Summary
Hücre dışı veziküller biyomedikal uygulamalar için büyük umut vaat etmektedir, ancak mevcut izolasyon yöntemleri zaman alıcıdır ve klinik kullanım için pratik değildir. Bu çalışmada, hücre dışı veziküllerin büyük hacimli biyoakışkanlardan minimum adımlarla sürekli bir şekilde doğrudan izolasyonunu sağlayan bir mikroakışkan cihaz sunuyoruz.
Abstract
Hücre dışı veziküller (EV'ler), teşhis, ilaç dağıtımı ve rejeneratif tıp dahil olmak üzere çeşitli biyomedikal uygulamalar için muazzam bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, EV'leri izole etmeye yönelik mevcut metodolojiler, karmaşıklık, zaman tüketimi ve klinik çevirilerini engelleyen hantal ekipman ihtiyacı gibi önemli zorluklar ortaya koymaktadır. Bu sınırlamaları ele almak için, EV'lerin büyük hacimli numunelerden sürekli bir şekilde verimli bir şekilde izole edilmesi için siklik olefin kopolimer-stokiyometri dışı tiyol-ene (COC-OSTE) dayalı yenilikçi bir mikroakışkan sistem geliştirmeyi amaçladık. Boyut ve kaldırma kuvvetine dayalı ayırmayı kullanarak, bu çalışmada kullanılan teknoloji, idrar ve hücre ortamı örneklerinden elde edilen mevcut yaklaşımlara kıyasla önemli ölçüde daha dar bir boyut dağılımı elde etti ve gelecekteki uygulamalarda belirli EV boyut fraksiyonlarının hedeflenmesini sağladı. Çatallı asimetrik akış alan akış fraksiyonlama teknolojisini kullanan yenilikçi COC-OSTE mikroakışkan cihaz tasarımımız, büyük hacimli numuneler için basit ve sürekli bir EV izolasyon yaklaşımı sunar. Ayrıca, bu mikroakışkan cihazın seri üretim potansiyeli, ölçeklenebilirlik ve tutarlılık sunarak, EV izolasyonunu, yüksek tutarlılık ve verimin temel gereksinimler olduğu rutin klinik teşhis ve endüstriyel süreçlere entegre etmeyi mümkün kılar.
Introduction
Hücre dışı veziküller (EV'ler), iki ana tip içeren hücre kaynaklı zara bağlı parçacıklardır: eksozomlar (30-200 nm) ve mikro-veziküller (200-1000 nm)1. Eksozomlar, multiveziküler bir cisim (MVB) içinde endozomal membranın içe doğru tomurcuklanması yoluyla oluşur ve plazma membranı1 ile füzyon üzerine hücre dışı boşluğa intraluminal vezikülleri (ILV'ler) serbest bırakır. Buna karşılık, mikro-parçacıklar, hücre zarının2 dışa doğru tomurcuklanması ve fisyonu ile üretilir. EV'ler, proteinleri, nükleik asitleri, lipitleri ve metabolitleri taşıyarak, büyüme, anjiyogenez, metastaz, proliferasyon ve tedavi direnci dahil olmak üzere hücrenin fizyolojik durumunu yansıtarak hücreler arası iletişimde çok önemli bir rol oynar3. Sonuç olarak, kanser de dahil olmak üzere hastalıklar için umut verici biyobelirteçler ve terapötik hedefler olarak ortaya çıkmışlar ve teşhis ve ilaç dağıtım sistemlerindeki potansiyellerini vurgulamışlardır4.
Hastalık teşhisi ve tedavisinde EV'leri tam olarak kullanmak için, çeşitli biyosıvılardan verimli izolasyon çok önemlidir5. Yaygın yöntemler arasında ultrasantrifüjleme (UC), yoğunluk gradyanlı santrifüjleme, boyut dışlama kromatografisi (SEC), filtrasyon ve immünoizolasyon6 bulunur. UC yaygın olarak kullanılan bir tekniktir, ancak EV olmayan ve EV agregaları üretebilen benzer yoğunlukta parçacıklar verebilir7. SEC, yoğunluk8 yerine boyuta dayalı parçacıkları hariç tutarak daha yüksek saflıkta numuneler sağlama yeteneği nedeniyle popülerlik kazanmıştır. Bununla birlikte, SEC kolonu için uygun gözenek boyutunun dikkatli bir şekilde seçilmesi ve kromatografi koşullarının optimizasyonu, şilomikronlar ve düşük yoğunluklu lipoproteinler gibi istenmeyen partiküllerin birlikte izolasyonunu en aza indirmek için gereklidir8. Etkinliklerine rağmen, her iki yöntem de özellikle hücre ortamı veya idrar gibi daha büyük hacimli numuneler için zaman alıcı ve otomatikleştirilmesi zordur, bu da endüstriyel uygulamalar için ölçeklenebilirliklerini sınırlar9.
Son yıllarda, asimetrik alan akış alanı fraksiyonlaması (A4F), boyut ve kaldırma kuvvetine dayalı mikro ve nanometre boyutlu partikül ayırma için güçlü bir ayırma tekniği olarak gelişmiştir10. A4F'nin çalışma prensibi, tabanında gözenekli bir zar bulunan ve çapraz akış10 adı verilen zara uygulanan bir kuvvet üreten bir mikroakışkan kanala dayanır. Sisteme özgü Brown hareketi ve Poiseuille akışı ile birleştirildiğinde, çapraz akış, akış dinamikleri11 içindeki değişen parçacık konumu nedeniyle verimli parçacık ayrımını kolaylaştırır. Faydalarına rağmen, bu yöntem mikrolitre aralığındaki numune hacimleri12 ile sınırlıdır ve işlemin süresiniuzatan ek bir odaklama adımı gerektirir 10.
Son on yılda, mikroakışkanlar hızlı, verimli ve klinik olarak güvenilir EV ayrımı için bir araç olarak öne çıkmıştır13. Bununla birlikte, EV ayırma için tasarlanan çoğu mikroakışkan yöntem, küçük hacimli, yüksek konsantrasyonlu EV numuneleri için optimize edilmiştir veya karmaşık ayırma prosedürlerinebağlıdır 14. Ayrıca, mikroakışkanlar alanında, polidimetilsiloksan (PDMS), optik şeffaflığı, biyouyumluluğu ve kullanım kolaylığı nedeniyle altın standart malzeme olarak kabul edilmektedir15. Bununla birlikte, EV'ler de dahil olmak üzere küçük lipofilik molekülleri absorbe etme eğilimi, EV alanındaki uygulaması için sorunlu olabilir13.
Siklik olefin kopolimeri (COC), biyouyumluluk, moleküllerin küçük absorpsiyonu ve yüksek kimyasal direnci nedeniyle mikroakışkanlarda sıklıkla kullanılan bir malzemedir15. Bununla birlikte, COC cihazlarının imalatı genellikle karmaşık süreçleri veya özel ekipmanı içerir16. Alternatif olarak, stokiyometri dışı tiyol-en (OSTE), küçük moleküllerin emiliminin azalması, üstün kimyasal stabilite, üretim kolaylığı ve ölçeklenebilir üretim süreci nedeniyle PDMS'ye umut verici bir alternatiftir17,18. Bununla birlikte, borulara yapılan karmaşık bağlantılar nedeniyle, cihazlar sızıntıyaeğilimli olabilir 19.
Bu çalışmanın amacı, idrar veya hücre ortamı gibi büyük hacimli numunelerden EV ayrımı için OSTE ve COC ve çatallı A4F prensibini birleştiren bir mikroakışkan cihaz tasarlamak ve üretmekti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Numune toplama Letonya Üniversitesi Yaşam ve Tıp Bilimleri Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (karar N0-71-35/54)
NOT: Bu çalışmada kullanılan malzemeler Table of Materials dosyasında yer almaktadır.
1. Üç boyutlu (3D) baskılı kalıp imalatı
- Üst kanal için aşağıdaki boyutlara sahip CAD yazılımında serpantin şeklinde bir çift negatif kalıp tasarlayın: 0,5 mm yükseklik, 1 mm genişlik ve 210 mm uzunluk. Alt kanal için 1,5 mm genişliğinde, 0,6 mm yüksekliğinde ve 210 mm uzunluğunda aynı tasarımı kullanın. Kalıp genişliği, uzunluğu, yüksekliği ve tasarım izometrik gösterimi gibi boyutlar Şekil 1'de gösterilmiştir. Tasarımı .stl dosyası olarak kaydedin.
- Dosyayı Z-Suite'te hazırlayın; Desteğin eklenmesine gerek yoktur. Sert siyah reçineli ultraviyole sıvı kristal ekran (UV LCD) 3D yazıcı kullanarak kalıpları yazdırın.
- Yazdırdıktan sonra, kalıpları yazıcı yüzeyinden dikkatlice çıkarın. Kalıpları izopropanol (IPA) içinde 20 dakika boyunca sonikasyonda yıkayın.
- Kalıpları N2 ile kurutun.
- Kalıpları 33 saniye boyunca bir ND810 filtresi kullanarak su baskınına maruz bırakın, ardından 60 °C'de 48 saat fırına koyun.
2. PDMS kalıplarının hazırlanması
- PDMS'yi 10:1 w/w oranında ağırlıklandırın (her kalıp için 16 g elastomer baz ve 1,6 g çapraz bağlama maddesi kullanın). Bileşenleri bir planet santrifüj karıştırıcıda karıştırın, 500 RPM'de 1 dakika karıştırın.
- Karışık PDMS'yi 3D baskılı kalıplara dökün ve 30 dakika boyunca veya kabarcık görülmeyene kadar -800 mbar'da bir vakumlu desikatörde gazdan arındırın.
- Sıvı PDMS'nin üzerine dikkatlice 100 μm kalınlığında bir polivinil klorür astarı yerleştirin.
NOT: Kabarcık oluşumunu önlemek için astarı bir taraftan diğerine yavaşça uygulayın. - Kalıbı PDMS ile bir Yerinde Kalıp Mastarına yerleştirin ve 0,3 Nm'ye ayarlanmış bir tork anahtarı kullanarak mastarı sıkın.
- PDMS'yi kürlemek için aparatı 60 °C'lik bir fırına 3 saat koyun.
- Altıgen bir anahtar kullanarak aparatı sökün ve 3D baskılı kalıbı jigden çıkarın.
- PDMS kalıplarını 3D baskılı ana kalıplardan dikkatlice çıkarın, kalıbın kenarlarında bir neşter ile dolaşın ve ardından kalıbı cımbızla çıkarın.
NOT: Kalıbın daha kolay çıkarılması için IPA kullanılabilir; bununla birlikte, fazla IPA'yı buharlaştırmak için kalıpların daha sonra 10 dakika boyunca 60 °C'de ısıtılması gerekir.
3. OSTE-COC üst kanalının hazırlanması
- 1,09:1 w/w oranında ağırlık OSTE (5 cihaz için 1,56 g A parçası ve 1,44 g B parçası gereklidir). Bileşenleri bir planet santrifüj karıştırıcıda karıştırın: 750 RPM'de 5 dakika karıştırın, ardından 750 RPM'de 5 dakika gazdan arındırın.
- Karışık OSTE'yi bir santrifüj tüpüne aktarın ve 30 dakika boyunca bir vakumlu desikatörde -800 mbar'da gazdan arındırın.
- 10 dakika boyunca IPA'da sonikasyon ile 2 x 16 mini Luer konektörlü COC slaytlarını temizleyin. Slaytları N2 ile dikkatlice kurulayın.
- Temiz COC slaytlarını, düz yüzey yukarı doğru yerleştirilecek şekilde plazma değiştiriciye yerleştirin ve yüzeye 0,133 mbar basınçla 700 W güçte 2 dakika boyunca 800 SCCM oksijen plazması uygulayın.
- Oksitlenmiş COC slaytını, işlenmiş yüzey PDMS'nin yapılandırılmış yüzeyi ile temas halinde olacak şekilde üst kanal için PDMS kalıbına yerleştirin. Düzeneği, 0,3 Nm'ye ayarlanmış bir tork anahtarıyla sıkarak bir Yerinde Kalıp aparatına yerleştirin.
- Basınç sistemini 6 bar'da basınçlı hava hattına bağlayın. Gazdan arındırılmış OSTE'li santrifüj tüpünü alın ve 0,8 mm iç çapa (ID) sahip politetrafloretilen (PTFE) boru kullanarak basınç sistemi talimatlarına göre monte edin.
- PTFE tüpünü PDMS kalıbının girişine bağlayın ve basınç sisteminde bulunan bir piezoelektrik pompa tarafından sağlanan 1000 mbar basıncı kullanarak cihazı doldurun. Jig'i cam tarafı yukarı bakacak şekilde maske hizalayıcıya yerleştirin ve ND33 filtresini kullanarak 850 mJ dozla pozlayın.
- Maruz kaldıktan sonra, altıgen bir anahtar kullanarak aparatı sökün ve yapılandırılmış OSTE katmanına sahip COC slaytını PDMS kalıbından dikkatlice çıkarın.
- Yapılandırılmış OSTE'yi, kanalların membranla tamamen kaplanması için 50 nm gözeneklere ve %11,8 gözenek yoğunluğuna sahip 25 mm x 75 mm'lik bir membranla temas ettirin.
NOT: Uygulama işlemi sırasında membranın mümkün olduğunca düz tutulması özellikle önemlidir. - Düzeneği, membran tarafı yukarı bakacak şekilde 60°C'ye ayarlanmış bir sıcak plakaya yerleştirin, membranın üzerine temiz bir cam sürgü yerleştirin ve eşit yapışmayı sağlamak için üstten 1.6 kPa basınç uygulayın. Düzeneği gece boyunca ısıtın.
NOT: Bu adımdan sonra, yapıştırma performansını ve kanal deformasyonunu değerlendirmek özellikle önemlidir.
4. OSTE-COC alt kanalının hazırlanması ve cihaz montajı
- OSTE'yi 1,09:1 w/w oranında karıştırın (5 cihaz için 1,56 g A parçası ve 1,44 g B parçası gereklidir). Bileşenleri bir planet santrifüj karıştırıcıda karıştırın: 750 RPM'de 5 dakika karıştırın, ardından 750 RPM'de 5 dakika gazdan arındırın.
- Karışık OSTE'yi bir şahin tüpüne aktarın ve 30 dakika boyunca bir vakumlu desikatörde -800 mbar'da gazdan arındırın.
- 10 dakika boyunca IPA'da sonikasyon ile COC slaytlarını temizleyin. Slaytları N2 ile dikkatlice kurulayın.
- Temiz COC slaytlarını plazma asher'e yerleştirin ve yüzeye 0,133 mbar basınçla 700 W güçte 2 dakika boyunca 800 SCCM oksijen plazması uygulayın.
- Oksitlenmiş COC slaytını, işlenmiş yüzey PDMS'nin yapılandırılmış yüzeyi ile temas halinde olacak şekilde alt kanal için PDMS kalıbına yerleştirin. Düzeneği, 0,3 Nm'ye ayarlanmış bir tork anahtarıyla sıkarak bir Yerinde Kalıp aparatına yerleştirin.
- Gazdan arındırılmış OSTE'li şahin tüpünü alın ve 0,8 mm iç çapa sahip PTFE boru kullanarak basınç sistemi talimatlarına göre monte edin.
- PTFE tüpünü PDMS kalıbının girişine bağlayın ve 1000 mbar basınç kullanarak cihazı doldurun. Jig'i cam tarafı yukarı bakacak şekilde maske hizalayıcıya yerleştirin ve ND33 filtresini kullanarak 1100 mJ dozla pozlayın.
- Maruz kaldıktan sonra, altıgen bir anahtar kullanarak aparatı sökün ve yapılandırılmış OSTE katmanına sahip COC slaytını PDMS kalıbından dikkatlice çıkarın.
- Üst ve alt katmanın tasarımı birbiriyle hizalanacak ve OSTE alt katmanının membran ile temas halinde olması için yapılandırılmış OSTE katmanını üst kanal düzeneğiyle birleştirin.
- Tasarımı bir Yerinde Kalıp aparatına yerleştirin ve bulldog klipsleri kullanarak cihaza eşit şekilde 1.6 kPa basınç uygulayın. Jig'i gece boyunca 60°C'lik bir fırına koyun.
NOT: Klipslerin eşit olmayan şekilde yerleştirilmesi eşit olmayan yapışmaya neden olabilir.
5. Cihaz değerlendirmesi
- Yapıştırma işleminden sonra, örneğin kanalın deformasyonu veya başarısız yapıştırma gibi görsel kusurlar için cihazları mikroskopla görsel olarak değerlendirin.
- 0,02 μm filtrelenmiş deiyonize suyu 30 mbar basınçtaki kanallardan geçirerek cihazları hatasız olarak test edin. Akış kanalı ve Luer portu sızıntılarını ve su akışını gözlemleyin.
NOT: Herhangi bir sızıntı tespit edilemezse ve kanal akışı kesintisizse, cihazlar daha sonraki deneyler için kullanılabilir kabul edilir.
6. Cihaz kurulumu
- İki adet 5 mL'lik şırıngayı 2 mL 20 nm filtrelenmiş %3H2O2 ile doldurun ve bir şırınga pompasına takın (gerekli mesafe için hareket oklarını kullanın, şırıngaları yerleştirin ve üst çubukla yerlerine sabitleyin).
DİKKAT! H2O2 tutarken daima dikkatli olun. Laboratuvar önlüğü, koruyucu lastik eldiven ve göz koruması giyin. - 14 cm uzunluğunda 800 μm ID PTFE boruyu şırınga iğnelerini kullanarak şırıngalara ve Luer konektörlerini kullanarak cihazın girişlerine bağlayın.
- 20 cm uzunluğunda 200 μm ID polieter eter keton (PEEK) borusunu çıkışlara bağlayın.
- PEEK hortumunun diğer ucunu bir atık kabına bağlayın. Kurulum Şekil 3'te görülebilir.
- Şırınga pompasını her giriş için 500 μL/dak akış hızında başlatın (cihaz ekranında: Ayarlar > Sistem Seti > Şırınga (üretici: tıbbi şırınga, şırınga: 5 mL) > Geri düğmesi > Parametreler (Seçin: demleme, Tekrar: 1, Hacim: 1,5 mL, Akış: 500 μL/dak) > Geri düğmesi > Geri düğmesi). Akışı bir atık kabında toplayın.
- İki yeni 5 mL şırıngayı 2 mL 20 nm filtrelenmiş %70 etanol ile doldurun.
- Önceki şırıngaları etanol dolu şırıngalarla değiştirin ve adım 6.5'te açıklanan aynı parametreleri kullanarak şırınga pompasını çalıştırın.
- Yeni 5 mL'lik şırıngalar kullanın ve bunları 5 mL 20 nm filtrelenmiş fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurun.
- Önceki şırıngaları PBS dolu şırıngalarla değiştirin ve 6.1 adımlarını tekrarlayarak cihazı 4 mL PBS ile yıkayın. ve 6.5.
NOT: Sistem kurulum parametrelerini Ses Düzeyi: 4 mL olarak değiştirdiğinizden emin olun (cihaz ekranında: Ayarlar > Parametreler > (Seçin: Ses: 4 mL). - Boruyu cihazdan çıkarın ve her giriş ve çıkışı Luer fişleriyle kapatın.
NOT: PBS'yi cihazda bırakın ve kapatmadan önce bir mikropipet kullanarak her giriş ve çıkışa ek PBS ekleyerek havanın sıkışmasını önleyin. - Cihazı gece boyunca oda sıcaklığında (RT) karanlık bir yerde bırakın.
- Ertesi gün, PBS dolgulu cihazı 4 mL 20 nm filtrelenmiş PBS ile yıkayın (adım 6.8'de açıklandığı gibi).
- Her iki çıkıştan akışın son 1 mL'sini 2 mL protein düşük bağlayıcı bir tüpte toplayın ve cihaz tarafından verilen parçacıklar için 4 ° C'de boş olarak saklayın.
- PBS dolu şırıngaları çıkarın ve hava dolu yeni 5 mL şırıngalarla değiştirin.
- Tüm sıvı cihazdan ve hortumdan çıkana kadar cihazı 4 mL hava ile boşaltın.
7. Standartlaştırılmış lateks boncuklarla cihaz testi
- 1.0 μm polistiren ve 0.1 μm karboksilat boncuklar kullanarak standartlaştırılmış bir boncuk numunesi hazırlayın. 15 mL'lik bir tüpe 500 μL 1.0 μm polistiren boncuk standartları, 1 μL 0.1 μm karboksilat boncuk standartları ve 9499 μL 20 nm filtrelenmiş PBS ekleyin (1.0 ve 0.1 μm boncuk karışımının nihai konsantrasyonu sırasıyla 5 × 108 boncuk/mL ve 3.6 × 1010 boncuk/mL olacaktır).
- Boncuk örneğini 30 saniye boyunca vorteksleyin ve kullanılmadığı zaman +4 °C'de saklayın.
- Yeni bir 5 mL şırıngayı 1.5 mL standart boncuk karışımı ve diğerini 1.5 mL 20 nm filtrelenmiş PBS ile doldurun.
- Önceden takılmış şırıngaları çıkarın ve boncuk karışımı şırıngasını birinci giriş borusuna ve diğerini ikinci girişe takın.
- Atık kabını çıkarın ve her çıkış borusu için en az beş adet 0,5 mL mikrosantrifüj tüpü hazırlayın.
- Şırınga pompası sistemi başlatma parametrelerini Hacim: 1 mL olarak değiştirin; Akış: 250 μL/dak.
NOT: Kullanıcının ihtiyacına bağlı olarak 250 μL/dk, 200 μL/dk, 150 μL/dk, 100 μL/dk ve 50 μL/dk gibi farklı akış hızları ayarlanabilir. İstenen sonuç için en uygun hızı seçmek için bir ön çalışma yapılması önerilir. - Şırınga pompasını çalıştırın ve çıkışı toplayın - her mikrosantrifüj tüpünde 5 ila 6 damlacık.
NOT: Aynı cihaz birden çok kez kullanılıyorsa, cihazı adım 6.8'de açıklandığı gibi yıkayın ve tüm konektörleri, fişleri ve iğneleri değiştirin. Kullanılmış konektörleri, tapaları ve iğneleri en az 30 dakika boyunca 20 nm filtrelenmiş %70 etanol içinde bırakarak yıkayın. Ardından, tüm parçaları 20 nm filtrelenmiş deiyonize su içeren bir tüpe taşıyın, tüpü iyice çalkalayın ve 20 mL 20 nm filtrelenmiş deiyonize su içeren bir Petri kabına aktarın. Petri kabını çalkalayıcıda 100 rpm'de en az 30 dakika bırakın, ardından tekrar kullanmadan önce kuru bir Petri kabında (en az 12 saat) kurumaya bırakın.
8. İdrar örnekleriyle cihaz testi
- Cihazı 6.1-6.15 adımlarında açıklandığı gibi hazırlayın.
- İdrar steril kapları kullanarak donör başına 100 mL sabah idrarı toplayın ve toplandıktan sonraki 2 saat içinde işlenmek üzere laboratuvara teslim edin.
- Her idrar örneğini iki adet 50 mL'lik tüpe ayırın ve RT'de 15 dakika boyunca 2'000 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı toplayın ve peleti atın.
- Büyük parçacıklardan ve hücre kalıntılarından kurtulmak için süpernatanı RT'de 30 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı toplayın ve peleti atın.
- Cihazı 6.6'da açıklandığı gibi yıkayın.
- 5 mL'lik şırıngaları, numune girişi için hazırlanan idrar numunesi ile doldurulmuş 20 mL'lik bir şırıngaya ve tampon girişi için 20 mL 20 nm filtrelenmiş DEPC-PBS ile doldurulmuş başka bir 20 mL'lik şırıngaya değiştirin. Şırınga pompası ayarlarını BDPlastipak olarak değiştirin; Şırınga: cc; Hacim: 20 mL; Akış: 250 μL/dak (optimum akış hızı), adım 6.2'de açıklandığı gibi. Şırınga pompasını çalıştırın ve her çıkıştan gelen akışı ayrı 50 mL'lik tüplerde toplayın.
- 4 °C'de 3.000 x g'da her biri 100 μL'ye kadar 100.000 moleküler ağırlıklı kesme konsantrasyon tüpü kullanarak her akışı ayrı ayrı konsantre edin.
- Konsantreleri 0.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
- Konsantre numuneleri 30 saniye vorteksleyin, ardından 10 saniye döndürün.
- Tüp başına 25 μL numune aktararak numuneleri ayırın, etiketleyin ve uzun süreli saklama için -80 °C'de dondurun.
9. Şartlandırılmış ortamla cihaz testi
- Cihazı 6.1-6.15 adımlarında açıklandığı gibi hazırlayın.
- Bajo-Santos ve ark.20'ye göre, toplam sayı 100 milyona ulaşana kadar 37 ° C'de %5CO2 nemlendirilmiş bir ortamda kültür hücreleri, 100 mL serumsuz ortamda tek bir T175 süspansiyon şişesine geçirin, %2 B-27 serum ikame takviyesi ve kültür, ek 48 saat boyunca 37 ° C'de %5CO2 nemlendirilmiş ortamda.
- Hücre süspansiyonunu toplayın ve hücrelerden kurtulmak için RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
- Büyük parçacıklardan ve hücre kalıntılarından kurtulmak için süpernatanı +4 °C'de 30 dakika boyunca 3.000 x g'de tekrar toplayın ve santrifüjleyin.
- Süpernatanı toplayın ve ayırma gerçekleşene kadar, ancak 3 saatten fazla olmamak üzere + 4 ° C'de saklayın.
- 5 mL'lik şırıngaları, numune girişi için hazırlanmış şartlandırılmış ortamla doldurulmuş ve tampon girişi için 20 mL 20 nm filtrelenmiş PBS ile doldurulmuş 20 mL şırıngalarla değiştirin.
- Pompa istasyonundaki ayarları adım 7.8'de açıklandığı gibi yapın.
- Şırınga pompasını çalıştırın ve her çıkıştan gelen akışı ayrı bir 50 mL'lik tüpte toplayın.
- +4 °C'de 3.000 x g'da her biri 150 μL'ye kadar 100.000 moleküler ağırlıklı kesme konsantrasyon tüpü kullanarak her akışı ayrı ayrı konsantre edin.
- Konsantreleri 0.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
- 30 sn boyunca vorteks konsantre numuneler.
- Konsantre numuneleri 10 saniye boyunca döndürün.
- Tüp başına 25 μL numune aktararak numuneleri ayırın, etiketleyin ve uzun süreli saklama için -80 °C'de dondurun.
10. Ultrasantrifüj kullanılarak EV'lerin izolasyonu
- Sabit açılı rotorlu bir santrifüj kullanarak +4 °C'de 70 dakika boyunca 100.000 x g'da 20 mL idrar veya şartlandırılmış hücre ortamını santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve peleti 20 mL 20 nm filtrelenmiş PBS'de yeniden süspanse edin.
- 10.1'de açıklandığı gibi tekrar santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın ve peleti 12 mL 20 nm filtrelenmiş PBS'de yeniden süspanse edin.
- Döner rotor kullanarak +4 °C'de 70 dakika boyunca 100.000 x g'da santrifüjleyin.
- Süpernatanı atın.
NOT: Bu sefer süpernatanı atarken dikkatli olun. Pipetle yapılması tavsiye edilir. - Peletin 100 μL'lik 20 nm filtrelenmiş PBS'de yeniden süspanse edilmesi.
- Numuneyi alın ve EV karakterizasyonu için ayar 12'ye geçin. Aksi takdirde, daha fazla kullanana kadar -80 °C'de saklayın.
11. Boyut dışlama kromatografisi (SEC) kullanılarak EV'lerin izolasyonu
- 15 dakika boyunca +4 ° C'de 3.000 x g'de 100 kDa moleküler ağırlık kesme (MWCO) santrifüj filtre üniteleri kullanarak 20 mL idrar veya şartlandırılmış hücre ortamını 500 μL'ye konsantre edin.
- Konsantreyi SEC kolonuna (35 nm yük aralığı) aktarın.
- 20 nm filtrelenmiş PBS'yi kolona dökün ve 0,5 mL'lik 15 fraksiyon toplayın.
- Üreticinin talimatlarını izleyerek dinamik ışık saçılımı (DLS) sistemi ile kesirleri analiz edin.
- Seçilen kesirleri bir araya getirin. Zayıflatıcısı 11'den düşük olan ve toplam parçacıkların en az %30'u 40 nm'den büyük olan kesirleri seçin.
- Seçilen fraksiyonları, 15 dakika boyunca +4 °C'de 14.000 x g'da 3 kDa moleküler ağırlık kesme (MWCO) santrifüj filtre üniteleri kullanarak 100 μL'ye konsantre edin.
- Numuneyi alın ve EV karakterizasyonu için bölüm 12'ye geçin. Aksi takdirde, daha fazla kullanana kadar -80 °C'de saklayın.
12. EV karakterizasyonu
- Karakterize edilecek numuneyi dondurucudan alın ve yavaşça çözdürün (bir buz bloğu üzerinde veya +4 °C'de).
- Partikül boyutu dağılımını ve miktarını belirlemek için nanopartikül izleme analizi (NTA)gerçekleştirin 13. Numunelerde EV varlığını doğrulamak için yüksek afiniteli T hücresi membran proteini 4 (TIM-4) çift sandviç enzime bağlı immünosorbent testi (dsELISA)14 gerçekleştirin.
13. NTA
- Çözülmüş EV örneğini 30 saniye vorteksleyin ve 10 saniye döndürün, ardından 1000 kat seyreltmek için 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 1 μL'den 999 μL'ye 20 nm filtrelenmiş PBS aktarın. Partikül içermediğini kontrol etmek için seyreltme için kullanılan 1 mL ekstra PBS'den tasarruf edin. Ölçüme kadar her şeyi +4 °C'de saklayın.
NOT: PBS'yi kullanmadan önce 0.02 nm filtreden geçirin. - EV örneğini veya boşluğunu 30 saniye boyunca vorteksleyin ve bir şırınga kullanarak modüle yerleştirin. Modülü yaklaşık 0.7 mL numune ile doldurun ve cihaza yerleştirin.
- Üreticinin talimatlarını izleyerek nanopartikül analizörü cihazını kullanarak numuneyi ölçün.
14. EV işaretleyicileri için dsELISA
- 1 μg/mL TIM4-Fc proteininden oluşan bir çözelti hazırlayın. Gerekli her kuyucuğa 100 μL çözelti aktararak 96 oyuklu bir ELISA plakasının kuyucuklarını kaplayın ve 200 RPM'de çalkalayarak gece boyunca +4 °C'de inkübe edin.
- Ertesi gün, yıkama solüsyonu hazırlayın (1x TBS +% 0.05 Tween20 + 2 mM CaCl2).
- Her kuyucuktaki tüm sıvıyı atın. Her birini 200 μL yıkama solüsyonu ekleyerek, RT'de 5 dakika boyunca 200 RPM'de çalkalayarak ve atarak iyice yıkayın. Bu adımı iki kez tekrarlayın.
- Bloke edici çözelti hazırlayın (1x TBS +% 0.05 Tween20 +% 1 sığır serum albümini. Her kuyucuğa 200 μL bloke edici çözelti ekleyin ve 200 RPM'de çalkalarken RT'de 1 saat inkübe edin.
- Her birini adım 14.3'te açıklandığı gibi yıkayın.
- Yıkama tamponunda her numune seyreltmesinden 220 μL hazırlayın (optimum EV konsantrasyonu 2,7 × 105 EVs/μL'dir). Oyuk başına 100 μL seyreltilmiş numune ekleyin ve iki kopya gerçekleştirin. 200 RPM'de çalkalarken RT'de 90 dakika inkübe edin.
- Her birini adım 14.3'te açıklandığı gibi yıkayın.
- Her oyuğa 100 μL karşılık gelen antikor ekleyin. EV'leri ve kirleticileri doğrulamak için uygun EV işaretleyicileri kullanın4. 200 RPM'de çalkalarken RT'de 2 saat inkübe edin. NOT: İkincil antikorlar kullanılıyorsa, 14.7-14.8 arasındaki adımları tekrarlayın. Bununla birlikte, ikincil antikorların kuluçka süresini 1 saate düşürün.
- Her birini adım 14.3'te açıklandığı gibi yıkayın.
- Her oyuğa 100 μL yaban turpu peroksidaz substratı ekleyin, plakayı 1 dakika karıştırın ve RT'de 30 dakika inkübe edin.
- Reaksiyonu durdurmak için her kuyucuğa 1 M H2S04 ekleyin.
- Bir mikroplaka okuyucu kullanarak, absorbansı 450 nm'de ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çatallı A4F prensibine dayalı yüksek verimli EV ayrımı için yumuşak litografi (Şekil 2A) aracılığıyla 3D baskılı çift negatif kalıp (Şekil 1) kullanarak bir mikroakışkan cihaz ürettik (Şekil 2B,C). Kurulum, EV'lerin otomatik bir şekilde izolasyonu için Şekil 3'te görülebileceği gibi bir pompa ve bir akış istasyonu gerektirir. İlk olarak, cihazların kavram kanıtını değerlendirmek için, sırasıyla vezikülleri ve ince hücre kalıntılarını temsil etmek için100 nm ve 1000 nm çapında bir polistiren boncuk karışımı hazırlandı 10. Doğrusal hızın ayırma verimliliği üzerindeki etkisini araştırmak için hem çatallanma akışlı hem de çatallanma akışı olmayan boncuk karışımı için değişen akış hızlarıyla deneyler yapıldı. Tüm deneylerde, küçük boncukların geri kazanımı tutarlı ve %90'ın üzerinde kaldı10, bu da cihazın EV'leri kurtarma potansiyelini gösterdi.
Ardından, COC-OSTE cihazının EV'leri büyük hacimlerden (>1 mL) karmaşık biyoakışkanlardan minimum ön işlemle izole etme potansiyelini değerlendirdik ve karşılaştırdık. Bu nedenle, 10 sağlıklı donörden alınan idrar (Şekil 4) ve iki farklı prostat hücre hattından (Şekil 5) alınan hücre ortamı, üç farklı prosedürü izleyerek EV'leri aynı anda izole etmek için bir şablon olarak kullanıldı: ultrasantrifüj (UC), boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve A4F mikroakışkan tabanlı OSTE-COC cihazı. İzolasyondan sonra, toplam partikül sayısı ve boyut dağılımı nanopartikül izleme analizi (NTA) kullanılarak değerlendirildi. Ortalama olarak, OSTE-COC cihazı, UC'ye kıyasla biyoakışkanlardan daha iyi toplam partikül geri kazanımı gösterdi, ancak istatistiksel anlamlılık yalnızca her iki porttan partikül sayıları birleştirildiğinde elde edildi (Şekil 4A). Cihaz performansını diğer sistemlerle karşılaştırmak için R&L çıkışının birlikte değerlendirilmesi gerekir. Şekil 4'te gösterildiği gibi, EV'lerin kurtarılmasındaki L & R çıkışı birlikte performansı UC ve SEC'den daha iyi performans gösterir. Ayrı olarak, L-portu küçük EV fraksiyonunu yakalamak için tasarlanırken, R-portu daha büyük EV fraksiyonunu benzer boyuttaki diğer moleküllerle toplamak için tasarlanmıştır. İlginç bir şekilde, OSTE-COC cihazının R-PORT'u kullanılarak yapılan kurtarma, tek başına SEC ve UC'den biraz daha yüksekti (Şekil 4A). CD63 ekspresyonu da benzer bir model gösterdi (Şekil 4C). Bu bulgu, OSTE-COC cihazının toplam EV geri kazanımında daha etkili olduğunu göstermektedir. Daha büyük bir parçacık boyutu dağılımı gösteren UC hariç, farklı metodolojiler arasında eşdeğer boyut dağılımı bulunmuştur (Şekil 4B).
Hücre ortamı kültürlerinde karşılaştırılabilir sonuçlar gözlendi. Her iki senaryoda da, her iki cihaz portundan toplam partikül geri kazanımı, SEC veya UC metodolojilerine kıyasla üstün performans sergilemiştir (Şekil 5A,B'de gösterildiği gibi). Özellikle, PC3 hücrelerinden türetilen EV'ler, diğer deney gruplarıyla karşılaştırıldığında L-PORT dağılımında daha fazla homojenlik ile farklı bir boyut dağılımı göstermiştir (Şekil 5C, D). Ayrıca, CD63 ekspresyonunun analizi, COC-OSTE cihazı kullanılarak elde edilen daha yüksek EV geri kazanım oranlarını doğruladı (Şekil 5E, F'de gösterildiği gibi). Bu çalışmada incelenen farklı metodolojilerin izolasyon özelliklerini karşılaştıran bir özet Tablo 1'de bulunabilir.
Şekil 1: 3DP serpantin şeklindeki çift negatif kalıp boyutları ve izometrik görünüm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: COC-OSTE mikroakışkan cihazı. (A) OSTE-COC cihazının imalatının farklı ana adımlarının şeması. (B) Cihaz çalışma prensibi. (C) Bitmiş cihazın görüntüsü. Ölçek çubuğu: 15 mm. Bu rakam Priedols ve ark.10 ve Bajo-Santos ve ark.20'nin izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Cihazın deneysel konfigürasyonu. Şırınga pompası solda, OSTE-COC cihazı ortada ve kurtarma istasyonu sağda. Bu rakam Priedols ve ark.10 ve Bajo-Santos ve ark.20'nin izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Ultrasantrifüj (UC), boyut dışlama kromatografisi (SEC) ve COC-OSTE cihazı kullanılarak 10 donörden idrar EV boyut dağılımı ve partikül geri kazanımı. (A) Nanopartikül izleme analizi (NTA) ile her bir izolasyon yönteminden elde edilen partikül miktarı. Veriler ortalama +/- standart sapma olarak temsil edilir. İstatistiksel anlamlılık * ile gösterilir (p<0.05). (B) Kutu grafikleri, NTA tarafından değerlendirilen tüm idrar örnekleri arasındaki ortalama partikül boyutu dağılımını gösterir ve bıyıklar minimum ve maksimum değerleri gösterir. P değerleri, UC ile yapılan karşılaştırmalardan elde edildi ve **** yüksek istatistiksel anlamlılığı gösterdi (p<0.0001). (C) Her bir izolasyon yöntemi için çift sandviç enzime bağlı immünosorbent testi (dsELISA) kullanılarak değerlendirilen ortalama CD63 miktarının medyanı ve aralığı tüm numunelerde hesaplandı. L bağlantı noktası: Sol bağlantı noktası; R-port: Sağ port. Bu rakam Bajo-Santos ve ark.20'nin izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: PC3 ve LNCaP hücrelerinden izole edilen EV'lerin farklı yöntemler kullanılarak karakterizasyonu. (A) Ortalama+/- standart sapma ile temsil edilen nanopartikül izleme analizi (NTA) kullanılarak PC3 ortamından geri kazanılan partikül miktarı. (B) Ortalama +/- standart sapma olarak temsil edilen NTA kullanılarak LNCaP hücre ortamından geri kazanılan partikül miktarı. (C) PC3 kültürlerinden EV'lerin medyan partikül boyutu dağılımı, aralık ile birlikte NTA tarafından belirlenmiştir. (D) Menzilli LNCaP kültürlerinden izole edilen EV'lerin medyan boyut dağılımı. (E) Çift sandviç enzime bağlı immünosorbent testi (dsELISA) kullanılarak PC3 hücre hattından türetilen EV için her bir izolasyon yöntemi için medyan ve CD63 ekspresyon aralığı. (F) Her bir izolasyon yöntemi için dsELISA tarafından LNCaP'den türetilen EV CD63 ekspresyonunun medyanı ve aralığı. UC: Ultrasantrifüjleme; SEC: Boyut dışlama kromatografisi; L bağlantı noktası: Sol bağlantı noktası; R-port: Sağ port. Bu rakam Bajo-Santos ve ark.20'nin izniyle değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| UC | SN | COC-OSTE | |
| İşlem süresi/numune | ++/+++ | +++ | + |
| Verim | ++ | + | +++ |
| Maliyet/örnek | + | +++ | ++ |
| Saflık | + | +++ | ++ |
| Otomasyon | ++ | + | +++ |
| EV Verimi | ++ | ++ | +++ |
| Boyut seçimi | + | ++ | ++ |
Tablo 1. EV'lerin izolasyon özelliklerinin üç yöntemle karşılaştırılması: UC, SEC ve COC-OSTE cihazı. UC: Ultrasantrifüjleme; SEC: Boyut dışlama kromatografisi. COC-OSTE: siklik olefin kopolimer-stokiyometri dışı tiyol-en. +: düşük; ++: orta; +++: yüksek. * Cihaza bağlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sunulan mikroakışkan cihaz, UC ve SEC12 gibi mevcut altın standart yöntemlerin bazı kritik sınırlamalarını ele alarak, EV'lerin biyolojik sıvılardan izolasyonu ve ekstraksiyonu için umut verici bir yöntem sunmaktadır. UC ve SEC'in emek yoğun, zaman alıcı olduğu ve düşük verimden muzdarip olduğu bilinmektedir, bu da onları büyük miktarlarda EV'ye ihtiyaç duyulan yüksek verimli uygulamalar için daha az uygun hale getirir21,22. Buna karşılık, tarif edilen mikroakışkan cihaz, minimum kullanıcı girdisi ile 20 mL'ye kadar önemli bir biyolojik sıvı hacmini sürekli olarak işleyebilir ve bu da onu endüstriyel veya klinik ortamlar için potansiyel bir oyun değiştirici haline getirir. Bu mikroakışkan cihazın en önemli avantajlarından biri, manuel adımları içeren geleneksel yöntemlere kıyasla EV izolasyonunu standartlaştırma ve tekrarlanabilirliği artırma yeteneğidir. Seri üretim yoluyla EV izolasyon cihazı üretiminin değişkenliğini azaltarak, cihazın performansı daha iyi kontrol edilebilir ve tutarlı olabilir, bu da EV tabanlı terapötikler ve teşhis gibi uygulamalar için hayati önem taşır. Ayrıca, cihazın uygun alt tabakaların reaksiyon enjeksiyonlu kalıplaması yoluyla büyük hacimli üretimle uyumluluğu, ölçeklenebilirlik ve daha geniş çapta benimsenme potansiyelini daha da artırır.
Tekrarlanabilirliği ve tutarlı performansı sağlamak için, hem çipi üretmek hem de deneylerde kullanmak için kapsamlı ve iyi tanımlanmış bir protokol gereklidir. Çip, sanayileşme göz önünde bulundurularak tasarlanmıştır. Bununla birlikte, laboratuvar ortamında cihaz imalatı sırasında, kabarcık oluşumundan kaçınmaya, hassas ve sağlam bir bağlanma sağlamaya ve gerçek deneylerde beklenenden daha yüksek akış hızlarında kapsamlı testler yapmaya dikkat edilmelidir. Bu önlem, özellikle daha yüksek akış hızlarında başarısız bağlanma nedeniyle sızıntıya eğilimli olabileceğinden, COC-OSTE cihazları için özellikle önemlidir. Ek olarak, OSTE ışığa duyarlı bir malzeme olduğundan, gereksiz UV'ye maruz kalmayı önlemek için cihaz imalatı sarı ışıkta yapılmalıdır. Bu teknoloji henüz başlangıç aşamasında olduğundan, bu yeni yöntem için standartlaştırılmış protokoller henüz oluşturulmadığından ve sıvı viskozitesi, sonuçlarımıza dayanarak EV izolasyon etkinliğini açıkça etkileyebileceğinden, araştırmacılar kendi özel uygulamaları için en uygun ayarı belirlemek için farklı akış hızlarını denemelidir. Bu yönergeleri izleyerek ve standardizasyonun zorluklarını ele alarak, bu mikroakışkan cihazın EV izolasyonu için potansiyeli, çeşitli araştırma alanları ve uygulamalarında tam olarak gerçekleştirilebilir.
Mikroakışkan cihazı kullanan EV izolasyon yöntemi, performansı optimize etmek için kapsamlı modifikasyon ve sorun gidermeye izin verir. Parçacık ayrımını iyileştirmek için araştırmacılar daha uzun kanalları, farklı membran gözenekliliklerini ve gözenek yoğunluklarını ve değişen boyutları keşfedebilirler. Küçük partikül çıkışında çok sayıda büyük partikül varsa, daha yüksek bir tampon giriş hızının test edilmesi faydalı olabilirken, büyük partikül çıkışında çok sayıda küçük partikül varsa, daha uzun bir kanal veya daha büyük gözenekli bir membran ile deney yapılması önerilir. Partikül absorpsiyonunun ele alınması, akış hızlarının, yüzey modifikasyonlarının ve OSTE bileşiminin ayarlanmasını veya UV'ye maruz kalma süresinin değiştirilmesini içerebilir. Kararsızlık ve sızıntı yaşayan cihazlar için akış hızlarının düşürülmesi ve uygun yapıştırmanın sağlanması çok önemli adımlardır. EV hasarını en aza indirmek için araştırmacılar akış hızlarını azaltabilir, cihaz sterilizasyonundan sonra PBS ile daha kapsamlı bir şekilde yıkayabilir ve daha küçük membran gözenekleri veya alternatif kalıp tasarım teknikleri ve malzemeleri kullanmayı düşünebilir. Bu ayarlamalar sayesinde, mikroakışkan cihaza ince ayar yapılabilir ve EV araştırmaları ve ilgili alanlarda çeşitli uygulamalar için potansiyelini ortaya çıkarır. Ek olarak, cihazın performansını optimize etmek için, akış parametrelerini ayarlamak için yoğunluk ve viskozite ölçümleri dahil olmak üzere yukarı akış numune karakterizasyonu dahil edilebilir. Ayrıca, biyoakışkanların steril olmadığı göz önüne alındığında, numunenin doğasına özel önem verilmelidir23. Sonuç olarak, klinik uygulamalarda örneklerin uygulanmadan önce sterilizasyonu gerektiği gibi düşünülmelidir.
Bu zorluklara rağmen, mikroakışkan cihaz çeşitli araştırma alanlarında muazzam bir potansiyele sahiptir. EV'leri büyük hacimlerde yüksek oranda heterojen numunelerden sürekli olarak izole etme yeteneği, otomasyonun kapısını açar, yüksek verimli uygulamaları kolaylaştırır ve çeşitli kaynaklardan gelen EV'lerin daha derinlemesine analizini sağlar. Bu mikroakışkan modülün içi boş fiber hücreli biyoreaktör kartuşları veya yüksek çözünürlüklü akış sitometreleri gibi farklı cihazlara entegre edilmesi, EV uygulamalarını daha endüstri dostu hale getirebilir ve ilaç dağıtımı, teşhis ve kozmetik gibi alanlarda yeniliği teşvik edebilir4. Genel olarak, bu mikroakışkan cihaz, EV araştırmaları alanında ileriye doğru atılmış önemli bir adımı temsil eder ve çok çeşitli araştırmalarda ve endüstriyel ortamlarda umut verici uygulamalarla EV izolasyonu için verimli ve standartlaştırılmış bir yöntem sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A.A., G.M. ve R.R., Cellbox Labs, LLC'nin kurucuları, yönetim kurulu üyeleri ve hisse sahipleridir
Acknowledgments
Bu çalışmaya katılan tüm bağışçılara, Letonya Genom Veritabanı personeline örnekleri sağladıkları için teşekkür ederiz. Letonya Üniversitesi Katıhal Fiziği Enstitüsü, Mükemmeliyet Merkezi olarak, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 Çerçeve Programı H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2'den 739508 No'lu hibe sözleşmesi, proje CAMART2. kapsamında fon aldı. Bu çalışma Letonya Bilim Konseyi Proje No. tarafından desteklenmiştir. lzp-2019/1-0142 ve Proje No: lzp-2022/1-0373.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 µm carboxylate FluoSpheres | Invitrogen | #F8803 | Stock concentration: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT dependent) |
| 0.5 mL microcentrifuge tubes | Starstedt | 72.704 | |
| 1 mL Luer cone syringe single use without needle | RAYS | TUB1ML | |
| 1.0 µm polystyrene FluoSpheres | Invitrogen | #F13083 | Stock concentration: 1 x 1010 beads/mL (LOT dependent) |
| 10 mL Serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| 15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filters | Merck Millipore | UFC910024 | |
| 2.0 mL Protein LoBind tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| 20 mL syringes | BD PlastikPak | 10569215 | |
| 250 µm ID polyether ether ketone tubing | Darwin Microfluidics | CIL-1581 | |
| 3 kDa MWCO centrifugal filter units | Merck Millipore, | UFC200324 | |
| 5 mL Medical Syringe without Needle | Anhui Hongyu Wuzhou Medical | 159646 | |
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 70 Ti fixed angle ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| 800 µm ID polytetrafluoroethylene tubing | Darwin Microfluidics | LVF-KTU-15 | |
| 96 well microplate, f-bottom, med. binding | Greiner Bio-One | 655001 | ELISA plate |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine serum albumin | SigmaAldrich | A7906-100G | |
| COC Topas microscopy slide platform | Microfluidic Chipshop | 10000002 | |
| COC Topas microscopy slide platform 2 x 16 Mini Luer | Microfluidic Chipshop | 10000387 | |
| Elveflow OB1 pressure controller | Elvesys Group | ||
| Luer connectors | Darwin Microfluidics | CS-10000095 | |
| Mask aligner Suss MA/BA6 | SUSS MicroTec Group | ||
| Mixer Thinky ARE-250 | Thinky Corporation | ||
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | nanoparticle analyzer |
| Optical microscope Nikon Eclipse LV150N | Nikon Metrology NV | ||
| OSTE 322 Crystal Clear | Mercene Labs | ||
| PBS TABLETS.Ca/Mg free. Fisher Bioreagents. 100 g | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| PC membrane (50 nm pore diameter, 11.8% density) | it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium | ||
| Petri dishes, sterile | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| Plasma Asher GIGAbatch 360 M | PVA TePla America, LLC | ||
| qEVoriginal/35 nm column | Izon | SP5 | SEC column |
| QSIL 216 Silicone Elastomer Kit | PP&S | ||
| Resin Tough Black | Zortrax | ||
| SW40 Ti swing ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 331301 | |
| Syringe pump | DK Infusetek | ISPLab002 | |
| T175 suspension flask | Sarstedt | 83.3912.502 | |
| TIM4-Fc protein | Adipogen LifeSciences | AG-40B-0180B-3010 | |
| TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) | SigmaAldrich | T0440-100ML | Horseradish peroxidase substrate |
| Tween20 | SigmaAldrich | P1379-100ML | |
| Ultracentrifuge Optima L100XP | Beckman Coulter | ||
| Ultrasonic cleaning unit P 60 H | Elma Schmidbauer GmbH | ||
| Universal Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek instruments | 71777-1 | |
| Urine collection cup, 150mL, sterile | APTACA | 2120_SG | |
| Whatman Anotop 25 Syringe Filter | SigmaAldrich | 68092002 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | dynamic light scattering (DLS) system | |
| Zortrax Inkspire | Zortrax |
References
- Colombo, M., et al. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Tricarico, C., et al. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Wang, Z. Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances. Biomed Pharmacother. 153, 113480 (2022).
- Royo, F., et al. Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee. Cells. 9 (9), 1955 (2020).
- Sidhom, K., et al. A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option. Int J Mol Sci. 21 (18), 6466 (2020).
- Reshi, Q. U. A., et al. Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns. Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).
- Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. J Chromatogr A. 1636, 461773 (2021).
- Priedols, M., et al. Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation. Polymers. 15 (4), 789 (2023).
- Zhang, H., Lyden, D. Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization. Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).
- Talebjedi, B., et al. Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment. Front Vet Sci. 7, 620809 (2020).
- van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).
- Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
- Bussooa, A., et al. Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices. Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198 (2022).
- Tang, L., Lee, N. Y. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).
- Borda, E., et al. Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets. Biomaterials. 293, 121979 (2023).
- Sandström, N., et al. Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002 (2015).
- Sticker, D., et al. Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).
- Bajo-Santos, C., et al. Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device. Int J Mol Sci. 24 (9), 7971 (2023).
- Claridge, B., et al. Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities. Front Cell Dev Biol. 9, 734720 (2021).
- Rezaie, J., et al. Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges. Cell Commun Signal. 20 (1), 145 (2022).
- Aragón, I. M., et al. The urinary tract microbiome in health and disease. Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).
