Summary
Ekstracellulære vesikler har et enormt løfte til biomedicinske anvendelser, men de nuværende isoleringsmetoder er tidskrævende og upraktiske til klinisk brug. I denne undersøgelse præsenterer vi en mikrofluidisk enhed, der muliggør direkte isolering af ekstracellulære vesikler fra store mængder biofluider på en kontinuerlig måde med minimale trin.
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EV'er) har et enormt potentiale for forskellige biomedicinske anvendelser, herunder diagnostik, lægemiddelafgivelse og regenerativ medicin. Ikke desto mindre udgør de nuværende metoder til isolering af elbiler betydelige udfordringer, såsom kompleksitet, tidsforbrug og behovet for omfangsrigt udstyr, hvilket hindrer deres kliniske oversættelse. For at afhjælpe disse begrænsninger sigtede vi mod at udvikle et innovativt mikrofluidisk system baseret på cyklisk olefincopolymer-off-støkiometri thiol-en (COC-OSTE) til effektiv isolering af elbiler fra prøver i store mængder på en kontinuerlig måde. Ved at udnytte størrelses- og opdriftsbaseret adskillelse opnåede teknologien, der blev anvendt i denne undersøgelse, en signifikant smallere størrelsesfordeling sammenlignet med eksisterende tilgange fra urin- og cellemedieprøver, hvilket muliggør målretning af specifikke EV-størrelsesfraktioner i fremtidige applikationer. Vores innovative COC-OSTE mikrofluidiske enhedsdesign, der anvender bifurcated asymmetrisk flowfelt-flow-fraktioneringsteknologi, tilbyder en ligetil og kontinuerlig EV-isoleringstilgang til prøver i store mængder. Desuden tilbyder potentialet for massefremstilling af denne mikrofluidiske enhed skalerbarhed og konsistens, hvilket gør det muligt at integrere EV-isolering i rutinemæssig klinisk diagnostik og industrielle processer, hvor høj konsistens og gennemstrømning er væsentlige krav.
Introduction
Ekstracellulære vesikler (EV'er) er celleafledte membranbundne partikler, der omfatter to hovedtyper: exosomer (30-200 nm) og mikrovesikler (200-1000 nm)1. Exosomer dannes gennem indadgående spirende af endosomalmembranen i et multivesikulært legeme (MVB), der frigiver intraluminale vesikler (ILV'er) i det ekstracellulære rum ved fusion med plasmamembranen1. I modsætning hertil genereres mikrovesikler ved udadgående spirende og fission af cellemembranen2. EV'er spiller en afgørende rolle i intercellulær kommunikation ved at transportere proteiner, nukleinsyrer, lipider og metabolitter, hvilket afspejler cellens fysiologiske tilstand, herunder vækst, angiogenese, metastase, proliferation og terapiresistens3. Som følge heraf har de vist sig at være lovende biomarkører og terapeutiske mål for sygdomme, herunder kræft, hvilket fremhæver deres potentiale inden for diagnostik og lægemiddelafgivelsessystemer4.
For fuldt ud at udnytte elbiler i sygdomsdiagnostik og terapi er effektiv isolering fra forskellige biofluider afgørende5. Almindelige metoder omfatter ultracentrifugering (UC), densitetsgradientcentrifugering, størrelseseksklusionskromatografi (SEC), filtrering og immunisolering6. UC er en meget anvendt teknik, men kan give partikler med lignende tæthed, der ikke er elbiler og kan generere EV-aggregater7. SEC har vundet popularitet på grund af dets evne til at levere prøver med højere renhed ved at udelukke partikler baseret på størrelse snarere end densitet8. Imidlertid er omhyggelig udvælgelse af den passende porestørrelse til SEC-søjlen og optimering af kromatografiforhold afgørende for at minimere co-isolering af uønskede partikler som chylomicroner og lipoproteiner med lav densitet8. På trods af deres effektivitet er begge metoder tidskrævende og udfordrende at automatisere, især for prøver med større mængder som cellemedier eller urin, hvilket begrænser deres skalerbarhed til industrielle applikationer9.
I de senere år har asymmetrisk feltstrømningsfeltfraktionering (A4F) udviklet sig som en kraftfuld separationsteknik til størrelses- og opdriftsbaseret partikelseparation i mikro- og nanometerstørrelse10. Det operationelle princip for A4F er afhængig af en mikrofluidisk kanal udstyret med en porøs membran ved dens base, hvilket genererer en kraft, der udøves mod membranen kaldet cross-flow10. Når det kombineres med brownsk bevægelse og Poiseuille-flow, der er iboende for systemet, letter tværflow effektiv partikelseparation på grund af varierende partikelposition inden for flowdynamikken11. På trods af fordelene er denne metode begrænset til prøvevolumener inden for mikroliterområdet12 og kræver et yderligere fokuseringstrin, hvilket forlænger varigheden af processen10.
I løbet af det sidste årti har mikrofluidik fået fremtrædende plads som et værktøj til hurtig, effektiv og klinisk pålidelig EV-adskillelse13. Imidlertid er de fleste mikrofluidiske metoder designet til EV-adskillelse optimeret til EV-prøver med små volumener og høj koncentration eller afhænger af komplekse separationsprocedurer14. Inden for mikrofluidik anerkendes polydimethylsiloxan (PDMS) desuden som det gyldne standardmateriale på grund af dets optiske gennemsigtighed, biokompatibilitet og brugervenlighed15. Ikke desto mindre kan dets kendte tilbøjelighed til at absorbere små lipofile molekyler, herunder EV'er, være problematisk for dets anvendelse i EV-feltet13.
Cyklisk olefincopolymer (COC) er et hyppigt anvendt materiale i mikrofluidik på grund af biokompatibilitet, lille absorption af molekyler og høj kemisk resistens15. Fremstillingen af COC-enheder involverer imidlertid ofte komplekse processer eller specialudstyr16. Alternativt er off-støkiometri thiol-en (OSTE) et lovende alternativ til PDMS på grund af nedsat absorption af små molekyler, overlegen kemisk stabilitet, let fremstilling og skalerbar fabrikationsproces17,18. På grund af komplekse forbindelser til slanger kan enheder imidlertid være tilbøjelige til at lække19.
Formålet med denne undersøgelse var at konstruere og fremstille en mikrofluidisk enhed, der kombinerer OSTE og COC og bifurcated A4F-princip til EV-adskillelse fra prøver med store mængder såsom urin eller cellemedier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prøveindsamlingen blev godkendt af Letlands Universitets Etiske Komité for Livs- og Lægevidenskabelig Forskning (afgørelse N0-71-35/54)
BEMÆRK: De materialer, der er brugt i denne undersøgelse, er inkluderet i filen Materialetabel .
1. Tredimensionel (3D) trykt formfabrikation
- Design en serpentinformet dobbelt negativ form i CAD-software med følgende dimensioner til topkanalen: højde på 0,5 mm, bredde på 1 mm og længde på 210 mm. Til bundkanalen skal du bruge det samme design med en bredde på 1,5 mm, en højde på 0,6 mm og en længde på 210 mm. Dimensioner som formbredde, længde, højde og design isometrisk illustration er vist i figur 1. Gem designet som .stl-fil.
- Forbered filen i Z-Suite; Ingen support behøver at blive tilføjet. Udskriv formene ved hjælp af en ultraviolet flydende krystalskærm (UV LCD) 3D-printer med hård sort harpiks.
- Efter udskrivning skal du forsigtigt fjerne formene fra printeroverfladen. Vask formene i isopropanol (IPA) i sonikering i 20 min.
- Føntør formene med N2.
- Udsæt formene for oversvømmelseseksponering ved hjælp af et ND33-filter i 810 s, og sæt dem derefter i en ovn ved 60 ° C i 48 timer.
2. Forberedelse af PDMS-formene
- Vægt PDMS i forholdet 10: 1 w / w (for hver form skal du bruge 16 g elastomerbase og 1,6 g tværbindingsmiddel). Bland komponenterne i en planetcentrifugalblander, bland i 1 min ved 500 omdr./min.
- Støb det blandede PDMS i de 3D-printede forme og afgas i en vakuumekssikkator ved -800 mbar i 30 minutter, eller indtil der ikke observeres bobler.
- Anbring forsigtigt en 100 μm tyk polyvinylchloridforing oven på det flydende PDMS.
BEMÆRK: Påfør foringen langsomt fra den ene side til den anden for at undgå bobledannelse. - Indsæt formen med PDMS i en Mold-in-Place Jig, og stram jiggen ved hjælp af en momentnøgle, der er indstillet til 0,3 Nm.
- Sæt jiggen i en 60 ° C ovn i 3 timer for at hærde PDMS.
- Demonter jiggen ved hjælp af en hex-nøgle, og fjern den 3D-printede form fra jiggen.
- Afform forsigtigt PDMS-forme fra de 3D-printede masterforme, løb rundt om formens kanter med en skalpel, og fjern derefter formen med pincet.
BEMÆRK: For lettere fjernelse af skimmelsvamp kan IPA bruges; formene skal dog opvarmes til 60 °C i 10 minutter bagefter for at fordampe overskydende IPA.
3. Forberedelse af OSTE-COC topkanal
- Vægt OSTE ved 1,09:1 w/w forhold (for 5 enheder kræves 1,56 g A-del og 1,44 g B-del). Bland komponenterne i en planetcentrifugalblander: Bland i 5 minutter ved 750 omdr./min., afgas derefter i 5 minutter ved 750 omdr./min.
- Den blandede OSTE overføres til et centrifugerør og afgasses ved -800 mbar i en vakuumekssikkator i 30 min.
- Rengør COC dias med 2 x 16 mini Luer stik ved sonikering i IPA i 10 min. Tør forsigtigt diasene med N2.
- Placer de rene COC-glider ind i plasmaaskeren, så den flade overflade placeres opad, og behandl overfladen med 800 SCCM oxygenplasma i 2 minutter ved 700 W effekt med 0,133 mbar tryk.
- Placer det oxiderede COC-glas på PDMS-formen til den øverste kanal, så den behandlede overflade er i kontakt med PDMS's strukturerede overflade. Anbring enheden i en Mold-in-Place-jig, og stram jiggen med en momentnøgle, der er indstillet til 0,3 Nm.
- Tilslut tryksystemet til trykluftledningen ved 6 bar. Tag centrifugerøret med afgasset OSTE og saml det i henhold til tryksysteminstruktionerne ved hjælp af polytetrafluorethylen (PTFE) rør med 0,8 mm indvendig diameter (ID).
- Tilslut PTFE-røret til indløbet til PDMS-formen, og fyld enheden ved hjælp af 1000 mbar tryk, der opretholdes af en piezoelektrisk pumpe placeret i tryksystemet. Placer jiggen med glassiden opad i maskejusteringen, og udsæt den med 850 mJ dosis ved hjælp af ND33-filter.
- Efter eksponering adskilles jiggen ved hjælp af en hex-nøgle og fjernes forsigtigt COC-objektglasset med det strukturerede OSTE-lag fra PDMS-formen.
- Bring den strukturerede OSTE i kontakt med en 25 mm x 75 mm membran med 50 nm porer og 11,8% poretæthed, så kanalerne er helt dækket af membranen.
BEMÆRK: Det er især vigtigt at holde membranen så lige som muligt under påføringsprocessen. - Placer enheden på en varmeplade, der er indstillet til 60 °C med membransiden opad, placer en ren glasglide oven på membranen, og påfør et tryk på 1,6 kPa fra toppen for at sikre jævn binding. Opvarm samlingen natten over.
BEMÆRK: Efter dette trin er det især vigtigt at evaluere bindingsydelse og kanaldeformation.
4. Forberedelse af OSTE-COC bundkanal og enhedssamling
- Bland OSTE i forholdet 1,09:1 w/w (for 5 enheder kræves 1,56 g A-del og 1,44 g B-del). Bland komponenterne i en planetcentrifugalblander: bland i 5 minutter ved 750 omdr./min., afgas derefter i 5 minutter ved 750 omdr./min.
- Overfør den blandede OSTE til et falkerør og afgas ved -800 mbar i en vakuumekssikkator i 30 min.
- Rens COC dias ved sonikering i IPA i 10 minutter. Tør forsigtigt diasene med N2.
- Anbring de rene COC-glider i plasmaaske, og behandl overfladen med 800 SCCM oxygenplasma i 2 minutter ved 700 W effekt med 0,133 mbar tryk.
- Placer det oxiderede COC-glas på PDMS-formen til bundkanalen, så den behandlede overflade er i kontakt med PDMS's strukturerede overflade. Anbring enheden i en Mold-in-Place-jig, og stram jiggen med en momentnøgle, der er indstillet til 0,3 Nm.
- Tag falkerøret med afgasset OSTE og saml det i henhold til tryksysteminstruktionerne ved hjælp af PTFE-rør med 0,8 mm ID.
- Tilslut PTFE-røret til PDMS-formens indløb, og fyld enheden ved hjælp af 1000 mbar tryk. Placer jiggen med glassiden opad i maskejusteringsjusteringen og udsæt med 1100 mJ dosis ved hjælp af ND33-filter.
- Efter eksponering adskilles jiggen ved hjælp af en hex-nøgle og fjernes forsigtigt COC-objektglasset med det strukturerede OSTE-lag fra PDMS-formen.
- Kombiner det strukturerede OSTE-lag med den øverste kanalsamling, så designet af det øverste og nederste lag er justeret med hinanden, og at OSTE-bundlaget er i kontakt med membranen.
- Indsæt designet i en Mold-in-Place-jig, og påfør et tryk på enheden jævnt ved hjælp af bulldogclips. Sæt jiggen i en 60 ° C ovn natten over.
BEMÆRK: Ujævn placering af clipsene kan føre til ujævn binding.
5. Evaluering af udstyr
- Efter limning skal du visuelt evaluere enhederne med et mikroskop for visuelle defekter, for eksempel deformation af kanalen eller mislykket binding.
- Test enhederne uden defekter ved at føre 0,02 μm filtreret deioniseret vand gennem kanalerne med 30 mbar tryk. Hold øje med flowkanal- og Luer-portlækager og vandstrøm.
BEMÆRK: Hvis der ikke kan registreres lækage, og kanalstrømmen er uafbrudt, betragtes enheder som anvendelige til yderligere eksperimenter.
6. Opsætning af enhed
- Fyld to 5 ml sprøjter med 2 ml 20 nm filtreret 3% H2O2 og sæt dem på en sprøjtepumpe (brug bevægelsespilene til den nødvendige afstand, indsæt sprøjter og fastgør dem på plads med den øverste bjælke).
FORSIGTIGHED! Vær altid forsigtig, når du håndterer H2O2. Brug en laboratoriefrakke, beskyttende gummihandsker og øjenbeskyttelse. - Tilslut 14 cm lang 800 μm ID PTFE-slange til sprøjterne ved hjælp af sprøjtenålene og til enhedens indløb ved hjælp af Luer-stik.
- Tilslut 20 cm lange 200 μm ID polyetherether keton (PEEK) slanger til stikkontakterne.
- Tilslut den anden ende af PEEK-slangen til en affaldsbeholder. Opsætningen kan ses i figur 3.
- Start sprøjtepumpen med en fremløbshastighed på 500 μL/min for hvert indtag (på instrumentskærmen: Indstillinger > System Indstil > Sprøjte (producent: medicinsk sprøjte, sprøjte: 5 ml) > Tilbage-knap > Parametre (Vælg: infusion, Gentag: 1, Volumen: 1,5 ml, Flow: 500 μL/min) > Tilbage-knap > Tilbage-knap ). Opsaml gennemstrømningen i en affaldsbeholder.
- Fyld to nye 5 ml sprøjter med 2 ml 20 nm filtreret 70% ethanol.
- Udskift de tidligere sprøjter med de ethanolfyldte sprøjter, og start sprøjtepumpen med de samme parametre som beskrevet i trin 6.5.
- Brug nye 5 ml sprøjter og fyld dem med 5 ml 20 nm filtreret fosfatbufret saltvand (PBS).
- Udskift de tidligere sprøjter med PBS-fyldte sprøjter, og skyl apparatet med 4 ml PBS ved at gentage trin 6.1. og 6.5.
BEMÆRK: Sørg for at ændre systemopsætningsparametrene til Lydstyrke: 4 ml (på instrumentskærmen: Indstillinger > Parametre > (Vælg: Lydstyrke: 4 ml). - Tag slangen ud af enheden, og luk hvert indløb og stikkontakt med Luer-stik.
BEMÆRK: Lad PBS blive i enheden, og undgå at fange luft ved at tilføje yderligere PBS på hvert indtag og udløb ved hjælp af en mikropipette før lukning. - Lad enheden stå natten over på et mørkt sted ved stuetemperatur (RT).
- Den følgende dag skylles den PBS-fyldte enhed med 4 ml 20 nm filtreret PBS (som beskrevet i trin 6.8).
- De sidste 1 ml af gennemstrømningen fra begge udløb opsamles i et 2 ml proteinrør med lav binding og opbevares ved 4 °C som blindprøve for partikler, der indføres af enheden.
- Fjern de PBS-fyldte sprøjter og erstat dem med nye 5 ml sprøjter fyldt med luft.
- Rens enheden med 4 ml luft, indtil al væsken er kommet ud af enheden og slangen.
7. Test af enhed med standardiserede latexperler
- Forbered en standardiseret perleprøve ved hjælp af 1,0 μm polystyren og 0,1 μm carboxylatperler. Til et 15 ml rør tilsættes 500 μL 1,0 μm polystyrenperlestandarder, 1 μL 0,1 μm carboxylatperlestandarder og 9499 μL 20 nm filtreret PBS (endelig koncentration på 1,0 og 0,1 μm perleblanding vil være 5 × 108 perler / ml og 3,6 × 1010 perler / ml respektfuldt).
- Perleprøven hvirvel i 30 sek. og opbevar den ved +4 °C, mens den ikke er i brug.
- Fyld en ny 5 ml sprøjte med 1,5 ml af den standardiserede perleblanding og en anden med 1,5 ml 20 nm filtreret PBS.
- Fjern de tidligere påsatte sprøjter, og fastgør perleblandingssprøjten til den første indløbsslange og den anden til den anden indløb.
- Fjern affaldsbeholderen, og forbered mindst fem 0,5 ml mikrocentrifugerør til hver udløbsslange.
- Skift opstartsparametrene for sprøjtepumpesystemet til Volumen: 1 ml; Flow: 250 μL/min.
BEMÆRK: Afhængigt af brugerens behov kan forskellige flowhastigheder såsom 250 μL / min, 200 μL / min, 150 μL / min, 100 μL / min og 50 μL / min indstilles. En foreløbig undersøgelse for at vælge den mest gunstige hastighed for det ønskede resultat anbefales. - Start sprøjtepumpen og saml udstrømningen - 5 til 6 dråber i hvert mikrocentrifugerør.
BEMÆRK: Hvis den samme enhed bruges flere gange, skal du skylle enheden som beskrevet i trin 6.8 og udskifte alle stik, stik og nåle. Vask de brugte stik, propper og nåle ved at lade dem stå i 20 nm filtreret 70% ethanol i mindst 30 min. Flyt derefter alle dele til et rør, der indeholder 20 nm filtreret deioniseret vand, ryst røret grundigt og overfør dem til en petriskål indeholdende 20 ml 20 nm filtreret deioniseret vand. Lad petriskålen stå på rysteren i mindst 30 minutter ved 100 o / min, og lad derefter tingene tørre i en tør petriskål (i mindst 12 timer), før du genbruger.
8. Test af udstyr med urinprøver
- Klargør enheden som beskrevet i trin 6.1-6.15.
- Opsaml 100 ml morgenurin pr. donor ved hjælp af urinsterile beholdere og aflever den til laboratoriet til behandling inden for 2 timer efter indsamling.
- Hver urinprøve adskilles i to 50 ml glas og centrifugeres ved 2'000 x g i 15 minutter ved RT.
- Supernatanten opsamles og pillen kasseres.
- Supernatanten centrifugeres ved 10.000 x g i 30 minutter ved RT for at fjerne store partikler og cellerester.
- Supernatanten opsamles og pillen kasseres.
- Apparatet vaskes som beskrevet i 6.6.
- Skift 5 ml sprøjterne til en 20 ml sprøjte fyldt med den forberedte urinprøve til prøveindtaget og en anden 20 ml sprøjte fyldt med 20 ml 20 nm filtreret DEPC-PBS til bufferindtaget. Skift sprøjtepumpens indstillinger til BDPlastipak; Sprøjte: cc; Volumen: 20 ml; Flow: 250 μL/min (optimal flowhastighed), ligeledes som beskrevet i trin 6.2. Start sprøjtepumpen, og opsaml gennemstrømningen fra hvert udløb i separate 50 ml rør.
- Hver gennemstrømning koncentreres separat ved hjælp af 100.000 afskårne koncentrationsrør med molekylvægt til 100 μL hver ved 3.000 x g i 4 °C.
- Overfør koncentraterne til 0,5 ml mikrocentrifugeglas.
- Vortex de koncentrerede prøver i 30 sekunder, drej derefter i 10 sekunder.
- Prøverne afhjælpes ved at overføre 25 μL prøve pr. glas, mærkes og fryses ved -80 °C til langtidsopbevaring.
9. Test af enheder med konditionerede medier
- Klargør enheden som beskrevet i trin 6.1-6.15.
- Kulturceller i et 5% CO2 befugtet miljø ved 37 ° C, indtil det samlede antal når 100 millioner ifølge Bajo-Santos et al.20 Passage cellerne til en enkelt T175 suspensionskolbe i 100 ml serumfrie medier suppleret med 2% B-27 serumerstatningstilskud og kultur i et 5% CO2 befugtet miljø ved 37 ° C i yderligere 48 timer.
- Opsaml cellesuspensionen og centrifuger den ved 300 x g i 5 minutter ved RT for at slippe af med celler.
- Supernatanten opsamles og centrifugeres igen ved 3 000 x g i 30 minutter ved +4 °C for at fjerne store partikler og celleaffald.
- Supernatanten opsamles og opbevares ved +4 °C, indtil separationen kan finde sted, dog højst 3 timer.
- De 5 ml sprøjter udskiftes med 20 ml sprøjter fyldt med det klargjorte konditionerede medie til prøveindtaget og fyldes med 20 ml 20 nm filtreret PBS til bufferindtaget.
- Indstil indstillingerne i pumpestationen som beskrevet i trin 7.8.
- Start sprøjtepumpen, og opsaml gennemstrømningen fra hvert udløb i et separat 50 ml rør.
- Hver gennemstrømning koncentreres separat ved hjælp af 100.000 afskårne koncentrationsrør med molekylvægt til 150 μL hver ved 3.000 x g ved +4 °C.
- Overfør koncentraterne til 0,5 ml mikrocentrifugeglas.
- Vortex koncentrerede prøver i 30 s.
- Spin koncentrerede prøver i 10 s.
- Prøverne prøves ved at overføre 25 μL prøve pr. rør, mærke dem og fryse dem ved -80 °C til langtidsopbevaring.
10. Isolering af elbiler ved hjælp af ultracentrifugering
- Der centrifugeres 20 ml urin eller konditionerede cellemedier ved 100.000 x g i 70 minutter ved +4 °C ved hjælp af en centrifuge med en fastvinklet rotor.
- Supernatanten kasseres, og pelletpen resuspenderes i 20 ml 20 nm filtreret PBS.
- Der centrifugeres igen som forklaret i punkt 10.1.
- Supernatanten kasseres, og pelletsen resuspenderes i 12 ml 20 nm filtreret PBS.
- Der centrifugeres ved 100.000 x g i 70 minutter ved +4 °C ved hjælp af en svingrotor.
- Supernatanten kasseres.
BEMÆRK: Vær forsigtig, når supernatanten kasseres denne gang. Det anbefales at gøre det med en pipette. - Pellet resuspenderes i 100 μL 20 nm filtreret PBS.
- Alikvote prøven og fortsæt til setion 12 for EV-karakterisering. Ellers opbevares ved -80 °C indtil yderligere brug.
11. Isolering af elektriske køretøjer ved hjælp af størrelsesekskluderingskromatografi (SEC)
- Koncentrer 20 ml urin eller konditionerede cellemedier til 500 μl ved hjælp af 100 kDa molekylvægt cut-off (MWCO) centrifugalfilterenheder ved 3.000 x g ved +4 °C i 15 minutter.
- Overfør koncentratet til SEC-søjlen (35 nm belastningsområde).
- Hæld den 20 nm filtrerede PBS på søjlen og opsaml 15 fraktioner af 0,5 ml.
- Analysér fraktioner med et dynamisk lysspredningssystem (DLS) ved at følge producentens anvisninger.
- Saml de valgte brøker. Vælg fraktioner med en dæmper lavere end 11 og mindst 30% af de samlede partikler større end 40 nm.
- Koncentrer udvalgte fraktioner til 100 μL ved hjælp af 3 kDa molekylvægt cut-off (MWCO) centrifugalfilterenheder ved 14.000 x g ved +4 °C i 15 min.
- Alikvote prøven og fortsæt til afsnit 12 for EV-karakterisering. Ellers opbevares ved -80 °C indtil yderligere brug.
12. EV-karakterisering
- Den prøve, der skal karakteriseres, tages ud af fryseren, og optøer den langsomt (på en isblok eller ved +4 °C).
- Udfør nanopartikelsporingsanalyse (NTA) for at bestemme partikelstørrelsesfordeling og mængde13. Udfør T-cellemembranprotein 4 (TIM-4) dobbelt sandwichenzymbundet immunosorbentassay (dsELISA)14 med høj affinitet for at bekræfte EV-tilstedeværelse i prøverne.
13. NTA
- Den optøede EV-prøve hvirvles i 30 sek., og der drejes i 10 sek., hvorefter 1 μL til 999 μL 20 nm filtreret PBS overføres i et 2 ml mikrocentrifugerør for at fortynde det 1000 gange. Spar 1 ml ekstra PBS, der bruges til fortynding, for at kontrollere, at den ikke indeholder partikler. Opbevar alt ved +4 °C indtil måling.
BEMÆRK: Filtrer PBS gennem et 0,02 nm filter før brug. - Vortex EV-prøven eller blindprøven i 30 sekunder, og indsæt den i modulet ved hjælp af en sprøjte. Fyld modulet med ca. 0,7 ml prøve, og placer det i instrumentet.
- Prøven måles ved hjælp af nanopartikelanalysatorinstrumentet efter producentens anvisninger.
14. dsELISA til EV-markører
- Forbered en opløsning af 1 μg/ml TIM4-Fc protein. Overtræk hullerne i en ELISA-plade med 96 huller ved at overføre 100 μL opløsning til hvert nødvendigt hul og inkuberes natten over ved +4 °C under omrystning ved 200 omdr./min.
- Den følgende dag skal du forberede vaskeopløsning (1x TBS + 0,05% Tween20 + 2 mM CaCl2).
- Kassér al væsken i hver brønd. Hvert hul vaskes ved at tilsætte 200 μL vaskeopløsning, omrystes ved 200 omdr./min. i 5 minutter ved RT og kasseres. Gentag dette trin to gange.
- Forbered blokeringsopløsning (1x TBS + 0,05% Tween20 + 1% bovint serumalbumin. Der tilsættes 200 μL blokerende opløsning til hvert hul og inkuberes ved RT i 1 time, mens der rystes ved 200 omdr./min.
- Vask hvert hul som beskrevet i trin 14.3.
- Der fremstilles 220 μL af hver prøvefortynding i vaskebuffer (optimal EV-koncentration er 2,7 × 105 EV/μL). Der tilsættes 100 μL af den fortyndede prøve pr. hul, og der udføres to replikater. Inkuber ved RT i 90 minutter, mens du ryster ved 200 RPM.
- Vask hvert hul som beskrevet i trin 14.3.
- Der tilsættes 100 μL tilsvarende antistoffer til hvert hul. Brug korrekte EV-markører til bekræftelse af elbiler og forurenende stoffer4. Der inkuberes ved RT i 2 timer, mens der rystes ved 200 omdr./min. BEMÆRK: Hvis der anvendes sekundære antistoffer, gentages trin 14.7-14.8. Imidlertid reduceres inkubationsperioden for sekundære antistoffer til 1 time.
- Vask hvert hul som beskrevet i trin 14.3.
- Tilsæt 100 μL peberrodsperoxidasesubstrat til hvert hul, bland pladen i 1 min og inkuber ved RT i 30 min.
- Der tilsættes 1 MH2SO4 til hvert hul for at standse reaktionen.
- Ved hjælp af en mikropladelæser måles absorbansen ved 450 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi fremstillede en mikrofluidisk enhed ved hjælp af en 3D-printet dobbelt negativ form (figur 1) via blød litografi (figur 2A) til EV-separation med høj kapacitet baseret på det forgrenede A4F-princip (figur 2B, C). Opsætningen kræver en pumpe og en gennemstrømningsstation, som det kan ses i figur 3, til automatiseret isolering af elbiler. For det første blev der for at evaluere proof of concept for enhederne forberedt en blanding af polystyrenperler med diametre på 100 nm og 1000 nm til at repræsentere vesikler og fincelleaffald, henholdsvis10. Eksperimenter blev udført med varierende strømningshastigheder for perleblandingen, både med og uden bifurcating flow, for at undersøge effekten af lineær hastighed på separationseffektivitet. På tværs af alle eksperimenter forblev genvindingen af små perler konsistent og over 90%10, hvilket viser enhedens potentiale til at genvinde elbiler.
Derefter vurderede og sammenlignede vi COC-OSTE-enhedens potentiale til at isolere elbiler fra store mængder (>1 ml) fra komplekse biofluider med minimal forbehandling. Som sådan blev urin fra 10 raske donorer (figur 4) og cellemedier fra to forskellige prostatacellelinjer (figur 5) brugt som skabelon til samtidig isolering af elbiler efter tre forskellige procedurer: ultracentrifugering (UC), størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) og den A4F-mikrofluidikbaserede OSTE-COC-enhed. Efter isolering blev det samlede antal partikler og deres størrelsesfordeling vurderet ved hjælp af nanopartikelsporingsanalyse (NTA). I gennemsnit viste OSTE-COC-enheden bedre total partikelgenvinding fra biofluider sammenlignet med UC, men den statistiske signifikans blev kun opnået ved at kombinere partikelnumrene fra begge porte (figur 4A). For at sammenligne enhedens ydeevne med andre systemer skal R & L-stikkontakten sammen tages i betragtning. Som vist i figur 4 overgår L &; R-udløb sammen ydeevnen ved gendannelse af elbiler UC og SEC. Separat blev L-porten designet til at fange den lille EV-fraktion, mens R-porten var designet til at indsamle den større EV-fraktion med andre molekyler af samme størrelse. Interessant nok var gendannelsen ved hjælp af R-PORT af OSTE-COC-enheden lidt højere end SEC og UC alene (figur 4A). CD63-ekspression viste et lignende mønster (figur 4C). Dette fund indikerer, at OSTE-COC-enheden var mere effektiv til total EV-gendannelse. Ækvivalent størrelsesfordeling blev fundet mellem de forskellige metoder, bortset fra UC, som viser en større partikelstørrelsesfordeling (figur 4B).
Sammenlignelige resultater blev observeret i cellemediekulturer. I begge scenarier udviste den samlede partikelgenvinding fra begge enhedsporte overlegen ydeevne sammenlignet med SEC- eller UC-metoder (som vist i figur 5A, B). Især EV'er afledt af PC3-celler viste en tydelig størrelsesfordeling med større homogenitet i L-PORT-fordelingen i modsætning til andre eksperimentelle grupper (figur 5C, D). Desuden bekræftede analysen af CD63-ekspression de højere EV-genvindingsrater, der blev opnået ved hjælp af COC-OSTE-enheden (som illustreret i figur 5E, F). Tabel 1 indeholder et resumé, der sammenligner isolationskarakteristikaene for de forskellige metoder, der blev undersøgt i denne undersøgelse.
Figur 1: 3DP serpentinformede dobbelte negative formdimensioner og isometrisk visning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: COC-OSTE mikrofluidisk enhed. (A) Skema over de forskellige hovedtrin i fremstillingen af OSTE-COC-enheden. (B) Princippet om enhedens funktion. (C) Billede af det færdige udstyr. Vægtstang: 15 mm. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Priedols et al.10 og Bajo-Santos et al.20. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Eksperimentel konfiguration af enheden. Sprøjtepumpen er til venstre, OSTE-COC-enheden er i midten, og genvindingsstationen er til højre. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Priedols et al.10 og Bajo-Santos et al.20. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Fordeling af EV-størrelse i urinen og partikelgenvinding fra 10 donorer ved hjælp af ultracentrifugering (UC), størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) og COC-OSTE-enheden. A) Partikelmængde genvundet fra hver isolationsmetode ved nanopartikelsporingsanalyse (NTA). Data repræsenteret som middelværdi +/- standardafvigelse. Statistisk signifikans betegnet med * (s<0.05). (B) Boxplots viser den gennemsnitlige partikelstørrelsesfordeling blandt alle urinprøver, der er vurderet af NTA, med knurhår, der angiver minimums- og maksimumsværdierne. P-værdier blev afledt af sammenligninger med UC, hvor **** indikerede høj statistisk signifikans (p<0,0001). (C) Medianen og intervallet for den gennemsnitlige CD63-mængde, vurderet ved hjælp af dobbeltsandwichenzymbundet immunosorbentassay (dsELISA), for hver isolationsmetode blev beregnet på tværs af alle prøver. L-port: Venstre port; R-port: Højre port. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Bajo-Santos et al.20. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Karakterisering af elbiler isoleret fra PC3- og LNCaP-celler ved hjælp af forskellige metoder. (A) Partikelmængde genvundet fra PC3-medier ved hjælp af nanopartikelsporingsanalyse (NTA) repræsenteret ved middel+/- standardafvigelse. B) Partikelmængde genvundet fra LNCaP-cellemedier ved NTA repræsenteret som middelværdi +/- standardafvigelse. (C) Median partikelstørrelsesfordeling af EV'er fra PC3-kulturer sammen med rækkevidden blev bestemt af NTA. D) Medianstørrelsesfordeling af elektriske køretøjer isoleret fra LNCaP-kulturer med rækkevidde. E) Median og CD63-ekspression for hver isolationsmetode for PC3-cellelinjeafledt EV under anvendelse af dobbeltsandwichenzymbundet immunosorbentassay (dsELISA). F) Median og interval af LNCaP-afledt EV CD63-ekspression ved dsELISA for hver isolationsmetode. UC: Ultracentrifugering; SEC: Størrelseseksklusionskromatografi; L-port: Venstre port; R-port: Højre port. Dette tal er blevet ændret med tilladelse fra Bajo-Santos et al.20. Klik her for at se en større version af denne figur.
| UC | SEK | COC-OSTE | |
| Behandlingstid/prøve | ++/+++ | +++ | + |
| Dataoverførselshastighed | ++ | + | +++ |
| Omkostninger/stikprøve | + | +++ | ++ |
| Renhed | + | +++ | ++ |
| Automatisering | ++ | + | +++ |
| EV-udbytte | ++ | ++ | +++ |
| Valg af størrelse | + | ++ | ++ |
Tabel 1. Sammenligning af isolationsegenskaber for elbiler med de tre metoder UC, SEC og COC-OSTE-enheden. UC: Ultracentrifugering; SEC: Størrelse-ekskluderingskromatografi. COC-OSTE: cyklisk olefincopolymer-off-støkiometri thiol-en. +: lav; ++: medium; +++: høj. * Afhængig af enheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den præsenterede mikrofluidiske enhed tilbyder en lovende metode til isolering og ekstraktion af elbiler fra biologiske væsker, der adresserer nogle af de kritiske begrænsninger ved eksisterende guldstandardmetoder som UC og SEC12. UC og SEC er kendt for at være arbejdskrævende, tidskrævende og lider af lavt udbytte, hvilket gør dem mindre egnede til applikationer med høj kapacitet, hvor der er behov for store mængder elbiler21,22. I modsætning hertil kan den beskrevne mikrofluidiske enhed kontinuerligt behandle et betydeligt volumen på op til 20 ml biologisk væske med minimal brugerinput, hvilket gør det til en potentiel game-changer for industrielle eller kliniske omgivelser. En af de vigtigste fordele ved denne mikrofluidiske enhed er dens evne til at standardisere EV-isolering og forbedre reproducerbarheden sammenlignet med traditionelle metoder, der involverer manuelle trin. Ved at reducere variabiliteten af fremstilling af EV-isoleringsenheder gennem massefremstilling kan enhedens ydeevne kontrolleres bedre og ensartet, hvilket er afgørende for applikationer som EV-baseret terapi og diagnostik. Desuden forbedrer enhedens kompatibilitet med fremstilling i store mængder via reaktionssprøjtestøbning af egnede substrater yderligere dets potentiale for skalerbarhed og bredere vedtagelse.
For at sikre reproducerbarhed og ensartet ydeevne er en omfattende og veldefineret protokol nødvendig, både for at producere chippen og til dens anvendelse i forsøg. Chippen er designet med industrialisering i tankerne. Under fremstillingen af enheden i laboratoriemiljøet skal man imidlertid være opmærksom på at undgå dannelse af bobler, sikre præcis og robust binding og gennemføre grundig test ved højere strømningshastigheder end dem, der forventes i virkelige eksperimenter. Denne forholdsregel er især vigtig for COC-OSTE-enheder, da de kan være tilbøjelige til at lække på grund af mislykket limning, især ved højere strømningshastigheder. Derudover, da OSTE er et lysfølsomt materiale, skal enhedens fremstilling udføres i gult lys for at undgå unødvendig eksponering for UV. Da denne teknologi stadig er i sine indledende faser, bør forskere eksperimentere med forskellige strømningshastigheder for at identificere den optimale indstilling til deres specifikke anvendelse, da standardiserede protokoller for denne nye metode endnu ikke er etableret, og flydende viskositet klart kan påvirke EV-isolationseffektiviteten baseret på vores resultater. Ved at følge disse retningslinjer og tackle udfordringerne ved standardisering kan potentialet i denne mikrofluidiske enhed til EV-isolering realiseres fuldt ud på tværs af forskellige forskningsområder og applikationer.
Metoden til EV-isolering ved hjælp af den mikrofluidiske enhed giver mulighed for omfattende modifikation og fejlfinding for at optimere ydeevnen. For at forbedre partikelseparationen kan forskere udforske længere kanaler, forskellige membranporøsiteter og poretætheder og ændrede dimensioner. Hvis der er mange store partikler i det lille partikeludløb, kan det være en fordel at teste en højere bufferindløbshastighed, mens hvis der er mange små partikler i det store partikeludløb, anbefales det at eksperimentere med en længere kanal eller en membran med større porer. Adressering af partikelabsorption kan involvere justering af strømningshastigheder, overfladeændringer og OSTE-sammensætning eller ændring af UV-eksponeringstiden. For enheder, der oplever ustabilitet og lækage, er faldende flowhastigheder og sikring af korrekt limning afgørende trin. For at minimere EV-skader kan forskere reducere strømningshastigheder, vaske med PBS mere grundigt efter enhedssterilisering og overveje at bruge mindre membranporer eller alternative formdesignteknikker og materialer. Gennem disse justeringer kan den mikrofluidiske enhed finjusteres, hvilket frigør dens potentiale for forskellige anvendelser inden for EV-forskning og relaterede områder. For at optimere enhedens ydeevne kan opstrøms prøvekarakterisering, herunder densitets- og viskositetsmålinger, inkorporeres for at justere flowparametre. Desuden skal der lægges særlig vægt på prøvens art i betragtning af den påviste ikke-sterilitet af flydende biofluider23. Derfor bør sterilisering af prøver inden indgivelse i kliniske anvendelser overvejes behørigt.
På trods af disse udfordringer har den mikrofluidiske enhed et enormt potentiale inden for forskellige forskningsområder. Dens evne til kontinuerligt at isolere elbiler fra store mængder meget heterogene prøver åbner døren for automatisering, letter applikationer med høj kapacitet og muliggør mere dybdegående analyse af elbiler fra forskellige kilder. Integration af dette mikrofluidiske modul i forskellige enheder, såsom hule fibercellebioreaktorpatroner eller flowcytometre med høj opløsning, kan gøre EV-applikationer mere industrivenlige og drive innovation inden for områder som lægemiddellevering, diagnostik og kosmetik4. Samlet set repræsenterer denne mikrofluidiske enhed et vigtigt skridt fremad inden for EV-forskning, der tilbyder en effektiv og standardiseret metode til EV-isolering med lovende applikationer inden for en bred vifte af forskning og industrielle omgivelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AA, GM og R.R. er grundlæggere, bestyrelsesmedlemmer og aktionærer i Cellbox Labs, LLC
Acknowledgments
Vi takker alle donorer, der deltog i denne undersøgelse, personalet i den lettiske genomdatabase for at levere prøverne. Institute of Solid-State Physics, Letlands Universitet har som Center of Excellence modtaget finansiering fra EU's Horizon 2020-rammeprogram H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 under tilskudsaftale nr. 739508, projekt CAMART2. Dette arbejde blev støttet af Det Lettiske Råd for Videnskabsprojekt nr. lzp-2019/1-0142 og projekt nr.: lzp-2022/1-0373.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 µm carboxylate FluoSpheres | Invitrogen | #F8803 | Stock concentration: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT dependent) |
| 0.5 mL microcentrifuge tubes | Starstedt | 72.704 | |
| 1 mL Luer cone syringe single use without needle | RAYS | TUB1ML | |
| 1.0 µm polystyrene FluoSpheres | Invitrogen | #F13083 | Stock concentration: 1 x 1010 beads/mL (LOT dependent) |
| 10 mL Serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| 15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filters | Merck Millipore | UFC910024 | |
| 2.0 mL Protein LoBind tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| 20 mL syringes | BD PlastikPak | 10569215 | |
| 250 µm ID polyether ether ketone tubing | Darwin Microfluidics | CIL-1581 | |
| 3 kDa MWCO centrifugal filter units | Merck Millipore, | UFC200324 | |
| 5 mL Medical Syringe without Needle | Anhui Hongyu Wuzhou Medical | 159646 | |
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 70 Ti fixed angle ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| 800 µm ID polytetrafluoroethylene tubing | Darwin Microfluidics | LVF-KTU-15 | |
| 96 well microplate, f-bottom, med. binding | Greiner Bio-One | 655001 | ELISA plate |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine serum albumin | SigmaAldrich | A7906-100G | |
| COC Topas microscopy slide platform | Microfluidic Chipshop | 10000002 | |
| COC Topas microscopy slide platform 2 x 16 Mini Luer | Microfluidic Chipshop | 10000387 | |
| Elveflow OB1 pressure controller | Elvesys Group | ||
| Luer connectors | Darwin Microfluidics | CS-10000095 | |
| Mask aligner Suss MA/BA6 | SUSS MicroTec Group | ||
| Mixer Thinky ARE-250 | Thinky Corporation | ||
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | nanoparticle analyzer |
| Optical microscope Nikon Eclipse LV150N | Nikon Metrology NV | ||
| OSTE 322 Crystal Clear | Mercene Labs | ||
| PBS TABLETS.Ca/Mg free. Fisher Bioreagents. 100 g | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| PC membrane (50 nm pore diameter, 11.8% density) | it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium | ||
| Petri dishes, sterile | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| Plasma Asher GIGAbatch 360 M | PVA TePla America, LLC | ||
| qEVoriginal/35 nm column | Izon | SP5 | SEC column |
| QSIL 216 Silicone Elastomer Kit | PP&S | ||
| Resin Tough Black | Zortrax | ||
| SW40 Ti swing ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 331301 | |
| Syringe pump | DK Infusetek | ISPLab002 | |
| T175 suspension flask | Sarstedt | 83.3912.502 | |
| TIM4-Fc protein | Adipogen LifeSciences | AG-40B-0180B-3010 | |
| TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) | SigmaAldrich | T0440-100ML | Horseradish peroxidase substrate |
| Tween20 | SigmaAldrich | P1379-100ML | |
| Ultracentrifuge Optima L100XP | Beckman Coulter | ||
| Ultrasonic cleaning unit P 60 H | Elma Schmidbauer GmbH | ||
| Universal Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek instruments | 71777-1 | |
| Urine collection cup, 150mL, sterile | APTACA | 2120_SG | |
| Whatman Anotop 25 Syringe Filter | SigmaAldrich | 68092002 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | dynamic light scattering (DLS) system | |
| Zortrax Inkspire | Zortrax |
References
- Colombo, M., et al. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Tricarico, C., et al. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Wang, Z. Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances. Biomed Pharmacother. 153, 113480 (2022).
- Royo, F., et al. Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee. Cells. 9 (9), 1955 (2020).
- Sidhom, K., et al. A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option. Int J Mol Sci. 21 (18), 6466 (2020).
- Reshi, Q. U. A., et al. Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns. Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).
- Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. J Chromatogr A. 1636, 461773 (2021).
- Priedols, M., et al. Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation. Polymers. 15 (4), 789 (2023).
- Zhang, H., Lyden, D. Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization. Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).
- Talebjedi, B., et al. Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment. Front Vet Sci. 7, 620809 (2020).
- van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).
- Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
- Bussooa, A., et al. Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices. Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198 (2022).
- Tang, L., Lee, N. Y. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).
- Borda, E., et al. Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets. Biomaterials. 293, 121979 (2023).
- Sandström, N., et al. Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002 (2015).
- Sticker, D., et al. Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).
- Bajo-Santos, C., et al. Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device. Int J Mol Sci. 24 (9), 7971 (2023).
- Claridge, B., et al. Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities. Front Cell Dev Biol. 9, 734720 (2021).
- Rezaie, J., et al. Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges. Cell Commun Signal. 20 (1), 145 (2022).
- Aragón, I. M., et al. The urinary tract microbiome in health and disease. Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).
