Summary
Extracellulära vesiklar är mycket lovande för biomedicinska tillämpningar, men nuvarande isoleringsmetoder är tidskrävande och opraktiska för klinisk användning. I denna studie presenterar vi en mikrofluidisk anordning som möjliggör direkt isolering av extracellulära vesiklar från stora volymer biovätskor på ett kontinuerligt sätt med minimala steg.
Abstract
Extracellulära vesiklar (EV) har en enorm potential för olika biomedicinska tillämpningar, inklusive diagnostik, läkemedelstillförsel och regenerativ medicin. De nuvarande metoderna för att isolera elfordon innebär dock betydande utmaningar, t.ex. komplexitet, tidsåtgång och behov av skrymmande utrustning, vilket hindrar deras kliniska översättning. För att ta itu med dessa begränsningar syftade vi till att utveckla ett innovativt mikrofluidiksystem baserat på cyklisk olefinsampolymer-off-stökiometri-tiol-en (COC-OSTE) för effektiv isolering av EV från prover med stora volymer på ett kontinuerligt sätt. Genom att använda storleks- och flytkraftsbaserad separation uppnådde tekniken som användes i denna studie en betydligt smalare storleksfördelning jämfört med befintliga metoder från urin- och cellmediaprover, vilket gör det möjligt att rikta in sig på specifika EV-storleksfraktioner i framtida applikationer. Vår innovativa COC-OSTE-mikrofluidikenhetsdesign, som använder förgrenad asymmetrisk flödesfältflödesfraktioneringsteknik, erbjuder en enkel och kontinuerlig EV-isoleringsmetod för prover med stora volymer. Dessutom erbjuder potentialen för masstillverkning av denna mikrofluidikenhet skalbarhet och konsistens, vilket gör det möjligt att integrera EV-isolering i rutinmässig klinisk diagnostik och industriella processer, där hög konsistens och genomströmning är viktiga krav.
Introduction
Extracellulära vesiklar (EV) är cellhärledda membranbundna partiklar som består av två huvudtyper: exosomer (30-200 nm) och mikrovesiklar (200-1000 nm)1. Exosomer bildas genom inåtriktad knoppning av det endosomala membranet i en multivesikulär kropp (MVB), vilket frigör intraluminala vesiklar (ILV) i det extracellulära utrymmet vid fusion med plasmamembranet1. Däremot genereras mikrovesiklar genom utåtriktad knoppning och klyvning av cellmembranet2. EV spelar en avgörande roll i intercellulär kommunikation genom att transportera proteiner, nukleinsyror, lipider och metaboliter, vilket återspeglar cellens fysiologiska tillstånd, inklusive tillväxt, angiogenes, metastaser, proliferation och terapiresistens3. Som ett resultat har de dykt upp som lovande biomarkörer och terapeutiska mål för sjukdomar, inklusive cancer, vilket belyser deras potential inom diagnostik och läkemedelsleveranssystem4.
För att fullt ut kunna utnyttja elfordon i sjukdomsdiagnostik och terapi är effektiv isolering från olika biovätskor avgörande5. Vanliga metoder inkluderar ultracentrifugering (UC), densitetsgradientcentrifugering, storleksuteslutningskromatografi (SEC), filtrering och immunisolering6. UC är en allmänt använd teknik men kan ge partiklar med liknande densitet som inte är EV och kan generera EV-aggregat7. SEC har vunnit popularitet på grund av dess förmåga att ge prover med högre renhet genom att utesluta partiklar baserat på storlek snarare än densitet8. Noggrant val av lämplig porstorlek för SEC-kolonnen och optimering av kromatografiförhållanden är dock avgörande för att minimera samisolering av oönskade partiklar som kylomikroner och lipoproteiner med låg densitet8. Trots sin effektivitet är båda metoderna tidskrävande och utmanande att automatisera, särskilt för prover med större volymer som cellmedia eller urin, vilket begränsar deras skalbarhet för industriella tillämpningar9.
Under de senaste åren har asymmetrisk fältflödesfältfraktionering (A4F) utvecklats som en kraftfull separationsteknik för storleks- och flytkraftsbaserad partikelseparation i mikro- och nanometerstorlek10. Funktionsprincipen för A4F bygger på en mikrofluidisk kanal utrustad med ett poröst membran vid basen, vilket genererar en kraft som utövas mot membranet som kallas cross-flow10. I kombination med Brownsk rörelse och Poiseuille-flöde som är inneboende i systemet, underlättar korsflöde effektiv partikelseparation på grund av varierande partikelposition inom flödesdynamiken11. Trots fördelarna är denna metod begränsad till provvolymer inom mikroliterområdet12 och kräver ytterligare ett fokuseringssteg, vilket förlänger processens varaktighet10.
Under det senaste decenniet har mikrofluidik fått en framträdande plats som ett verktyg för snabb, effektiv och kliniskt tillförlitlig EV-separation13. De flesta mikrofluidiska metoder som är utformade för EV-separation är dock optimerade för EV-prover med liten volym och hög koncentration eller är beroende av komplexa separationsprocedurer14. Dessutom, inom mikrofluidikområdet, är polydimetylsiloxan (PDMS) erkänt som det gyllene standardmaterialet på grund av dess optiska transparens, biokompatibilitet och användarvänlighet15. Icke desto mindre kan dess kända benägenhet att absorbera små lipofila molekyler, inklusive EV, vara problematisk för dess tillämpning inom EV-området13.
Cyklisk olefinsampolymer (COC) är ett ofta använt material inom mikrofluidik på grund av biokompatibilitet, liten absorption av molekyler och hög kemisk beständighet15. Tillverkningen av COC-enheter involverar dock ofta komplexa processer eller specialutrustning16. Alternativt är off-stökiometri tiol-en (OSTE) ett lovande alternativ till PDMS på grund av minskad absorption av små molekyler, överlägsen kemisk stabilitet, enkel tillverkning och skalbar tillverkningsprocess17,18. Men på grund av komplexa anslutningar till slangar kan enheter vara benägna att läcka19.
Syftet med denna studie var att konstruera och tillverka en mikrofluidisk enhet som kombinerar OSTE och COC och förgrenad A4F-princip för EV-separation från stora volymprover som urin eller cellmedia.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Provsamlingen godkändes av Lettlands etiska kommitté för livs- och medicinvetenskaplig forskning vid Lettlands universitet (beslut N0-71-35/54)
OBS: Materialen som används i denna studie ingår i materialtabellfilen .
1. Tredimensionell (3D) tryckt formtillverkning
- Designa en serpentinformad dubbelnegativ form i CAD-programvara med följande mått för den övre kanalen: höjd på 0,5 mm, bredd på 1 mm och längd på 210 mm. För den nedre kanalen, använd samma design med en bredd på 1.5 mm, höjd på 0.6 mm och längd på 210 mm. Dimensioner som formbredd, längd, höjd och isometrisk illustration visas i figur 1. Spara designen som .stl-fil.
- Förbered filen i Z-Suite; Inget stöd behöver läggas till. Skriv ut formarna med en ultraviolett 3D-skrivare med flytande kristaller (UV LCD) och tåligt svart harts.
- Efter utskrift, ta försiktigt bort formarna från skrivarens yta. Tvätta formarna i isopropanol (IPA) i ultraljudsbehandling i 20 min.
- Föna formarna med N2.
- Utsätt formarna för översvämningsexponering med ett ND33-filter i 810 s och placera dem sedan i en ugn vid 60 °C i 48 timmar.
2. Beredning av PDMS-formarna
- Vikt PDMS vid förhållandet 10:1 vikt/vikt (för varje form, använd 16 g elastomerbas och 1,6 g tvärbindningsmedel). Blanda komponenterna i en planetarisk centrifugalblandare, blanda i 1 min vid 500 varv per minut.
- Gjut den blandade PDMS:en i de 3D-printade formarna och avgasa i en vakuumexsickator vid -800 mbar i 30 minuter eller tills inga bubblor observeras.
- Placera försiktigt en 100 μm tjock polyvinylkloridliner ovanpå den flytande PDMS:en.
OBS: Applicera fodret långsamt från ena sidan till den andra för att undvika bubbelbildning. - Sätt in formen med PDMS i en Mold-in-Place jigg och dra åt jiggen med hjälp av en momentnyckel inställd på 0.3 Nm.
- Placera jiggen i en 60 °C ugn i 3 timmar för att härda PDMS.
- Demontera jiggen med en insexnyckel och ta bort den 3D-printade formen från jiggen.
- Avforma försiktigt PDMS-formarna från de 3D-printade masterformarna, kör runt formens kanter med en skalpell och ta sedan bort formen med en pincett.
OBS: För enklare borttagning av mögel kan IPA användas; formarna måste dock värmas upp till 60 °C i 10 minuter efteråt för att avdunsta överskott av IPA.
3. Förberedelse av OSTE-COC toppkanal
- Vikt OSTE vid förhållandet 1,09:1 vikt/vikt (för 5 enheter behövs 1,56 g A-del och 1,44 g B-del). Blanda komponenterna i en planetarisk centrifugalblandare: blanda i 5 minuter vid 750 varv per minut och avgasa sedan i 5 minuter vid 750 varv per minut.
- Överför den blandade OSTE till ett centrifugrör och avgasa vid -800 mbar i en vakuumexsickator i 30 minuter.
- Rengör COC-bilder med 2 x 16 mini Luer-kontakter genom ultraljudsbehandling i IPA i 10 min. Torka objektglasen försiktigt med N2.
- Placera de rena COC-objektglasen i plasmaskäret så att den plana ytan placeras uppåt och behandla ytan med 800 SCCM syreplasma i 2 minuter vid 700 W effekt med 0.133 mbar tryck.
- Placera den oxiderade COC-bilden på PDMS-formen för den övre kanalen så att den behandlade ytan är i kontakt med den strukturerade ytan på PDMS. Placera enheten i en Mold-in-Place-jigg och dra åt jiggen med en momentnyckel inställd på 0.3 Nm.
- Anslut trycksystemet till tryckluftsledningen vid 6 bar. Ta centrifugröret med avgasad OSTE och montera det enligt trycksystemets instruktioner med polytetrafluoreten (PTFE) slang med 0.8 mm innerdiameter (ID).
- Anslut PTFE-slangen till inloppet till PDMS-formen och fyll enheten med 1000 mbar tryck som upprätthålls av en piezoelektrisk pump placerad i trycksystemet. Placera jiggen med glassidan uppåt i maskskenan och exponera med 850 mJ dos med ND33-filter.
- Efter exponering, demontera jiggen med en insexnyckel och ta försiktigt bort COC-sliden med det strukturerade OSTE-skiktet från PDMS-formen.
- För den strukturerade OSTE i kontakt med ett 25 mm x 75 mm membran med 50 nm porer och 11,8 % portäthet så att kanalerna är helt täckta med membranet.
OBS: Det är särskilt viktigt att hålla membranet så rakt som möjligt under appliceringsprocessen. - Placera enheten på en värmeplatta inställd på 60°C med membransidan uppåt, placera en ren glasskiva ovanpå membranet och applicera ett tryck på 1.6 kPa uppifrån för att säkerställa jämn bindning. Värm enheten över natten.
OBS: Efter detta steg är det särskilt viktigt att utvärdera bindningsprestanda och kanaldeformation.
4. Förberedelse av OSTE-COC-bottenkanal och enhetsenhet
- Blanda OSTE i förhållandet 1,09:1 vikt/vikt (för 5 enheter behövs 1,56 g A-del och 1,44 g B-del). Blanda komponenterna i en planetarisk centrifugalblandare: blanda i 5 minuter vid 750 varv per minut och avgasa sedan i 5 minuter vid 750 varv per minut.
- Överför den blandade OSTE till ett falkrör och avgasa vid -800 mbar i en vakuumexsickator i 30 minuter.
- Rengör COC-bilder genom ultraljudsbehandling i IPA i 10 minuter. Torka objektglasen försiktigt med N2.
- Placera de rena COC-objektglasen i plasmaasher och behandla ytan med 800 SCCM syreplasma i 2 minuter vid 700 W effekt med 0.133 mbar tryck.
- Placera den oxiderade COC-bilden på PDMS-formen för bottenkanalen så att den behandlade ytan är i kontakt med den strukturerade ytan på PDMS. Placera enheten i en Mold-in-Place-jigg och dra åt jiggen med en momentnyckel inställd på 0.3 Nm.
- Ta falkröret med avgasad OSTE och montera det enligt trycksystemets instruktioner med PTFE-slang med 0.8 mm ID.
- Anslut PTFE-röret till inloppet på PDMS-formen och fyll enheten med 1000 mbar tryck. Placera jiggen med glassidan uppåt i maskskenan och exponera med 1100 mJ dos med ND33-filter.
- Efter exponering, demontera jiggen med en insexnyckel och ta försiktigt bort COC-sliden med det strukturerade OSTE-skiktet från PDMS-formen.
- Kombinera det strukturerade OSTE-skiktet med den övre kanalenheten så att utformningen av det övre och nedre lagret är i linje med varandra och att OSTE-bottenskiktet är i kontakt med membranet.
- Sätt in designen i en Mold-in-Place-jigg och applicera ett jämnt tryck på 1.6 kPa med hjälp av bulldog-klämmor. Placera jiggen i en 60°C ugn över natten.
OBS: Ojämn placering av klämmorna kan leda till ojämn bindning.
5. Utvärdering av enheten
- Efter limning, utvärdera enheterna visuellt med ett mikroskop för visuella defekter, till exempel deformation av kanalen eller misslyckad bindning.
- Testa enheterna utan defekter genom att leda 0,02 μm filtrerat avjoniserat vatten genom kanalerna med 30 mbar tryck. Observera om det finns läckage i flödeskanalen och Luer-porten och vattenflödet.
OBS: Om inget läckage kan detekteras och kanalflödet är oavbrutet, anses enheterna vara användbara för ytterligare experiment.
6. Inställning av enhet
- Fyll två 5 ml sprutor med 2 ml 20 nm filtrerad 3% H2O2 och montera dem på en sprutpump (använd rörelsepilarna för önskat avstånd, sätt i sprutorna och fixera dem på plats med den övre stången).
FÖRSIKTIGHET! Var alltid försiktig när du hanterar H2O2. Bär labbrock, skyddande gummihandskar och ögonskydd. - Anslut en 14 cm lång PTFE-slang med 800 μm ID till sprutorna med hjälp av sprutnålarna och till enhetens inlopp med hjälp av Luer-kopplingar.
- Anslut 20 cm lång 200 μm ID polyetereterketonslang (PEEK) till utloppen.
- Anslut den andra änden av PEEK-slangen till en avfallsbehållare. Inställningen kan ses i figur 3.
- Starta sprutpumpen med en flödeshastighet på 500 μL/min för varje inlopp (på instrumentskärmen: Inställningar > System Set > Spruta (tillverkare: medicinsk spruta, spruta: 5 ml) > Tillbaka-knapp > Parametrar (Välj: infusera, Upprepa: 1, Volym: 1.5 ml, Flöde: 500 μL/min) > Tillbaka-knapp > Tillbaka-knapp ). Samla upp genomströmningen i en avfallsbehållare.
- Fyll två nya 5 ml sprutor med 2 ml 20 nm filtrerad 70 % etanol.
- Byt ut de tidigare sprutorna mot de etanolfyllda sprutorna och starta sprutpumpen med samma parametrar som beskrivs i steg 6.5.
- Använd nya 5 ml sprutor och fyll dem med 5 ml 20 nm filtrerad fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS).
- Byt ut de tidigare sprutorna mot de PBS-fyllda sprutorna och spola enheten med 4 ml PBS genom att upprepa steg 6.1. och 6.5.
OBS: Se till att ändra systeminställningsparametrarna till Volym: 4 ml (på instrumentskärmen: Inställningar > Parametrar > (Välj: Volym: 4 ml). - Koppla bort slangen från enheten och stäng varje inlopp och utlopp med Luer-pluggar.
OBS: Lämna PBS i enheten och undvik att fånga luft genom att lägga till ytterligare PBS på varje inlopp och utlopp med hjälp av en mikropipett innan du stänger. - Lämna enheten över natten på en mörk plats i rumstemperatur (RT).
- Följande dag, spola den PBS-fyllda enheten med 4 ml 20 nm filtrerad PBS (enligt beskrivningen i steg 6.8).
- Samla upp de sista 1 ml av genomströmningen från båda utloppen i ett 2 ml proteinrör med låg bindningsgrad och förvara vid 4 °C som ett blindprov för partiklar som förs in av enheten.
- Ta bort de PBS-fyllda sprutorna och byt ut dem mot nya 5 ml sprutor fyllda med luft.
- Töm enheten med 4 ml luft tills all vätska har lämnat enheten och slangen.
7. Enhetstestning med standardiserade latexpärlor
- Bered ett standardiserat pärlprov med 1,0 μm polystyren och 0,1 μm karboxylatpärlor. Tillsätt 500 μL 1,0 μm polystyrenpärla till ett 15 ml rör, 1 μL 0,1 μm karboxylatpärla och 9499 μL 20 nm filtrerad PBS (slutlig koncentration av 1,0 och 0,1 μm pärlblandning blir 5 × 108 pärlor/ml och 3,6 × 1010 pärlor/ml respektive).
- Snurra pärlprovet i 30 s och förvara det vid +4 °C när det inte används.
- Fyll en ny 5 ml spruta med 1,5 ml av den standardiserade pärlblandningen och en annan med 1,5 ml 20 nm filtrerad PBS.
- Ta bort de tidigare påsatta sprutorna och fäst pärlblandningssprutan på den första inloppsslangen och den andra på den andra inloppet.
- Ta bort avfallsbehållaren och förbered minst fem 0.5 ml mikrocentrifugrör för varje utloppsslang.
- Ändra sprutpumpsystemets startparametrar till Volym: 1 ml; Flöde: 250 μL/min.
OBS: Beroende på användarens behov kan olika flödeshastigheter som 250 μL/min, 200 μL/min, 150 μL/min, 100 μL/min och 50 μL/min ställas in. En förstudie för att välja den mest gynnsamma hastigheten för det önskade resultatet rekommenderas. - Starta sprutpumpen och samla upp utflödet - 5 till 6 droppar i varje mikrocentrifugrör.
OBS: Om samma enhet används flera gånger, spola enheten enligt beskrivningen i steg 6.8 och byt ut alla kontakter, pluggar och nålar. Tvätta de använda kontakterna, pluggarna och nålarna genom att lämna dem i 20 nm filtrerad 70 % etanol i minst 30 minuter. Flytta sedan alla delar till ett rör som innehåller 20 nm filtrerat avjoniserat vatten, skaka röret noggrant och överför dem till en petriskål som innehåller 20 ml 20 nm filtrerat avjoniserat vatten. Låt petriskålen stå på shakern i minst 30 minuter vid 100 rpm och låt sedan sakerna torka i en torr petriskål (i minst 12 timmar) innan du använder den igen.
8. Enhetstestning med urinprov
- Förbered enheten enligt beskrivningen i steg 6.1-6.15.
- Samla in 100 ml morgonurin per donator med hjälp av sterila urinbehållare och leverera den till laboratoriet för bearbetning inom 2 timmar efter insamling.
- Separera varje urinprov i två 50 ml rör och centrifugera vid 2 000 x g i 15 minuter vid RT.
- Samla upp supernatanten och kassera pelleten.
- Centrifugera supernatanten vid 10 000 x g i 30 minuter vid RT för att bli av med stora partiklar och cellrester.
- Samla upp supernatanten och kassera pelleten.
- Tvätta enheten enligt beskrivningen i 6.6.
- Byt ut 5 ml sprutorna till en 20 ml spruta fylld med det förberedda urinprovet för sample inloppet och en annan 20 ml spruta fylld med 20 ml 20 nm filtrerad DEPC-PBS för buffertinloppet. Ändra sprutpumpens inställningar till BDPlastipak; Spruta: cc; Volym: 20 ml; Flöde: 250 μL/min (optimal flödeshastighet), på samma sätt som beskrivs i steg 6.2. Starta sprutpumpen och samla upp genomströmningen från varje utlopp i separata 50 ml rör.
- Koncentrera varje genomströmning separat med 100 000 molekylviktsrör med en maximal koncentrationsgrad på vardera 100 μl vid 3 000 x g vid 4 °C.
- Överför koncentraten till 0.5 ml mikrocentrifugrör.
- Virvla de koncentrerade proverna i 30 sekunder och centrifugera sedan i 10 sekunder.
- Alikvotera proverna genom att överföra 25 μl prov per rör, märk dem och frys vid -80 °C för långtidsförvaring.
9. Enhetstestning med konditionerade medier
- Förbered enheten enligt beskrivningen i steg 6.1-6.15.
- Odling av celler ien 5 % CO 2 fuktad miljö vid 37 °C tills det totala antalet når 100 miljoner enligt Bajo-Santos et al.20 Passera cellerna till en enda T175 suspensionskolv i 100 ml serumfritt medium kompletterat med 2 % B-27 serumersättningstillskott och odling i en 5 % CO2 fuktad miljö vid 37 °C i ytterligare 48 timmar.
- Samla upp cellsuspensionen och centrifugera den vid 300 x g i 5 minuter vid RT för att bli av med cellerna.
- Samla upp och centrifugera supernatanten igen vid 3 000 x g i 30 minuter vid +4 °C för att bli av med stora partiklar och cellrester.
- Samla upp supernatanten och förvara den vid +4°C tills separationen kan ske, men inte längre än 3 timmar.
- Byt ut 5 ml sprutorna mot 20 ml sprutor fyllda med det förberedda konditionerade mediet för provinloppet och fyllda med 20 ml 20 nm filtrerad PBS för buffertinloppet.
- Ställ in inställningarna i pumpstationen enligt beskrivningen i steg 7.8.
- Starta sprutpumpen och samla upp genomströmningen från varje utlopp i ett separat 50 ml rör.
- Koncentrera varje genomströmning separat med 100 000 koncentrationsrör med molekylvikt till 150 μl vardera vid 3 000 x g vid +4 °C.
- Överför koncentraten till 0.5 ml mikrocentrifugrör.
- Virvelkoncentrerade prover i 30 s.
- Centrifugera koncentrerade prover i 10 s.
- Alikvot proverna genom att överföra 25 μl prov per rör, märk dem och frys dem vid -80 °C för långtidsförvaring.
10. Isolering av elfordon med hjälp av ultracentrifugering
- Centrifugera 20 ml urin eller konditionerade cellmedier vid 100 000 x g i 70 minuter vid +4 °C med en centrifug med rotor med fast vinkel.
- Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 20 ml 20 nm filtrerad PBS.
- Centrifugera igen, enligt beskrivningen i 10.1.
- Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 12 ml 20 nm filtrerad PBS.
- Centrifugera vid 100 000 x g i 70 minuter vid +4 °C med hjälp av en svängrotor.
- Kassera supernatanten.
OBS: Var försiktig när du kasserar supernatanten den här gången. Det rekommenderas att göra det med en pipett. - Återsuspendera pelleten i 100 μl 20 nm filtrerad PBS.
- Alikvot provet och fortsätt till punkt 12 för EV-karakterisering. Förvara annars vid -80 °C tills vidare användning.
11. Isolering av elfordon med hjälp av storleksuteslutningskromatografi (SEC)
- Konkoncentrera 20 ml urin eller konditionerade cellmedier till 500 μl med 100 kDa centrifugalfilter med 100 kDa molekylviktscut-off (MWCO) vid 3 000 x g vid +4 °C i 15 minuter.
- Överför koncentratet till SEC-kolonnen (35 nm belastningsområde).
- Häll 20 nm filtrerad PBS på kolonnen och samla upp 15 fraktioner av 0,5 ml.
- Analysera fraktioner med ett dynamiskt ljusspridningssystem (DLS) enligt tillverkarens instruktioner.
- Slå ihop de valda fraktionerna. Välj fraktioner med en dämpare som är lägre än 11 och där minst 30 % av de totala partiklarna är större än 40 nm.
- Konkoncentrera de utvalda fraktionerna till 100 μl med hjälp av 3 kDa centrifugalfilterenheter med molekylviktscut-off (MWCO) vid 14 000 x g vid +4 °C i 15 minuter.
- Alikvotera provet och gå vidare till avsnitt 12 för karakterisering av EV. Förvara annars vid -80 °C tills vidare användning.
12. Karakterisering av EV
- Ta ut det prov som ska karakteriseras ur frysen och tina upp det långsamt (på ett isblock eller vid +4 °C).
- Utför nanopartikelspårningsanalys (NTA) för att bestämma partikelstorleksfördelning och mängd13. Utför högaffinitet T-cell membranprotein 4 (TIM-4) dubbelsandwichenzymkopplad immunadsorberande analys (dsELISA)14 för att bekräfta EV-närvaro i proverna.
13. NTA
- Virvla det tinade EV-provet i 30 s och snurra i 10 s, överför sedan 1 μL till 999 μL 20 nm filtrerad PBS i ett 2 ml mikrocentrifugrör för att späda ut det 1000 gånger. Spara 1 ml extra PBS som används för spädning för att kontrollera att den inte innehåller några partiklar. Förvara allt vid +4 °C fram till mätning.
OBS: Filtrera PBS genom ett 0.02 nm filter före användning. - Virvla EV-provet eller ämnet i 30 s och sätt in det i modulen med en spruta. Fyll modulen med cirka 0.7 ml sample och placera den i instrumentet.
- Mät provet med hjälp av nanopartikelanalysinstrumentet enligt tillverkarens instruktioner.
14. dsELISA för EV-markörer
- Bered en lösning av 1 μg/ml TIM4-Fc-protein. Bestryk brunnarna i en ELISA-platta med 96 brunnar genom att överföra 100 μl lösning till varje nödvändig brunn och inkubera över natten vid +4 °C under skakning vid 200 varv per minut.
- Följande dag, förbered tvättlösning (1x TBS + 0,05 % Tween20 + 2 mM CaCl2).
- Kassera all vätska i varje brunn. Tvätta varje brunn genom att tillsätta 200 μL tvättlösning, skaka vid 200 varv per minut i 5 minuter vid RT och kassera. Upprepa detta steg två gånger.
- Bered blockerande lösning (1x TBS + 0,05 % Tween20 + 1 % bovint serumalbumin. Tillsätt 200 μl blockerande lösning till varje brunn och inkubera vid RT i 1 timme under omskakning vid 200 varv per minut.
- Tvätta varje väl enligt beskrivningen i steg 14.3.
- Bered 220 μl av varje provutspädning i tvättbuffert (optimal EV-koncentration är 2,7 × 105 EV/μL). Tillsätt 100 μl av det utspädda provet per brunn och utför två replikat. Inkubera vid RT i 90 minuter medan du skakar vid 200 varv per minut.
- Tvätta varje väl enligt beskrivningen i steg 14.3.
- Tillsätt 100 μl motsvarande antikroppar till varje brunn. Använd lämpliga EV-markörer för att bekräfta EV och föroreningar4. Inkubera vid RT i 2 timmar medan du skakar vid 200 varv per minut. OBS: Om sekundära antikroppar används, upprepa steg 14.7-14.8. Minska dock inkubationstiden för sekundära antikroppar till 1 timme.
- Tvätta varje väl enligt beskrivningen i steg 14.3.
- Tillsätt 100 μl pepparrotsperoxidassubstrat till varje brunn, blanda plattan i 1 minut och inkubera vid RT i 30 min.
- Tillsätt 1 M H2SO4 till varje brunn för att stoppa reaktionen.
- Mät absorbansen vid 450 nm med hjälp av en mikroplattläsare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi tillverkade en mikrofluidisk enhet med hjälp av en 3D-printad dubbelnegativ form (figur 1) via mjuklitografi (figur 2A) för EV-separation med hög genomströmning baserat på den förgrenade A4F-principen (figur 2B,C). Installationen kräver en pump och en genomströmningsstation, som kan ses i figur 3, för isolering av elfordon på ett automatiserat sätt. För det första, för att utvärdera koncepttestet för enheterna, förbereddes en blandning av polystyrenpärlor med diametrar på 100 nm och 1000 nm för att representera vesiklar respektive fincellrester10. Experiment utfördes med varierande flödeshastigheter för strängblandningen, både med och utan förgrening av flödet, för att undersöka effekten av linjär hastighet på separationseffektiviteten. I alla experiment förblev återvinningen av små pärlor konsekvent och över 90 %10, vilket visar enhetens potential att återvinna EV.
Sedan utvärderade och jämförde vi potentialen hos COC-OSTE-enheten när det gäller att isolera elfordon från stora volymer (>1 ml) från komplexa biovätskor med minimal förbehandling. Som sådan användes urin från 10 friska donatorer (Figur 4) och cellmedia från två olika prostatacellinjer (Figur 5) som mall för att samtidigt isolera EV enligt tre olika procedurer: ultracentrifugering (UC), storleksuteslutningskromatografi (SEC) och den A4F mikrofluidikbaserade OSTE-COC-enheten. Efter isolering bedömdes det totala antalet partiklar och deras storleksfördelning med hjälp av nanopartikelspårningsanalys (NTA). I genomsnitt uppvisade OSTE-COC-enheten bättre total partikelåtervinning från biovätskor jämfört med UC, men den statistiska signifikansen uppnåddes endast när man kombinerade partikelantalet från båda portarna (figur 4A). För att jämföra enhetens prestanda med andra system bör R & L-uttaget tillsammans beaktas. Som visas i figur 4 överträffar L & R-utloppets sammanlagda prestanda vid återvinning av elbilar UC och SEC. Separat utformades L-porten för att fånga upp den lilla EV-fraktionen, medan R-porten utformades för att samla in den större EV-fraktionen med andra molekyler av liknande storlek. Intressant nog var återhämtningen med hjälp av R-PORT för OSTE-COC-enheten något högre än enbart SEC och UC (figur 4A). CD63-uttrycket visade ett liknande mönster (Figur 4C). Detta resultat indikerar att OSTE-COC-enheten var mer effektiv vid total EV-återhämtning. Motsvarande storleksfördelning hittades mellan de olika metoderna, med undantag för UC som visar en större partikelstorleksfördelning (Figur 4B).
Jämförbara resultat observerades i cellmediekulturer. I båda scenarierna uppvisade den totala partikelåtervinningen från båda enhetsportarna överlägsen prestanda jämfört med SEC- eller UC-metoder (som visas i figur 5A,B). Noterbart är att EV som härrörde från PC3-celler uppvisade en distinkt storleksfördelning, med större homogenitet i L-PORT-fördelningen jämfört med andra experimentella grupper (Figur 5C,D). Dessutom bekräftade analysen av CD63-uttrycket de högre återvinningsgraderna för elfordon som uppnåddes med hjälp av COC-OSTE-enheten (som illustreras i figur 5E,F). En sammanfattning som jämför isoleringsegenskaperna hos de olika metoder som undersöktes i denna studie finns i tabell 1.
Figur 1: 3DP serpentinformade dubbla negativa formdimensioner och isometrisk vy. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: COC-OSTE mikrofluidikanordning. (A) Schema över de olika huvudstegen i tillverkningen av OSTE-COC-enheten. (B) Anordningens funktionsprincip. (C) Bild av den färdiga enheten. Skalstreck: 15 mm. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Priedols et al.10 och Bajo-Santos et al.20. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 3: Experimentell konfiguration av enheten. Sprutpumpen är till vänster, OSTE-COC-enheten är i mitten och återvinningsstationen är till höger. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Priedols et al.10 och Bajo-Santos et al.20. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Urinvägsfördelning och partikelåtervinning från 10 donatorer med hjälp av ultracentrifugering (UC), storleksuteslutningskromatografi (SEC) och COC-OSTE-enheten. A) Partikelmängd som återvunnits från varje isoleringsmetod genom analys av spårning av nanopartiklar (NTA). Data representeras som medelvärde +/- standardavvikelse. Statistisk signifikans betecknas med * (p<0,05). (B) Boxplots visar den genomsnittliga partikelstorleksfördelningen bland alla urinprover som bedömts med NTA, med morrhår som anger minimi- och maximivärdena. P-värdena härleddes från jämförelser med UC, där **** indikerar hög statistisk signifikans (p<0,0001). (C) Medianen och intervallet för den genomsnittliga CD63-mängden, bedömd med dubbelsandwichenzymkopplad immunadsorberande analys (dsELISA), för varje isoleringsmetod, beräknades för alla prover. L-port: Vänster port; R-port: Höger port. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Bajo-Santos et al.20. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Karakterisering av EV isolerade från PC3- och LNCaP-celler med olika metoder. (A) Partikelmängd som återvunnits från PC3-medier med hjälp av analys av spårning av nanopartiklar (NTA) representerad som medelvärde +/- standardavvikelse. (B) Partikelmängd som återvunnits från LNCaP-cellmedia med användning av NTA representerad som medelvärde +/- standardavvikelse. (C) Medianpartikelstorleksfördelningen för EV från PC3-kulturer, tillsammans med räckvidden, bestämdes av NTA. (D) Medianstorleksfördelning för EV isolerade från LNCaP-kulturer med räckvidd. (E) Medianvärde och intervall för CD63-uttryck för varje isoleringsmetod för PC3-cellinjehärledd EV, med användning av dubbelsandwichenzymkopplad immunadsorberande analys (dsELISA). (F) Medianvärde och intervall för LNCaP-härlett EV CD63-uttryck med dsELISA för varje isoleringsmetod. UC: Ultracentrifugering; SEC: Storleksuteslutningskromatografi; L-port: Vänster port; R-port: Höger port. Denna siffra har modifierats med tillstånd från Bajo-Santos et al.20. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| UC | SEK | COC-OSTE | |
| Bearbetningstid/prov | ++/+++ | +++ | + |
| Genomströmning | ++ | + | +++ |
| Kostnad/prov | + | +++ | ++ |
| Renhet | + | +++ | ++ |
| Automatisering | ++ | + | +++ |
| EV-avkastning | ++ | ++ | +++ |
| Val av storlek | + | ++ | ++ |
Tabell 1. Jämförelse av isoleringsegenskaper hos elfordon med de tre metoderna UC SEC och COC-OSTE-enheten. UC: Ultracentrifugering; SEC: Storleksuteslutningskromatografi. COC-OSTE: cyklisk olefinsampolymer-off-stökiometri tiol-en. +: låg; ++: medel; +++: hög. * Enhetsberoende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterade mikrofluidikenheten erbjuder en lovande metod för isolering och extraktion av EV från biologiska vätskor, vilket tar itu med några av de kritiska begränsningarna hos befintliga guldstandardmetoder som UC och SEC12. UC och SEC är kända för att vara arbetskrävande, tidskrävande och lider av låg avkastning, vilket gör dem mindre lämpliga för applikationer med hög genomströmning där stora mängder elfordon behövs21,22. Däremot kan den beskrivna mikrofluidikenheten kontinuerligt bearbeta en betydande volym på upp till 20 ml biologisk vätska med minimal användarinmatning, vilket gör den till en potentiell spelväxlare för industriella eller kliniska miljöer. En av de viktigaste fördelarna med denna mikrofluidiska enhet är dess förmåga att standardisera EV-isolering och förbättra reproducerbarheten jämfört med traditionella metoder som involverar manuella steg. Genom att minska variabiliteten i tillverkningen av EV-isoleringsenheter genom masstillverkning kan enhetens prestanda kontrolleras bättre och konsekvent, vilket är avgörande för applikationer som EV-baserade terapier och diagnostik. Dessutom ökar enhetens kompatibilitet med tillverkning av stora volymer via reaktionsformsprutning av lämpliga substrat ytterligare dess potential för skalbarhet och bredare användning.
För att säkerställa reproducerbarhet och konsekvent prestanda krävs ett omfattande och väldefinierat protokoll, både för att producera chipet och för dess användning i experiment. Chipet är designat med industrialisering i åtanke. Under tillverkningen av enheten i laboratoriemiljön måste man dock vara uppmärksam på att undvika att bubblor bildas, säkerställa exakt och robust bindning och utföra grundliga tester vid högre flödeshastigheter än de som förväntas i verkliga experiment. Denna försiktighetsåtgärd är särskilt viktig för COC-OSTE-enheter, eftersom de kan vara benägna att läcka på grund av misslyckad bindning, särskilt vid högre flödeshastigheter. Dessutom, eftersom OSTE är ett ljuskänsligt material, bör enhetstillverkningen utföras i gult ljus för att undvika onödig exponering för UV. Eftersom denna teknik fortfarande är i ett inledande skede bör forskare experimentera med olika flödeshastigheter för att identifiera den optimala inställningen för deras specifika tillämpning eftersom standardiserade protokoll för denna nya metod ännu inte har fastställts, och flytande viskositet kan tydligt påverka EV-isoleringseffektiviteten baserat på våra resultat. Genom att följa dessa riktlinjer och ta itu med utmaningarna med standardisering kan potentialen hos denna mikrofluidiska enhet för EV-isolering förverkligas fullt ut inom olika forskningsområden och applikationer.
Metoden för EV-isolering med hjälp av mikrofluidikenheten möjliggör omfattande modifiering och felsökning för att optimera prestandan. För att förbättra partikelseparationen kan forskare utforska längre kanaler, olika membranporositeter och portätheter samt förändrade dimensioner. Om det finns många stora partiklar i det lilla partikelutloppet kan det vara fördelaktigt att testa en högre buffertinloppshastighet, medan om det finns många små partiklar i det stora partikelutloppet rekommenderas att experimentera med en längre kanal eller ett membran med större porer. Att ta itu med partikelabsorption kan innebära att justera flödeshastigheter, ytmodifieringar och OSTE-sammansättning eller ändra UV-exponeringstiden. För enheter som upplever instabilitet och läckage är det avgörande steg att minska flödeshastigheterna och säkerställa korrekt limning. För att minimera EV-skador kan forskare minska flödeshastigheterna, tvätta med PBS mer noggrant efter sterilisering av enheten och överväga att använda mindre membranporer eller alternativa formdesigntekniker och material. Genom dessa justeringar kan mikrofluidikenheten finjusteras, vilket frigör dess potential för olika tillämpningar inom EV-forskning och relaterade områden. Dessutom, för att optimera enhetens prestanda, kan uppströms provkarakterisering, inklusive densitets- och viskositetsmätningar, införlivas för att justera flödesparametrarna. Dessutom måste särskild vikt läggas vid provets beskaffenhet, med tanke på att biovätskor har fastställts att de inte är sterila23. Följaktligen bör sterilisering av prover innan de administreras i kliniska tillämpningar övervägas på vederbörligt sätt.
Trots dessa utmaningar har mikrofluidiken en enorm potential inom olika forskningsområden. Dess förmåga att kontinuerligt isolera elfordon från stora volymer av mycket heterogena prover öppnar dörren för automatisering, vilket underlättar tillämpningar med hög genomströmning och möjliggör mer djupgående analyser av elfordon från olika källor. Att integrera denna mikrofluidikmodul i olika enheter, såsom bioreaktorpatroner med ihåliga fiberceller eller högupplösta flödescytometrar, kan göra EV-applikationer mer industrivänliga och driva innovation inom områden som läkemedelsleverans, diagnostik och kosmetika4. Sammantaget representerar denna mikrofluidikenhet ett betydande steg framåt inom EV-forskningen, och erbjuder en effektiv och standardiserad metod för EV-isolering med lovande tillämpningar inom ett brett spektrum av forskning och industriella miljöer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
A.A., G.M. och R.R. är grundare, styrelseledamöter och aktieägare i Cellbox Labs, LLC
Acknowledgments
Vi tackar alla donatorer som deltog i denna studie, personalen vid den lettiska genomdatabasen för att ha tillhandahållit proverna. Institutet för fasta tillståndets fysik, Lettlands universitet som Center of Excellence har fått finansiering från EU:s Horizon 2020 Framework Programme H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 enligt bidragsavtal nr 739508, projekt CAMART2. Detta arbete stöddes av The Latvian Council of Science Project No. lzp-2019/1-0142 och projektnr: lzp-2022/1-0373.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 µm carboxylate FluoSpheres | Invitrogen | #F8803 | Stock concentration: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT dependent) |
| 0.5 mL microcentrifuge tubes | Starstedt | 72.704 | |
| 1 mL Luer cone syringe single use without needle | RAYS | TUB1ML | |
| 1.0 µm polystyrene FluoSpheres | Invitrogen | #F13083 | Stock concentration: 1 x 1010 beads/mL (LOT dependent) |
| 10 mL Serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| 15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filters | Merck Millipore | UFC910024 | |
| 2.0 mL Protein LoBind tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| 20 mL syringes | BD PlastikPak | 10569215 | |
| 250 µm ID polyether ether ketone tubing | Darwin Microfluidics | CIL-1581 | |
| 3 kDa MWCO centrifugal filter units | Merck Millipore, | UFC200324 | |
| 5 mL Medical Syringe without Needle | Anhui Hongyu Wuzhou Medical | 159646 | |
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 70 Ti fixed angle ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| 800 µm ID polytetrafluoroethylene tubing | Darwin Microfluidics | LVF-KTU-15 | |
| 96 well microplate, f-bottom, med. binding | Greiner Bio-One | 655001 | ELISA plate |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine serum albumin | SigmaAldrich | A7906-100G | |
| COC Topas microscopy slide platform | Microfluidic Chipshop | 10000002 | |
| COC Topas microscopy slide platform 2 x 16 Mini Luer | Microfluidic Chipshop | 10000387 | |
| Elveflow OB1 pressure controller | Elvesys Group | ||
| Luer connectors | Darwin Microfluidics | CS-10000095 | |
| Mask aligner Suss MA/BA6 | SUSS MicroTec Group | ||
| Mixer Thinky ARE-250 | Thinky Corporation | ||
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | nanoparticle analyzer |
| Optical microscope Nikon Eclipse LV150N | Nikon Metrology NV | ||
| OSTE 322 Crystal Clear | Mercene Labs | ||
| PBS TABLETS.Ca/Mg free. Fisher Bioreagents. 100 g | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| PC membrane (50 nm pore diameter, 11.8% density) | it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium | ||
| Petri dishes, sterile | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| Plasma Asher GIGAbatch 360 M | PVA TePla America, LLC | ||
| qEVoriginal/35 nm column | Izon | SP5 | SEC column |
| QSIL 216 Silicone Elastomer Kit | PP&S | ||
| Resin Tough Black | Zortrax | ||
| SW40 Ti swing ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 331301 | |
| Syringe pump | DK Infusetek | ISPLab002 | |
| T175 suspension flask | Sarstedt | 83.3912.502 | |
| TIM4-Fc protein | Adipogen LifeSciences | AG-40B-0180B-3010 | |
| TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) | SigmaAldrich | T0440-100ML | Horseradish peroxidase substrate |
| Tween20 | SigmaAldrich | P1379-100ML | |
| Ultracentrifuge Optima L100XP | Beckman Coulter | ||
| Ultrasonic cleaning unit P 60 H | Elma Schmidbauer GmbH | ||
| Universal Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek instruments | 71777-1 | |
| Urine collection cup, 150mL, sterile | APTACA | 2120_SG | |
| Whatman Anotop 25 Syringe Filter | SigmaAldrich | 68092002 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | dynamic light scattering (DLS) system | |
| Zortrax Inkspire | Zortrax |
References
- Colombo, M., et al. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Tricarico, C., et al. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Wang, Z. Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances. Biomed Pharmacother. 153, 113480 (2022).
- Royo, F., et al. Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee. Cells. 9 (9), 1955 (2020).
- Sidhom, K., et al. A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option. Int J Mol Sci. 21 (18), 6466 (2020).
- Reshi, Q. U. A., et al. Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns. Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).
- Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. J Chromatogr A. 1636, 461773 (2021).
- Priedols, M., et al. Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation. Polymers. 15 (4), 789 (2023).
- Zhang, H., Lyden, D. Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization. Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).
- Talebjedi, B., et al. Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment. Front Vet Sci. 7, 620809 (2020).
- van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).
- Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
- Bussooa, A., et al. Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices. Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198 (2022).
- Tang, L., Lee, N. Y. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).
- Borda, E., et al. Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets. Biomaterials. 293, 121979 (2023).
- Sandström, N., et al. Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002 (2015).
- Sticker, D., et al. Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).
- Bajo-Santos, C., et al. Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device. Int J Mol Sci. 24 (9), 7971 (2023).
- Claridge, B., et al. Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities. Front Cell Dev Biol. 9, 734720 (2021).
- Rezaie, J., et al. Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges. Cell Commun Signal. 20 (1), 145 (2022).
- Aragón, I. M., et al. The urinary tract microbiome in health and disease. Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).
