处理表面2分钟。
- 将氧化的COC载玻片放在PDMS模具上作为顶部通道，使处理后的表面与PDMS的结构表面接触。将组件放入原位模具中，用设置为 0.3 Nm 的扭矩扳手拧紧夹具。
- 将压力系统连接到 6 bar 的压缩空气管路。取带有脱气 OSTE 的离心管，并使用内径 （ID） 为 0.8 mm 的聚四氟乙烯 （PTFE） 管按照压力系统说明进行组装。
- 将 PTFE 管连接到 PDMS 模具的入口，并使用由位于压力系统中的压电泵维持的 1000 mbar 压力填充设备。将夹具的玻璃面朝上放入面罩对准器中，并使用 ND33 滤光片以 850 mJ 剂量曝光。
- 曝光后，使用六角扳手拆卸夹具，然后小心地从PDMS模具中取出带有结构化OSTE层的COC载玻片。
- 使结构化的 OSTE 与具有 50 nm 孔径和 11.8% 孔密度的 25 mm x 75 mm 膜接触，以便通道完全被膜覆盖。
注意： 在应用过程中保持膜尽可能笔直尤为重要。 - 将组件放在设置为 60°C 的热板上，膜面朝上，在膜顶部放置干净的载玻片，然后从顶部施加 1.6 kPa 的压力以确保均匀粘合。加热组件过夜。
注意：在此步骤之后，评估粘合性能和通道变形尤为重要。
4. OSTE-COC底部通道及器件组装的准备
- 以 1.09：1 w/w 的比例混合 OSTE（对于 5 个设备，需要 1.56 g A 部分和 1.44 g B 部分）。在行星离心混合器中混合组分：以 750 RPM 混合 5 分钟，然后以 750 RPM 脱气 5 分钟。
- 将混合的OSTE转移到猎鹰管中，并在真空干燥器中以-800mbar脱气30分钟。
- 通过在 IPA 中超声处理清洁 COC 载玻片 10 分钟。用N2小心干燥载玻片。
- 将干净的COC载玻片放入等离子体筛中，并用800SCCM氧等离子体在700W功率和0.133mbar压力下处理表面2分钟。
- 将氧化的COC载玻片放在PDMS模具上作为底部通道，使处理后的表面与PDMS的结构表面接触。将组件放入原位模具中，用设置为 0.3 Nm 的扭矩扳手拧紧夹具。
- 取带有脱气 OSTE 的猎鹰管，并按照压力系统说明使用内径为 0.8 mm 的 PTFE 管进行组装。
- 将 PTFE 管连接到 PDMS 模具的入口，并使用 1000 mbar 的压力填充设备。将夹具的玻璃面朝上放入面罩对准器中，并使用 ND1100 过滤器以 33 mJ 剂量暴露。
- 曝光后，使用六角扳手拆卸夹具，然后小心地从PDMS模具中取出带有结构化OSTE层的COC载玻片。
- 将结构化的OSTE层与顶部通道组件相结合，使顶层和底层的设计相互对齐，并且OSTE底层与膜接触。
- 将设计插入原位模具中，并使用斗牛犬夹对设备均匀施加 1.6 kPa 的压力。将夹具放入 60°C 的烤箱中过夜。
注意： 夹子放置不均匀会导致粘合不均匀。
5. 设备评估
- 粘接后，用显微镜目视评估设备是否存在视觉缺陷，例如通道变形或粘接不成功。
- 通过以 30 mbar 压力将 0.02 μm 过滤的去离子水通过通道，测试设备是否没有缺陷。观察流道和鲁尔端口泄漏和水流。
注意： 如果无法检测到泄漏并且通道流动未中断，则认为设备可用于进一步实验。
6. 设备设置
- 用 2 mL 过滤的 20 nm 3% H2O2 填充两个 5 mL 注射器，并将它们安装在注射泵上（使用所需距离的移动箭头，插入注射器，并用顶杆将它们固定到位）。
谨慎！处理 H2O2 时务必小心。穿上实验室外套、橡胶防护手套和护目镜。 - 使用注射器针头将 14 cm 长 800 μm 的 PTFE 管连接到注射器，并使用鲁尔连接器连接到设备的入口。
- 将 20 cm 长 200 μm 内径的聚醚醚酮 （PEEK） 管连接到插座。
- 将PEEK管的另一端连接到废物容器。该设置如 图 3 所示。
- 每个入口以 500 μL/min 的流速启动注射泵（在仪器屏幕上：设置 > 系统设置 > 注射器（制造商：医用注射器，注射器：5 mL） > 后退按钮 >参数（选择：输注，重复：1，容量：1.5 mL，流量：500 μL/min） > 后退按钮 > 后退按钮）。将流出物收集在废物容器中。
- 用 2 mL 过滤的 20 nm 70% 乙醇填充两个新的 5 mL 注射器。
- 用充满乙醇的注射器替换以前的注射器，并使用步骤6.5中描述的相同参数启动注射泵。
- 使用新的 5 mL 注射器，并用 5 mL 20 nm 过滤磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 填充它们。
- 用充满 PBS 的注射器替换以前的注射器，并通过重复步骤 4.1 用 6.1 mL PBS 冲洗设备。和 6.5.
注意：确保将系统设置参数更改为 体积：4 mL（在仪器屏幕上： 设置>参数 >（选择： 体积：4 mL）。 - 从设备上拔下管道，然后用鲁尔塞关闭每个入口和出口。
注意： 将 PBS 留在设备中，并在关闭前使用微量移液器在每个入口和出口添加额外的 PBS 来避免滞留任何空气。 - 在室温 （RT） 下将设备放置在黑暗的地方过夜。
- 第二天，用 4 mL 20 nm 过滤的 PBS 冲洗充满 PBS 的设备（如步骤 6.8 中所述）。
- 将来自两个出口的最后1mL流出物收集到2mL蛋白质低结合管中，并储存在4°C下作为设备引入的颗粒的空白。
- 取出充满 PBS 的注射器，并用充满空气的新 5 mL 注射器替换它们。
- 用 4 mL 空气吹扫设备，直到所有液体都排出设备和管道。
7. 使用标准化乳胶珠进行设备测试
- 使用 1.0 μm 聚苯乙烯和 0.1 μm 羧酸盐珠制备标准化微珠样品。向 15 mL 试管中加入 500 μL 1.0 μm 聚苯乙烯微珠标准品、1 μL 0.1 μm 羧酸盐微珠标准品和 9499 μL 20 nm 过滤 PBS（1.0 和 0.1 μm 微珠混合物的最终浓度为 5 × 108 珠/mL 和 3.6 × 1010 珠/mL）。
- 将微珠样品涡旋30秒，并在不使用时将其储存在+4°C。
- 用 1.5 mL 标准微珠混合物填充一个新的 5 mL 注射器，用 1.5 mL 的 20 nm 过滤 PBS 填充另一个注射器。
- 取下先前连接的注射器，并将珠子混合物注射器连接到第一个入口管，另一个连接到第二个入口。
- 取出废物容器，并为每个出口管准备至少五个 0.5 mL 微量离心管。
- 将注射泵系统启动参数更改为 体积：1 mL; 流量：250 μL/min。
注： 根据用户需要，可以设置不同的流速，例如 250 μL/min、200 μL/min、150 μL/min、100 μL/min 和 50 μL/min。建议进行初步研究，为预期结果选择最有利的速度。 - 启动注射泵并收集流出 - 每个微量离心管中的 5 至 6 个液滴。
注意： 如果多次使用同一设备，请按照步骤 6.8 中的说明冲洗设备并更换所有连接器、插头和针头。清洗用过的连接器，插头和针头，将它们留在20nm过滤的70%乙醇中至少30分钟。然后，将所有部件移至装有 20 nm 过滤去离子水的试管中，彻底摇动试管，并将它们转移到含有 20 mL 20 nm 过滤去离子水的培养皿中。将培养皿以100rpm的速度留在摇床上至少30分钟，然后在重复使用之前将培养皿放在干燥的培养皿中干燥（至少12小时）。
8. 尿液样本设备测试
- 按照步骤 6.1-6.15 中的说明准备设备。
- 使用尿液无菌容器收集每位供体 100 mL 的晨尿，并在收集后 2 小时内将其送到实验室进行处理。
- 将每个尿液样品分离到两个 50 mL 试管中，并在室温下以 2'000 x g 离心 15 分钟。
- 收集上清液并丢弃沉淀。
- 在室温下以10'000 ×g 离心上清液30分钟，以除去大颗粒和细胞碎片。
- 收集上清液并丢弃沉淀。
- 按照 6.6 中的说明清洗设备。
- 将 5 mL 注射器更换为装有制备尿液样品的 20 mL 注射器用于样品入口，另一个 20 mL 注射器填充 20 mL 20 nm 过滤的 DEPC-PBS 用于缓冲液入口。将注射泵设置更改为 BDPlastipak; 注射器：cc; 容量：20 mL; 流量：250 μL/min（最佳流速），与步骤6.2中所述类似。启动注射泵，将流出的流出物收集到单独的 50 mL 管中。
- 在4°C下，使用100,000个分子量截止浓度管分别浓缩每个流通管至100μL中，每个管为3,000 ×g 。
- 将浓缩物转移到 0.5 mL 微量离心管中。
- 涡旋浓缩样品 30 秒，然后旋转 10 秒。
- 通过每管转移 25 μL 样品来分装样品，标记它们，并在 -80 °C 下冷冻以长期储存。
9. 使用调节介质进行设备测试
- 按照步骤 6.1- 6.15 中的说明准备设备。
- 根据 Bajo-Santos 等人的说法，在 37 °C 的 5% CO2 湿润环境中培养细胞，直到总数达到 1 亿个，将细胞传代到补充有 2% B-27 血清替代补充剂的 100 mL 无血清培养基中的单个 T175 悬浮瓶中，并在 37 °C 的 5% CO2 加湿环境中再培养 48 小时。
- 收集细胞悬液，并在室温下以300 ×g 离心5分钟以去除细胞。
- 在+4°C下再次以3,000 ×g 离心上清液30分钟，以除去大颗粒和细胞碎片。
- 收集上清液并将其储存在+4°C，直到可以进行分离，但不超过3小时。
- 将 5 mL 注射器更换为 20 mL 注射器，该注射器填充有准备好的条件培养基用于样品入口，并填充 20 mL 20 nm 过滤的 PBS 用于缓冲液入口。
- 按照步骤 7.8 中的说明设置泵站中的设置。
- 启动注射泵，将每个出口的流出物收集到单独的 50 mL 管中。
- 在+4°C下，使用100,000个分子量截止浓度管分别浓缩每个流通管至150μL，每个管为3,000 ×g 。
- 将浓缩物转移到 0.5 mL 微量离心管中。
- 涡旋浓缩样品 30 秒。
- 旋转浓缩样品 10 秒。
- 通过每管转移25μL样品来等分样品，标记它们，并在-80°C下冷冻以长期储存。
10. 使用超速离心分离电动汽车
- 使用带有固定角度转子的离心机，将20mL尿液或条件细胞培养基以100,000 ×g 离心70分钟，浓度为100,000×g。
- 弃去上清液并将沉淀重悬于20mL的20nm过滤PBS中。
- 再次离心，如 10.1 中所述。
- 弃去上清液并将沉淀重悬于12mL 20nm过滤的PBS中。
- 使用摆动转子在+4°C下以100,000 ×g 离心70分钟。
- 弃去上清液。
注意：这次丢弃上清液时要小心。建议使用移液管进行。 - 将沉淀重悬于100μL 20nm过滤的PBS中。
- 将样品等分并继续进行 setion 12 进行 EV 表征。否则，请储存在-80°C直至进一步使用。
11. 使用尺寸排阻色谱（SEC）分离EV
- 使用100 kDa分子量截止值（MWCO）离心过滤装置在+4°C下以3,000 ×g 浓度将20mL尿液或条件细胞培养基浓缩至500μL，持续15分钟。
- 将浓缩物转移到SEC柱上（35nm负载范围）。
- 将 20 nm 过滤的 PBS 倒入色谱柱上，并收集 15 个 0.5 mL 馏分。
- 按照制造商的说明使用动态光散射 （DLS） 系统分析馏分。
- 将选定的馏分汇集在一起。选择衰减器低于 11 且总颗粒中至少 30% 大于 40 nm 的馏分。
- 在+4°C下，使用3kDa分子量截止值（MWCO）离心过滤装置以14,000 ×g 浓度将选定的馏分浓缩至100μL，持续15分钟。
- 对样品进行分装，然后继续第 12 节进行 EV 表征。否则，请储存在-80°C直至进一步使用。
第12章 EV特性
- 从冰箱中取出待表征的样品并缓慢解冻（在冰块上或+4°C下）。
- 进行纳米颗粒跟踪分析（NTA）以确定粒径分布和量13。进行高亲和力 T 细胞膜蛋白 4 （TIM-4） 双夹心酶联免疫吸附测定 （dsELISA）14 以确认样品中是否存在 EV。
13. 国家税务总局
- 将解冻的EV样品涡旋30秒并旋转10秒，然后在2mL微量离心管中将1μL至999μL过滤的20nm过滤PBS转移至999μL，将其稀释1000倍。节省 1 mL 用于稀释的额外 PBS，以检查其是否不含颗粒。将所有东西储存在+4°C直至测量。
注意： 使用前通过 0.02 nm 过滤器过滤 PBS。 - 涡旋EV样品或空白30秒，然后使用注射器将其插入模块。用大约 0.7 mL 的样品填充模块并将其放入仪器中。
- 按照制造商的说明使用纳米颗粒分析仪仪器测量样品。
14. 用于EV标志物的dsELISA
- 制备 1 μg/mL TIM4-Fc 蛋白的溶液。通过将 100 μL 溶液转移到每个必要的孔中，涂覆 96 孔 ELISA 板的孔，并在 +4 °C 下以 200 RPM 振荡孵育过夜。
- 第二天，准备洗涤液（1x TBS + 0.05%吐温20 + 2mM CaCl2）。
- 丢弃每个孔中的所有液体。通过加入 200 μL 洗涤溶液，在室温下以 200 RPM 振荡 5 分钟，然后弃去每个孔。重复此步骤两次。
- 制备封闭溶液（1x TBS + 0.05% Tween20 + 1% 牛血清白蛋白。向每个孔中加入200μL封闭溶液，并在室温下孵育1小时，同时以200RPM振荡。
- 按照步骤14.3中的说明清洗每个孔。
- 在洗涤缓冲液中制备 220 μL 每个样品稀释液（最佳 EV 浓度为 2.7 × 105 EVs/μL）。每孔加入 100 μL 稀释样品并进行两次重复。在室温下孵育 90 分钟，同时以 200 RPM 振荡。
- 按照步骤14.3中的说明清洗每个孔。
- 向每个孔中加入 100 μL 相应的抗体。使用适当的 EV 标记来确认 EV 和污染物4.在室温下孵育2小时，同时以200RPM振荡。注意：如果使用二抗，请重复步骤14.7-14.8。但是，将二抗的孵育期减少至1小时。
- 按照步骤14.3中的说明清洗每个孔。
- 向每个孔中加入 100 μL辣根过氧化物酶底物，混合板 1 分钟，并在室温下孵育 30 分钟。
- 向每个孔中加入 1 M H2SO4 以停止反应。
- 使用酶标仪测量450nm处的吸光度。
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Representative Results
我们使用3D打印的双负模（图1）通过软光刻（图2A）制造了一种微流控装置，用于基于分叉A4F原理的高通量EV分离（图2B，C）。如图 3 所示，该装置需要一个泵和一个流通站，以便以自动化方式隔离电动汽车。首先，为了评估器件的概念验证，制备了直径为 100 nm 和 1000 nm 的聚苯乙烯珠的混合物，分别代表囊泡和细细胞碎片10。在有和没有分岔流的情况下，对珠子混合物的不同流速进行了实验，以研究线速度对分离效率的影响。在所有实验中，小珠子的回收率保持一致，高于90%10，显示了该装置回收电动汽车的潜力。
然后，我们评估并比较了 COC-OSTE 设备在以最少的预处理从复杂生物流体中分离大体积 （>1 mL） EV 的潜力。因此，使用来自10个健康供体的尿液（图4）和来自两个不同前列腺细胞系的细胞培养基（图5）作为模板，按照三种不同的程序同时分离EV：超速离心（UC），尺寸排阻色谱（SEC）和基于A4F微流体的OSTE-COC装置。分离后，使用纳米颗粒跟踪分析（NTA）评估颗粒总数及其尺寸分布。平均而言，与UC相比，OSTE-COC装置从生物流体中显示出更好的总颗粒回收率，但只有在结合来自两个端口的颗粒数时才能实现统计学意义（图4A）。为了将设备性能与其他系统进行比较，应同时考虑R&L插座。如 图 4 所示，L 和 R 出口在回收 EV 上的性能优于 UC 和 SEC。 另外，L 端口设计用于捕获较小的 EV 部分，而 R 端口旨在收集较大的 EV 部分与其他类似大小的分子。有趣的是，使用OSTE-COC器件的R-PORT的回收率略高于单独的SEC和UC（图4A）。CD63表达显示出类似的模式（图4C）。这一发现表明，OSTE-COC设备在EV总回收率方面更有效。在不同的方法之间发现了等效的粒径分布，但UC除外，其显示出更大的粒径分布（图4B）。
在细胞培养基培养物中观察到类似的结果。在这两种情况下，与SEC或UC方法相比，两个设备端口的总颗粒回收率都表现出优异的性能（如图5A，B所示）。值得注意的是，与其他实验组相比，来自 PC3 细胞的 EV 表现出明显的大小分布，L-PORT 分布具有更大的均匀性（图 5C、D）。此外，CD63 表达的分析证实了使用 COC-OSTE 设备实现的更高的 EV 回收率（如图 5E、F 所示）。表1总结了本研究中检查的不同方法的分离特性。
图 1：3DP 蛇形双负模具尺寸和等轴测视图。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2：COC-OSTE微流控装置。 （A）制造OSTE-COC装置的不同主要步骤的方案。（二）装置工作原理。（C） 成品设备的图像。比例尺：15毫米。该数字经Priedols等人10 和Bajo-Santos等人20许可修改。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：设备的实验配置。 注射泵在左边，OSTE-COC装置在中间，恢复站在右边。该数字经Priedols等人10 和Bajo-Santos等人20许可修改。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：使用超速离心 （UC）、尺寸排阻色谱 （SEC） 和 COC-OSTE 设备对 10 名供体的尿液 EV 大小分布和颗粒回收率。 （A）通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）从每种分离方法中回收的颗粒量。数据表示为平均值 +/- 标准差。用 * （p<0.05） 表示的统计显著性。（B） 箱线图显示 NTA 评估的所有尿液样品的平均粒度分布，晶须表示最小值和最大值。P值通过与UC的比较得出，****表示高统计学意义（p<0.0001）。（C） 计算所有样品的平均 CD63 量的中位数和范围，使用双夹心酶联免疫吸附测定法 （dsELISA） 评估每种分离方法。L-port：左端口;R-port：右端口。该数字已经Bajo-Santos等人许可修改20。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：使用不同方法表征从 PC3 和 LNCaP 电池中分离的 EV。 （A） 使用纳米颗粒跟踪分析 （NTA） 从 PC3 培养基中回收的颗粒量，用平均值+/- 标准差表示。（B） 使用 NTA 从 LNCaP 细胞培养基中回收的颗粒量，表示为平均值 +/- 标准差。（C） 来自 PC3 培养物的 EV 的中位粒径分布以及范围由 NTA 确定。（D） 从 LNCaP 培养物中分离出的 EV 的中位大小分布和范围。（E） 使用双夹心酶联免疫吸附测定 （dsELISA） 对 PC3 细胞系衍生的 EV 的每种分离方法的 CD63 表达的中位数和范围。（F） 每种分离方法的 dsELISA 对 LNCaP 衍生的 EV CD63 表达的中位数和范围。UC：超速离心;SEC：尺寸排阻色谱法;L-port：左端口;R-port：右端口。该数字已经Bajo-Santos等人许可修改20。 请点击这里查看此图的较大版本.
| UC公司 | 秒 | COC-OSTE | |
| 处理时间/样品 | ++/+++ | +++ | + |
| 吞吐量 | ++ | + | +++ |
| 成本/样品 | + | +++ | ++ |
| 纯度 | + | +++ | ++ |
| 自动化 | ++ | + | +++ |
| EV产量 | ++ | ++ | +++ |
| 尺寸选择 | + | ++ | ++ |
表 1.电动汽车与UC、SEC和COC-OSTE器件三种方法的隔离特性比较。 UC：超速离心;SEC：尺寸排阻色谱法。COC-OSTE：环烯烃共聚物-脱化学计量-硫醇-烯。+：低;++：中等;+++：高。* 取决于设备。
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Discussion
所提出的微流控装置为从生物体液中分离和提取 EV 提供了一种很有前途的方法，解决了现有金标准方法（如 UC 和 SEC12）的一些关键局限性。众所周知，UC 和 SEC 是劳动密集型、耗时且产量低的问题，因此不太适合需要大量电动汽车的高通量应用21,22。相比之下，所描述的微流控装置可以以最少的用户输入连续处理高达 20 mL 的大量生物液体，使其成为工业或临床环境的潜在游戏规则改变者。与涉及手动步骤的传统方法相比，这种微流控装置的主要优点之一是它能够标准化 EV 隔离并提高可重复性。通过大规模制造减少电动汽车隔离设备制造的可变性，可以更好地控制设备的性能和一致性，这对于基于电动汽车的治疗和诊断等应用至关重要。此外，该器件通过反应注射成型合适的基材与大批量生产的兼容性进一步增强了其可扩展性和更广泛采用的潜力。
为了确保可重复性和一致的性能，无论是生产芯片还是在实验中使用，都需要一个广泛且定义明确的方案。该芯片在设计时考虑了工业化。然而，在实验室环境中制造设备时，必须注意避免气泡的形成，确保精确和坚固的粘合，并以比实际实验中预期的更高的流速进行彻底的测试。这种预防措施对于COC-OSTE设备尤为重要，因为它们可能由于粘接不成功而容易泄漏，尤其是在较高流速下。此外，由于OSTE是一种感光材料，因此器件制造应在黄光下进行，以避免不必要的紫外线照射。由于这项技术仍处于初始阶段，研究人员应该尝试不同的流速，以确定其特定应用的最佳设置，因为这种新方法的标准化方案尚未建立，并且根据我们的结果，液体粘度会明显影响 EV 隔离效果。通过遵循这些指南并应对标准化的挑战，这种微流控设备在电动汽车隔离方面的潜力可以在各种研究领域和应用中得到充分实现。
使用微流控装置的 EV 隔离方法允许进行广泛的修改和故障排除以优化性能。为了改善颗粒分离，研究人员可以探索更长的通道、不同的膜孔隙率和孔密度以及改变的尺寸。如果小颗粒出口中有很多大颗粒，则测试更高的缓冲液入口速度可能是有益的，而如果大颗粒出口中有许多小颗粒，则建议使用更长的通道或具有较大孔隙的膜进行实验。解决颗粒吸收问题可能涉及调整流速、表面改性和 OSTE 成分或改变紫外线照射时间。对于遇到不稳定和泄漏的设备，降低流速和确保正确涂胶是关键步骤。为了最大限度地减少 EV 损坏，研究人员可以降低流速，在设备灭菌后用 PBS 更彻底地清洗，并考虑使用更小的膜孔或替代模具设计技术和材料。通过这些调整，可以对微流控装置进行微调，释放其在电动汽车研究和相关领域的各种应用潜力。此外，为了优化设备的性能，可以结合上游样品表征，包括密度和粘度测量，以调整流量参数。此外，鉴于生物流体的既定非无菌性，必须特别强调样品的性质23.因此，应适当考虑在临床应用中施用样品之前对样品进行灭菌。
尽管存在这些挑战，但微流控装置在各个研究领域都具有巨大的潜力。它能够从大量高度异质的样品中连续分离电动汽车，为自动化打开了大门，促进了高通量应用，并能够对来自不同来源的电动汽车进行更深入的分析。将这种微流控模块集成到不同的设备中，例如中空纤维细胞生物反应器小柱或高分辨率流式细胞仪，可以使电动汽车应用对行业更加友好，并推动药物输送、诊断和化妆品等领域的创新4。总体而言，这种微流控器件代表了电动汽车研究领域向前迈出的重要一步，为电动汽车隔离提供了一种高效和标准化的方法，在广泛的研究和工业环境中具有广阔的应用前景。
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Disclosures
A.A.、G.M. 和 R.R. 是 Cellbox Labs， LLC 的创始人、董事会成员和股东
Acknowledgments
我们感谢所有参与这项研究的捐助者，感谢拉脱维亚基因组数据库的工作人员提供样本。拉脱维亚大学固体物理研究所作为卓越中心，根据项目CAMART2第739508号赠款协议，获得了欧盟地平线2020框架计划H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2的资助。这项工作得到了拉脱维亚科学委员会项目编号的支持。LZP-2019/1-0142 和项目编号：LZP-2022/1-0373。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 µm carboxylate FluoSpheres | Invitrogen | #F8803 | Stock concentration: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT dependent) |
| 0.5 mL microcentrifuge tubes | Starstedt | 72.704 | |
| 1 mL Luer cone syringe single use without needle | RAYS | TUB1ML | |
| 1.0 µm polystyrene FluoSpheres | Invitrogen | #F13083 | Stock concentration: 1 x 1010 beads/mL (LOT dependent) |
| 10 mL Serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| 15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filters | Merck Millipore | UFC910024 | |
| 2.0 mL Protein LoBind tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| 20 mL syringes | BD PlastikPak | 10569215 | |
| 250 µm ID polyether ether ketone tubing | Darwin Microfluidics | CIL-1581 | |
| 3 kDa MWCO centrifugal filter units | Merck Millipore, | UFC200324 | |
| 5 mL Medical Syringe without Needle | Anhui Hongyu Wuzhou Medical | 159646 | |
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 70 Ti fixed angle ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| 800 µm ID polytetrafluoroethylene tubing | Darwin Microfluidics | LVF-KTU-15 | |
| 96 well microplate, f-bottom, med. binding | Greiner Bio-One | 655001 | ELISA plate |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine serum albumin | SigmaAldrich | A7906-100G | |
| COC Topas microscopy slide platform | Microfluidic Chipshop | 10000002 | |
| COC Topas microscopy slide platform 2 x 16 Mini Luer | Microfluidic Chipshop | 10000387 | |
| Elveflow OB1 pressure controller | Elvesys Group | ||
| Luer connectors | Darwin Microfluidics | CS-10000095 | |
| Mask aligner Suss MA/BA6 | SUSS MicroTec Group | ||
| Mixer Thinky ARE-250 | Thinky Corporation | ||
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | nanoparticle analyzer |
| Optical microscope Nikon Eclipse LV150N | Nikon Metrology NV | ||
| OSTE 322 Crystal Clear | Mercene Labs | ||
| PBS TABLETS.Ca/Mg free. Fisher Bioreagents. 100 g | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| PC membrane (50 nm pore diameter, 11.8% density) | it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium | ||
| Petri dishes, sterile | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| Plasma Asher GIGAbatch 360 M | PVA TePla America, LLC | ||
| qEVoriginal/35 nm column | Izon | SP5 | SEC column |
| QSIL 216 Silicone Elastomer Kit | PP&S | ||
| Resin Tough Black | Zortrax | ||
| SW40 Ti swing ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 331301 | |
| Syringe pump | DK Infusetek | ISPLab002 | |
| T175 suspension flask | Sarstedt | 83.3912.502 | |
| TIM4-Fc protein | Adipogen LifeSciences | AG-40B-0180B-3010 | |
| TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) | SigmaAldrich | T0440-100ML | Horseradish peroxidase substrate |
| Tween20 | SigmaAldrich | P1379-100ML | |
| Ultracentrifuge Optima L100XP | Beckman Coulter | ||
| Ultrasonic cleaning unit P 60 H | Elma Schmidbauer GmbH | ||
| Universal Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek instruments | 71777-1 | |
| Urine collection cup, 150mL, sterile | APTACA | 2120_SG | |
| Whatman Anotop 25 Syringe Filter | SigmaAldrich | 68092002 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | dynamic light scattering (DLS) system | |
| Zortrax Inkspire | Zortrax |
References
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