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Bioengineering

एक द्विभाजित A4F माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के साथ बड़ी मात्रा के नमूनों से बाह्य पुटिकाओं का एकल चरण अलगाव

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/66019
Automatic Translation
*1, *2, *1, 1, 3,4, 1, 2,3, 2,3, 1,3
1Latvian Biomedical Research and Study Centre, 2Institute of Solid-State Physics, University of Latvia, 3Cellbox labs LTD, Atari, 4Faculty of Materials Science and Applied Chemistry, Institute of General Chemical Engineering, Riga Technical university
* These authors contributed equally

Summary

बाह्य पुटिकाओं में बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए बहुत बड़ा वादा है, लेकिन वर्तमान अलगाव विधियां नैदानिक उपयोग के लिए समय लेने वाली और अव्यावहारिक हैं। इस अध्ययन में, हम एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस प्रस्तुत करते हैं जो न्यूनतम चरणों के साथ निरंतर तरीके से बायोफ्लुइड की बड़ी मात्रा से बाह्य पुटिकाओं के प्रत्यक्ष अलगाव को सक्षम बनाता है।

Abstract

एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवीएस) में निदान, दवा वितरण और पुनर्योजी चिकित्सा सहित विभिन्न बायोमेडिकल अनुप्रयोगों के लिए अपार संभावनाएं हैं। फिर भी, ईवीएस को अलग करने के लिए वर्तमान पद्धतियां महत्वपूर्ण चुनौतियां पेश करती हैं, जैसे जटिलता, समय की खपत और भारी उपकरणों की आवश्यकता, जो उनके नैदानिक अनुवाद में बाधा डालती है। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, हमने चक्रीय ओलेफिन कॉपोलीमर-ऑफ-स्टोइकोमेट्री थिओल-एन (सीओसी-ओएसटीई) पर आधारित एक अभिनव माइक्रोफ्लुइडिक प्रणाली विकसित करने का लक्ष्य रखा है, जो निरंतर तरीके से बड़ी मात्रा के नमूनों से ईवीएस के कुशल अलगाव के लिए है। आकार और उछाल-आधारित पृथक्करण का उपयोग करके, इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली तकनीक ने मूत्र और सेल मीडिया नमूनों से मौजूदा दृष्टिकोणों की तुलना में काफी संकीर्ण आकार वितरण हासिल किया, जिससे भविष्य के अनुप्रयोगों में विशिष्ट ईवी आकार अंशों को लक्षित करने में सक्षम बनाया गया। हमारे अभिनव सीओसी-ओएसटीई माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस डिज़ाइन, द्विभाजित असममित प्रवाह क्षेत्र-प्रवाह अंशांकन तकनीक का उपयोग करते हुए, बड़ी मात्रा के नमूनों के लिए एक सीधा और निरंतर ईवी अलगाव दृष्टिकोण प्रदान करता है। इसके अलावा, इस माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के बड़े पैमाने पर निर्माण की क्षमता स्केलेबिलिटी और स्थिरता प्रदान करती है, जिससे ईवी अलगाव को नियमित नैदानिक निदान और औद्योगिक प्रक्रियाओं में एकीकृत करना संभव हो जाता है, जहां उच्च स्थिरता और थ्रूपुट आवश्यक आवश्यकताएं हैं।

Introduction

एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ईवीएस) सेल-व्युत्पन्न झिल्ली-बाध्य कण होते हैं जिनमें दो मुख्य प्रकार होते हैं: एक्सोसोम (30-200 एनएम) और माइक्रोवेसिकल्स (200-1000 एनएम)1। एक्सोसोम एक मल्टीवेसिकुलर बॉडी (एमवीबी) के भीतर एंडोसोमल झिल्ली के आवक नवोदित के माध्यम से बनते हैं, प्लाज्मा झिल्ली1 के साथ संलयन पर बाह्य अंतरिक्ष में इंट्राल्यूमिनल पुटिकाओं (आईएलवी) को जारी करते हैं। इसके विपरीत, माइक्रोवेसिकल्स कोशिका झिल्ली2 के बाहरी नवोदित और विखंडन द्वारा उत्पन्न होते हैं। ईवीएस प्रोटीन, न्यूक्लिक एसिड, लिपिड और मेटाबोलाइट्स के परिवहन द्वारा अंतरकोशिकीय संचार में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जो विकास, एंजियोजेनेसिस, मेटास्टेसिस, प्रसार औरचिकित्सा प्रतिरोध सहित सेल की शारीरिक स्थिति को दर्शाते हैं। नतीजतन, वे कैंसर सहित बीमारियों के लिए आशाजनक बायोमार्कर और चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में उभरे हैं, जो निदान और दवा वितरण प्रणाली में उनकी क्षमता को उजागर करतेहैं।

रोग निदान और चिकित्सा विज्ञान में ईवीएस का पूरी तरह से उपयोग करने के लिए, विभिन्न बायोफ्लुइड से कुशल अलगाव महत्वपूर्ण है5. सामान्य तरीकों ultracentrifugation (यूसी), घनत्व ढाल centrifugation, आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी), निस्पंदन, और immunoisolation6 शामिल हैं. यूसी एक व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक है, लेकिन समान घनत्व के कणों का उत्पादन कर सकती है जो ईवीएस नहीं हैं और ईवी समुच्चय7 उत्पन्न कर सकते हैं। एसईसी घनत्व 8 के बजाय आकार के आधार पर कणों को छोड़कर उच्च शुद्धता नमूने प्रदान करने की क्षमता के कारण लोकप्रियता हासिल कीहै. हालांकि, एसईसी कॉलम के लिए उपयुक्त ताकना आकार का सावधानीपूर्वक चयन और क्रोमैटोग्राफी स्थितियों का अनुकूलन काइलोमाइक्रोन और कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन जैसे अवांछित कणों के सह-अलगाव को कम करने के लिएआवश्यक है 8. उनकी प्रभावशीलता के बावजूद, दोनों विधियां समय लेने वाली और स्वचालित करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं, विशेष रूप से सेल मीडिया या मूत्र जैसे बड़ी मात्रा के नमूनों के लिए,औद्योगिक अनुप्रयोगों 9 के लिए उनकी मापनीयता को सीमित करती हैं।

हाल के वर्षों में, असममित क्षेत्र प्रवाह क्षेत्र अंश (A4F) आकार और उछाल आधारित सूक्ष्म और नैनोमीटर आकार कणजुदाई 10 के लिए एक शक्तिशाली जुदाई तकनीक के रूप में विकसित हुआ है. A4F का परिचालन सिद्धांत एक माइक्रोफ्लुइडिक चैनल पर निर्भर करता है जो इसके आधार पर एक छिद्रपूर्ण झिल्ली के साथ संपन्न होता है, जो क्रॉस-फ्लो10 नामक झिल्ली की ओर लगाया गया बल उत्पन्न करता है। जब ब्राउनियन गति और सिस्टम के लिए निहित Poiseuille प्रवाह के साथ संयुक्त, पार प्रवाह प्रवाह गतिशीलता11 के भीतर कण स्थिति बदलती के कारण कुशल कण जुदाई की सुविधा. लाभ के बावजूद, इस विधि माइक्रोलीटर रेंज12 के भीतर नमूना मात्रा के लिए सीमित है और एक अतिरिक्त ध्यान केंद्रित कदम की आवश्यकता है, प्रक्रिया10 की अवधि का विस्तार.

पिछले दशक में, माइक्रोफ्लुइडिक्स ने तेजी से, कुशल और नैदानिक रूप से विश्वसनीय ईवी पृथक्करण13 के लिए एक उपकरण के रूप में प्रमुखता प्राप्त की है। हालांकि, ईवी पृथक्करण के लिए डिज़ाइन किए गए अधिकांश माइक्रोफ्लुइडिक तरीकों को छोटी मात्रा, उच्च सांद्रता वाले ईवी नमूनों के लिए अनुकूलित किया जाता है या जटिल पृथक्करण प्रक्रियाओं14पर निर्भर करता है। इसके अलावा, माइक्रोफ्लुइडिक्स के क्षेत्र के भीतर, पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) को इसकी ऑप्टिकल पारदर्शिता, जैव-अनुकूलता और उपयोग में आसानी के कारण स्वर्ण मानक सामग्री के रूप में मान्यता प्राप्त है15. फिर भी, ईवीएस सहित छोटे लिपोफिलिक अणुओं को अवशोषित करने की इसकी ज्ञात प्रवृत्ति, ईवी क्षेत्र13 में इसके आवेदन के लिए समस्याग्रस्त हो सकती है।

चक्रीय ओलेफिन कॉपोलीमर (सीओसी) बायोकम्पैटिबिलिटी, अणुओं के छोटे अवशोषण और उच्च रासायनिक प्रतिरोध15 के कारण माइक्रोफ्लुइडिक्स में अक्सर उपयोग की जाने वाली सामग्री है। हालांकि, सीओसी उपकरणों के निर्माण में अक्सर जटिल प्रक्रियाएं या विशेष उपकरण16शामिल होते हैं। वैकल्पिक रूप से, ऑफ-स्टोइकोमेट्री थिओल-एन (ओएसटीई) छोटे अणुओं के अवशोषण में कमी, बेहतर रासायनिक स्थिरता, निर्माण में आसानी औरस्केलेबल निर्माण प्रक्रिया 17,18के कारण पीडीएमएस का एक आशाजनक विकल्प है। हालांकि, टयूबिंग के लिए जटिल कनेक्शन के कारण, उपकरणों19 लीक करने के लिए प्रवण किया जा सकता है.

इस अध्ययन का उद्देश्य ओएसटीई और सीओसी के संयोजन वाले एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को इंजीनियर और बनाना था और मूत्र या सेल मीडिया जैसे बड़ी मात्रा के नमूनों से ईवी पृथक्करण के लिए ए 4 एफ सिद्धांत को द्विभाजित करना था।

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Protocol

नमूना संग्रह लातवियाई विश्वविद्यालय जीवन और चिकित्सा विज्ञान अनुसंधान आचार समिति (निर्णय N0-71-35/54) द्वारा अनुमोदित किया गया था

नोट: इस अध्ययन में प्रयुक्त सामग्री सामग्री फ़ाइल की तालिका में शामिल हैं।

1. त्रि-आयामी (3 डी) मुद्रित मोल्ड निर्माण

  1. शीर्ष चैनल के लिए निम्नलिखित आयामों के साथ सीएडी सॉफ्टवेयर में एक सर्पिन के आकार का डबल नकारात्मक मोल्ड डिज़ाइन करें: 0.5 मिमी की ऊंचाई, 1 मिमी की चौड़ाई और 210 मिमी की लंबाई। नीचे के चैनल के लिए, 1.5 मिमी की चौड़ाई, 0.6 मिमी की ऊंचाई और 210 मिमी की लंबाई के साथ एक ही डिज़ाइन का उपयोग करें। मोल्ड चौड़ाई, लंबाई, ऊंचाई और डिजाइन आइसोमेट्रिक चित्रण जैसे आयाम चित्र 1 में दिखाए गए हैं। डिज़ाइन को .stl फ़ाइल के रूप में सहेजें।
  2. जेड-सूट में फ़ाइल तैयार करें; कोई समर्थन जोड़ने की आवश्यकता नहीं है। कठिन काले राल के साथ पराबैंगनी लिक्विड क्रिस्टल डिस्प्ले (यूवी एलसीडी) 3 डी प्रिंटर का उपयोग करके नए नए साँचे प्रिंट करें।
  3. मुद्रण के बाद, प्रिंटर की सतह से सांचों को ध्यान से हटा दें। 20 मिनट के लिए sonication में isopropanol (आईपीए) में नए नए साँचे धो लें.
  4. एन2 के साथ सांचों को ब्लो-ड्राई करें।
  5. 810 एस के लिए एनडी 33 फिल्टर का उपयोग करके बाढ़ के जोखिम के लिए नए नए साँचे का पर्दाफाश करें, फिर उन्हें 48 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर ओवन में रखें।

2. पीडीएमएस मोल्ड्स की तैयारी

  1. 10:1 w/w अनुपात पर वजन पीडीएमएस (प्रत्येक मोल्ड के लिए, 16 ग्राम इलास्टोमेर बेस और 1.6 ग्राम क्रॉस-लिंकिंग एजेंट का उपयोग करें)। एक ग्रहों केन्द्रापसारक मिक्सर में घटकों को मिलाएं, 500 आरपीएम पर 1 मिनट के लिए मिश्रण।
  2. मिश्रित पीडीएमएस को 3 डी-प्रिंटेड मोल्ड्स में कास्ट करें और वैक्यूम डेसिकेटर में -800 एमबार पर 30 मिनट के लिए या जब तक कोई बुलबुले नहीं देखे जाते।
  3. ध्यान से तरल PDMS के शीर्ष पर एक 100 माइक्रोन मोटी polyvinyl क्लोराइड लाइनर जगह है.
    नोट: बुलबुला गठन से बचने के लिए लाइनर को धीरे-धीरे एक तरफ से दूसरी तरफ लागू करें।
  4. पीडीएमएस के साथ मोल्ड को मोल्ड-इन-प्लेस जिग में डालें और 0.3 एनएम पर सेट टॉर्क रिंच का उपयोग करके जिग को कस लें।
  5. पीडीएमएस को ठीक करने के लिए जिग को 3 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।
  6. हेक्स कुंजी का उपयोग करके जिग को अलग करें और जिग से 3 डी-प्रिंटेड मोल्ड को हटा दें।
  7. 3 डी-प्रिंटेड मास्टर मोल्ड्स से पीडीएमएस मोल्ड्स को सावधानी से डी-मोल्ड करें, मोल्ड के किनारों के चारों ओर स्केलपेल के साथ चल रहा है, फिर चिमटी के साथ मोल्ड को हटा रहा है।
    नोट: आसान मोल्ड हटाने के लिए, आईपीए का उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, नए नए साँचे अतिरिक्त आईपीए वाष्पित करने के लिए बाद में 10 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर गरम किया जाना चाहिए.

3. ओएसटीई-सीओसी शीर्ष चैनल की तैयारी

  1. वजन OSTE 1.09:1 w/w अनुपात पर (5 उपकरणों के लिए, A भाग का 1.56 ग्राम और B भाग का 1.44 ग्राम आवश्यक है)। एक ग्रहों केन्द्रापसारक मिक्सर में घटकों को मिलाएं: 750 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए मिलाएं, फिर 750 आरपीएम पर 5 मिन के लिए डेगास।
  2. मिश्रित ओएसटीई को एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें और 30 मिनट के लिए वैक्यूम डेसिकेटर में -800 एमबार पर डेगास करें।
  3. 10 मिनट के लिए आईपीए में sonication द्वारा 2 x 16 मिनी Luer कनेक्टर के साथ स्वच्छ COC स्लाइड। ध्यान से N2 के साथ स्लाइड्स सुखाएँ.
  4. प्लाज्मा आशेर में साफ सीओसी स्लाइड रखें ताकि सपाट सतह ऊपर की ओर रखी जाए, और 0.133 एमबार दबाव के साथ 700 डब्ल्यू पावर पर 2 मिन के लिए 800 एससीसीएम ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ सतह का इलाज करें।
  5. शीर्ष चैनल के लिए पीडीएमएस मोल्ड पर ऑक्सीकृत सीओसी स्लाइड रखें ताकि उपचारित सतह पीडीएमएस की संरचित सतह के संपर्क में हो। असेंबली को मोल्ड-इन-प्लेस जिग में रखें, जिग को टॉर्क रिंच के साथ 0.3 एनएम पर सेट करें।
  6. दबाव प्रणाली को 6 बार पर संपीड़ित वायु रेखा से कनेक्ट करें। अपकेंद्रित्र ट्यूब को डीगैस्ड ओएसटीई के साथ लें और 0.8 मिमी आंतरिक व्यास (आईडी) के साथ पॉलीटेट्राफ्लोरेथिलीन (पीटीएफई) टयूबिंग का उपयोग करके दबाव प्रणाली निर्देशों के अनुसार इसे इकट्ठा करें।
  7. PTFE ट्यूब को PDMS मोल्ड के इनलेट से कनेक्ट करें और, दबाव प्रणाली में स्थित पीजोइलेक्ट्रिक पंप द्वारा बनाए गए 1000 mbar दबाव का उपयोग करके, डिवाइस को भरें। मास्क संरेखण में कांच की तरफ के साथ जिग प्लेस और ND33 फिल्टर का उपयोग कर 850 एमजे खुराक के साथ बेनकाब.
  8. एक्सपोजर के बाद, हेक्स कुंजी का उपयोग करके जिग को अलग करें और पीडीएमएस मोल्ड से संरचित ओएसटीई परत के साथ सीओसी स्लाइड को ध्यान से हटा दें।
  9. संरचित ओएसटीई को 50 एनएम छिद्रों और 11.8% छिद्र घनत्व के साथ 25 मिमी x 75 मिमी झिल्ली के संपर्क में लाएं ताकि चैनल पूरी तरह से झिल्ली से ढके हों।
    नोट: आवेदन की प्रक्रिया के दौरान झिल्ली को यथासंभव सीधा रखना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।
  10. झिल्ली पक्ष के साथ 60 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक गर्म थाली पर विधानसभा प्लेस, झिल्ली के शीर्ष पर एक साफ गिलास स्लाइड जगह है, और भी संबंध सुनिश्चित करने के लिए ऊपर से एक 1.6 केपीए दबाव लागू होते हैं. असेंबली को रात भर गर्म करें।
    नोट: इस चरण के बाद, संबंध प्रदर्शन और चैनल विरूपण का मूल्यांकन करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है।

4. OSTE-COC बॉटम चैनल और डिवाइस असेंबली की तैयारी

  1. OSTE को 1.09:1 w/w अनुपात पर मिलाएं (5 उपकरणों के लिए A भाग का 1.56 ग्राम और B भाग का 1.44 ग्राम आवश्यक है)। एक ग्रहों केन्द्रापसारक मिक्सर में घटकों को मिलाएं: 750 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए मिलाएं, फिर 750 आरपीएम पर 5 मिनट के लिए डेगास।
  2. मिश्रित ओएसटीई को एक बाज़ ट्यूब में स्थानांतरित करें और 30 मिनट के लिए वैक्यूम डेसिकेटर में -800 एमबार पर डेगास करें।
  3. 10 मिनट के लिए आईपीए में sonication द्वारा साफ सीओसी स्लाइड। ध्यान से N2 के साथ स्लाइड्स सुखाएँ.
  4. प्लाज्मा आशेर में स्वच्छ सीओसी स्लाइड रखें और 0.133 एमबार दबाव के साथ 700 डब्ल्यू शक्ति पर 2 मिनट के लिए 800 एससीसीएम ऑक्सीजन प्लाज्मा के साथ सतह का इलाज करें।
  5. नीचे चैनल के लिए पीडीएमएस मोल्ड पर ऑक्सीकृत सीओसी स्लाइड रखें ताकि उपचारित सतह पीडीएमएस की संरचित सतह के संपर्क में हो। असेंबली को मोल्ड-इन-प्लेस जिग में रखें, जिग को टॉर्क रिंच के साथ 0.3 एनएम पर सेट करें।
  6. बाज़ ट्यूब को डीगैस्ड ओएसटीई के साथ लें और 0.8 मिमी आईडी के साथ पीटीएफई टयूबिंग का उपयोग करके दबाव प्रणाली निर्देशों के अनुसार इसे इकट्ठा करें।
  7. PTFE ट्यूब को PDMS मोल्ड के इनलेट से कनेक्ट करें और डिवाइस को 1000 mbar प्रेशर फिल का उपयोग करें। मास्क संरेखण में कांच की तरफ के साथ जिग प्लेस और ND33 फिल्टर का उपयोग कर 1100 एमजे खुराक के साथ बेनकाब.
  8. एक्सपोजर के बाद, हेक्स कुंजी का उपयोग करके जिग को अलग करें और पीडीएमएस मोल्ड से संरचित ओएसटीई परत के साथ सीओसी स्लाइड को ध्यान से हटा दें।
  9. शीर्ष चैनल असेंबली के साथ संरचित ओएसटीई परत को मिलाएं ताकि ऊपर और नीचे की परत का डिज़ाइन एक दूसरे के साथ संरेखित हो और ओएसटीई नीचे की परत झिल्ली के संपर्क में हो।
  10. डिज़ाइन को मोल्ड-इन-प्लेस जिग में डालें और, बुलडॉग क्लिप का उपयोग करके, डिवाइस पर समान रूप से 1.6 kPa दबाव लागू करें। जिग को रात भर 60 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।
    नोट: क्लिप के असमान प्लेसमेंट से असमान संबंध हो सकते हैं।

5. डिवाइस मूल्यांकन

  1. संबंध के बाद, दृश्य दोषों के लिए माइक्रोस्कोप के साथ उपकरणों का नेत्रहीन मूल्यांकन करें, उदाहरण के लिए, चैनल की विकृति या असफल संबंध।
  2. 30 एमबार दबाव के साथ चैनलों के माध्यम से 0.02 माइक्रोन फ़िल्टर्ड विआयनीकृत पानी पारित करके कोई दोष के साथ उपकरणों का परीक्षण करें। प्रवाह चैनल और Luer बंदरगाह लीक और पानी के प्रवाह के लिए निरीक्षण करें।
    नोट: यदि कोई रिसाव का पता लगाया जा सकता है और चैनल प्रवाह निर्बाध है, तो उपकरणों को आगे के प्रयोगों के लिए प्रयोग करने योग्य माना जाता है।

6. डिवाइस सेटअप

  1. 20 एनएम के 2 एमएल के साथ दो 5 एमएल भरें 3% एच2ओ2 फ़िल्टर किया और उन्हें एक सिरिंज पंप पर फिट करें (आवश्यक दूरी के लिए आंदोलन तीर का उपयोग करें, सीरिंज डालें, और उन्हें शीर्ष पट्टी के साथ जगह में ठीक करें)।
    सावधानी! एच2ओ2 को संभालते समय हमेशा सावधान रहें। एक लैब कोट, सुरक्षात्मक रबर के दस्ताने और आंखों की सुरक्षा पहनें।
  2. सिरिंज सुइयों का उपयोग करके सीरिंज के लिए 14 सेमी लंबा 800 माइक्रोन आईडी पीटीएफई टयूबिंग कनेक्ट करें और लुअर कनेक्टर का उपयोग करके डिवाइस के इनलेट्स के लिए।
  3. आउटलेट के लिए 20 सेमी लंबा 200 माइक्रोन आईडी पॉलीथर ईथर कीटोन (तिरछी) टयूबिंग कनेक्ट करें।
  4. तिरछी टयूबिंग के दूसरे छोर को एक अपशिष्ट कंटेनर से कनेक्ट करें। सेटअप चित्रा 3 में देखा जा सकता है.
  5. प्रत्येक इनलेट के लिए 500 माइक्रोन/मिनट की प्रवाह गति पर सिरिंज पंप शुरू करें (साधन स्क्रीन पर: सिरिंज > सिस्टम सेट > सेटिंग्स (निर्माता: चिकित्सा सिरिंज, सिरिंज: 5 एमएल) > पैरामीटर > बैक बटन (चुनें: इन्फ्यूज, रिपीट: 1, वॉल्यूम: 1.5 एमएल, फ्लो: 500 माइक्रोन/मिनट) > बैक बटन > बैक बटन)। एक अपशिष्ट कंटेनर में प्रवाह के माध्यम से लीजिए।
  6. 20 एनएम फ़िल्टर्ड 70% इथेनॉल के 2 एमएल के साथ दो नए 5 एमएल सीरिंज भरें।
  7. इथेनॉल से भरे सीरिंज के साथ पिछले सीरिंज को बदलें और चरण 6.5 में वर्णित समान मापदंडों का उपयोग करके सिरिंज पंप शुरू करें।
  8. नए 5 एमएल सीरिंज का उपयोग करें और उन्हें 20 एनएम फ़िल्टर्ड फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 5 एमएल से भरें।
  9. पीबीएस से भरे सीरिंज के साथ पिछले सीरिंज बदलें और कदम 6.1 दोहरा द्वारा पीबीएस के 4 एमएल के साथ डिवाइस फ्लश. और 6.5।
    नोट: सिस्टम सेटअप पैरामीटर को वॉल्यूम: 4 एमएल (इंस्ट्रूमेंट स्क्रीन पर: सेटिंग्स > पैरामीटर > (चुनें: वॉल्यूम: 4 एमएल) में बदलना सुनिश्चित करें।
  10. डिवाइस से टयूबिंग को अनप्लग करें और प्रत्येक इनलेट और आउटलेट को Luer प्लग के साथ बंद करें।
    नोट: डिवाइस में पीबीएस छोड़ दें और बंद करने से पहले एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके प्रत्येक इनलेट और आउटलेट पर अतिरिक्त पीबीएस जोड़कर किसी भी हवा को फँसाने से बचें।
  11. डिवाइस को रात भर कमरे के तापमान (आरटी) पर एक अंधेरी जगह पर छोड़ दें।
  12. अगले दिन, 20 एनएम फ़िल्टर्ड पीबीएस के 4 एमएल के साथ पीबीएस से भरे डिवाइस फ्लश (जैसा कि चरण 6.8 में वर्णित है)।
  13. एक 2 एमएल प्रोटीन कम बाध्यकारी ट्यूब में दोनों आउटलेट से प्रवाह के माध्यम से के पिछले 1 एमएल लीजिए और डिवाइस द्वारा शुरू की कणों के लिए एक रिक्त के रूप में 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
  14. पीबीएस से भरे सीरिंज निकालें और उन्हें हवा से भरे नए 5 एमएल सीरिंज के साथ बदलें।
  15. 4 एमएल हवा के साथ डिवाइस को शुद्ध करें जब तक कि सभी तरल डिवाइस और टयूबिंग से बाहर न निकल जाएं।

7. मानकीकृत लेटेक्स मोतियों के साथ डिवाइस परीक्षण

  1. 1.0 माइक्रोन पॉलीस्टाइनिन और 0.1 माइक्रोन कार्बोक्जिलेट मोतियों का उपयोग करके एक मानकीकृत मनका नमूना तैयार करें। एक 15 एमएल ट्यूब के लिए, 1.0 माइक्रोन पॉलीस्टायर्न मनका मानकों के 500 माइक्रोन, 0.1 माइक्रोन कार्बोक्जिलेट मनका मानकों के 1 माइक्रोन, और 20 एनएम फ़िल्टर्ड पीबीएस के 9499 माइक्रोन (1.0 और 0.1 माइक्रोन मनका मिश्रण की अंतिम एकाग्रता 5 × 108 मोती / एमएल और 3.6 × 1010 मोती / एमएल सम्मानपूर्वक होगी)।
  2. भंवर 30 एस के लिए मनका नमूना और उपयोग में नहीं होने पर इसे +4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. मानकीकृत मनका मिश्रण के 1.5 एमएल के साथ एक नया 5 एमएल सिरिंज भरें और 20 एनएम फ़िल्टर्ड पीबीएस के 1.5 एमएल के साथ एक और भरें।
  4. पहले से संलग्न सीरिंज निकालें और मनका मिश्रण सिरिंज को पहले इनलेट टयूबिंग और दूसरे इनलेट के लिए दूसरे को संलग्न करें।
  5. अपशिष्ट कंटेनर निकालें और प्रत्येक आउटलेट टयूबिंग के लिए कम से कम पांच 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब तैयार करें।
  6. सिरिंज पंप सिस्टम स्टार्ट-अप पैरामीटर को वॉल्यूम में बदलें: 1 एमएल; प्रवाह: 250 माइक्रोन/मिनट।
    नोट: उपयोगकर्ता की जरूरतों के आधार पर, 250 माइक्रोन/मिनट, 200 माइक्रोन/मिनट, 150 माइक्रोन/मिनट, 100 माइक्रोन/मिनट, और 50 माइक्रोन/मिनट जैसी विभिन्न प्रवाह गति सेट की जा सकती है। वांछित परिणाम के लिए सबसे अनुकूल गति चुनने के लिए एक प्रारंभिक अध्ययन की सिफारिश की जाती है।
  7. सिरिंज पंप शुरू करें और बहिर्वाह इकट्ठा करें - प्रत्येक माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 5 से 6 बूंदें।
    नोट: यदि एक ही डिवाइस का उपयोग कई बार किया जाता है, तो डिवाइस को चरण 6.8 में बताए अनुसार फ्लश करें और सभी कनेक्टर, प्लग और सुई बदलें। कम से कम 30 मिनट के लिए 20 एनएम फ़िल्टर्ड 70% इथेनॉल में उन्हें छोड़कर इस्तेमाल किए गए कनेक्टर्स, प्लग और सुइयों को धो लें। फिर, सभी भागों को 20 एनएम फ़िल्टर्ड विआयनीकृत पानी वाली ट्यूब में ले जाएं, ट्यूब को अच्छी तरह से हिलाएं, और उन्हें 20 एनएम फ़िल्टर्ड विआयनीकृत पानी के 20 एमएल युक्त पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। 100 आरपीएम पर कम से कम 30 मिनट के लिए प्रकार के बरतन पर पेट्री डिश छोड़ दें, तो पुन: उपयोग करने से पहले एक सूखी पेट्री डिश (कम से कम 12 घंटे के लिए) में सूखी करने के लिए बातें छोड़ दें.

8. मूत्र के नमूनों के साथ डिवाइस परीक्षण

  1. डिवाइस को चरण 6.1-6.15 में वर्णित के रूप में तैयार करें।
  2. मूत्र बाँझ कंटेनरों का उपयोग कर दाता प्रति सुबह मूत्र के 100 एमएल लीजिए और संग्रह के 2 घंटे के भीतर प्रसंस्करण के लिए प्रयोगशाला में वितरित.
  3. आरटी पर 15 मिनट के लिए 2'000 x ग्राम पर दो 50 एमएल ट्यूबों और अपकेंद्रित्र में प्रत्येक मूत्र नमूना अलग करें।
  4. सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए और गोली त्यागें.
  5. बड़े कणों और सेल मलबे से छुटकारा पाने के लिए आरटी पर 30 मिनट के लिए 10'000 x ग्राम पर सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र करें।
  6. सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए और गोली त्यागें.
  7. डिवाइस को 6.6 में बताए अनुसार धोएं।
  8. नमूना इनलेट के लिए तैयार मूत्र नमूने से भरे 20 एमएल सिरिंज में 5 एमएल सीरिंज बदलें और बफर इनलेट के लिए 20 एनएम फ़िल्टर्ड डीईपीसी-पीबीएस के 20 एमएल से भरा एक और 20 एमएल सिरिंज। BDPlastipak करने के लिए सिरिंज पंप सेटिंग्स बदलें; सिरिंज: सीसी; मात्रा: 20 एमएल; प्रवाह: 250 माइक्रोन/मिनट (इष्टतम प्रवाह दर), इसी तरह जैसा कि चरण 6.2 में वर्णित है। सिरिंज पंप शुरू करें और अलग-अलग 50 एमएल ट्यूबों में प्रत्येक आउटलेट से प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा करें।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस में 3,000 x ग्राम पर प्रत्येक 100 माइक्रोन के लिए 100,000 आणविक भार कट-ऑफ एकाग्रता ट्यूबों का उपयोग करके अलग से प्रत्येक प्रवाह को ध्यान में रखें।
  10. ध्यान केंद्रित 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  11. भंवर 30 सेकंड के लिए केंद्रित नमूने, तो 10 सेकंड के लिए स्पिन.
  12. प्रति ट्यूब नमूना के 25 माइक्रोन स्थानांतरित करके नमूनों को विभाज्य करें, उन्हें लेबल करें, और दीर्घकालिक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।

9. वातानुकूलित मीडिया के साथ डिवाइस परीक्षण

  1. डिवाइस को चरण 6.1- 6.15 में वर्णित के रूप में तैयार करें।
  2. बाजो-सैंटोस एट अल 20 के अनुसार कुल गिनती 100 मिलियन तक पहुंचने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 आर्द्र वातावरण में संस्कृति कोशिकाओं को 2% बी -27 सीरम स्थानापन्न पूरक और संस्कृति के साथ पूरक सीरम मुक्त मीडिया के 100 एमएल में एक एकल टी 175 निलंबन फ्लास्क के लिए कोशिकाओं को पास करें अतिरिक्त 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ2 आर्द्र वातावरण में।
  3. सेल निलंबन लीजिए और कोशिकाओं से छुटकारा पाने के लिए आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर इसे अपकेंद्रित्र करें।
  4. बड़े कणों और सेल मलबे से छुटकारा पाने के लिए +4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए 3,000 x ग्राम पर फिर से सतह पर तैरनेवाला एकत्र करें और अपकेंद्रित्र करें।
  5. सतह पर तैरनेवाला ले लीजिए और जुदाई जगह ले सकते हैं जब तक + 4 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान, लेकिन 3 घंटे से अधिक नहीं.
  6. नमूना इनलेट के लिए तैयार वातानुकूलित मीडिया से भरे 20 एमएल सीरिंज के साथ 5 एमएल सीरिंज बदलें और बफर इनलेट के लिए 20 एनएम फ़िल्टर्ड पीबीएस के 20 एमएल से भर दें।
  7. चरण 7.8 में वर्णित के रूप में पंप स्टेशन में सेटिंग्स सेट करें।
  8. सिरिंज पंप शुरू करें और एक अलग 50 एमएल ट्यूब में प्रत्येक आउटलेट से प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा करें।
  9. प्रत्येक प्रवाह के माध्यम से अलग से 100,000 आणविक वजन कट-ऑफ एकाग्रता ट्यूबों का उपयोग करके 150 माइक्रोन प्रत्येक पर 3,000 x ग्राम +4 डिग्री सेल्सियस पर ध्यान केंद्रित करें।
  10. ध्यान केंद्रित 0.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  11. भंवर 30 एस के लिए केंद्रित नमूने।
  12. स्पिन 10 एस के लिए केंद्रित नमूने।
  13. प्रति ट्यूब नमूना के 25 माइक्रोन स्थानांतरित करके नमूनों को विभाज्य बनाएं, उन्हें लेबल करें, और उन्हें दीर्घकालिक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।

10. अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके ईवीएस का अलगाव

  1. एक निश्चित कोण रोटर के साथ एक अपकेंद्रित्र का उपयोग करके +4 डिग्री सेल्सियस पर 70 मिनट के लिए 100,000 x ग्राम पर मूत्र या वातानुकूलित सेल मीडिया के 20 एमएल अपकेंद्रित्र।
  2. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 20 एनएम फ़िल्टर्ड पीबीएस के 20 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
  3. अपकेंद्रित्र फिर से, जैसा कि 10.1 में बताया गया है।
  4. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 20 एनएम फ़िल्टर्ड पीबीएस के 12 एमएल में गोली को फिर से निलंबित करें।
  5. स्विंग रोटर का उपयोग करके +4 डिग्री सेल्सियस पर 70 मिनट के लिए 100,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  6. सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    नोट: इस बार सतह पर तैरनेवाला त्यागते समय सावधान रहें। इसे विंदुक के साथ करने की सिफारिश की जाती है।
  7. 20 एनएम फ़िल्टर्ड पीबीएस के 100 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें।
  8. नमूना विभाज्य और EV लक्षण वर्णन के लिए सेट 12 के लिए आगे बढ़ें। अन्यथा, आगे उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

11. आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) का उपयोग करके ईवीएस का अलगाव

  1. 15 मिनट के लिए +4 डिग्री सेल्सियस पर 3,000 x ग्राम पर 100 केडीए आणविक वजन कट-ऑफ (MWCO) केन्द्रापसारक फिल्टर इकाइयों का उपयोग करके मूत्र या वातानुकूलित सेल मीडिया के 20 एमएल को 500 माइक्रोन तक केंद्रित करें।
  2. एसईसी कॉलम (35 एनएम लोड रेंज) पर ध्यान केंद्रित करें।
  3. स्तंभ पर 20 एनएम फ़िल्टर किया पीबीएस डालो और 0.5 एमएल के 15 अंश इकट्ठा.
  4. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए एक गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस) प्रणाली के साथ अंशों का विश्लेषण करें।
  5. चयनित भिन्नों को एक साथ पूल करें। 11 से कम एक क्षीणक के साथ अंश चुनें और कुल कणों का कम से कम 30% 40 एनएम से बड़ा हो।
  6. 15 मिनट के लिए +4 डिग्री सेल्सियस पर 14,000 x ग्राम पर 3 केडीए आणविक वजन कट-ऑफ (MWCO) केन्द्रापसारक फिल्टर इकाइयों का उपयोग करके 100 माइक्रोन तक चयनित अंशों को ध्यान केंद्रित करें।
  7. नमूना को विभाजित करें और ईवी लक्षण वर्णन के लिए धारा 12 पर आगे बढ़ें। अन्यथा, आगे उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

12. ईवी लक्षण वर्णन

  1. फ्रीजर से विशेषता होने के लिए नमूना लें और इसे धीरे-धीरे डीफ्रॉस्ट करें (बर्फ ब्लॉक पर या +4 डिग्री सेल्सियस पर)।
  2. कण आकार वितरण औरराशि 13 निर्धारित करने के लिए नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) करें। नमूनों में ईवी उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए उच्च आत्मीयता टी-सेल झिल्ली प्रोटीन 4 (टीआईएम-4) डबल सैंडविच एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (डीएसएलिसा)14 करें।

13. एनटीए

  1. भंवर 30 एस के लिए पिघला हुआ ईवी नमूना और 10 एस के लिए स्पिन, फिर 2 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 20 एनएम फ़िल्टर्ड पीबीएस के 999 माइक्रोन के लिए 1 माइक्रोन को स्थानांतरित करें ताकि इसे 1000 गुना पतला किया जा सके। कमजोर पड़ने के लिए इस्तेमाल किया अतिरिक्त पीबीएस के 1 एमएल को बचाने के लिए जाँच करें कि यह कोई कणों शामिल है. माप तक +4 डिग्री सेल्सियस पर सब कुछ स्टोर करें।
    नोट: उपयोग करने से पहले 0.02 एनएम फिल्टर के माध्यम से पीबीएस फ़िल्टर करें।
  2. भंवर EV नमूना या 30 s के लिए रिक्त और एक सिरिंज का उपयोग कर मॉड्यूल में डालने. नमूने के लगभग 0.7 एमएल के साथ मॉड्यूल भरें और इसे साधन में रखें।
  3. निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए नैनोपार्टिकल विश्लेषक उपकरण का उपयोग करके नमूने को मापें।

14. ईवी मार्करों के लिए dsELISA

  1. 1 μg/mL TIM4-Fc प्रोटीन का घोल तैयार करें। प्रत्येक आवश्यक अच्छी तरह से समाधान के 100 माइक्रोन को स्थानांतरित करके 96-अच्छी तरह से एलिसा प्लेट के कुओं को कोट करें और 200 आरपीएम पर +4 डिग्री सेल्सियस मिलाते हुए रात भर इनक्यूबेट करें।
  2. अगले दिन, धोने समाधान (1x टीबीएस + 0.05% ट्विन20 + 2 मिमी CaCl2) तैयार करें।
  3. प्रत्येक कुएं में सभी तरल त्यागें। धोने के समाधान के 200 माइक्रोन जोड़कर प्रत्येक अच्छी तरह से धो लें, आरटी पर 5 मिनट के लिए 200 आरपीएम पर मिलाते हुए, और त्यागते हुए। इस चरण को दो बार दोहराएं।
  4. ब्लॉकिंग सॉल्यूशन तैयार करें (1x TBS + 0.05% Tween20 + 1% बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन। प्रत्येक अच्छी तरह से अवरुद्ध समाधान के 200 माइक्रोन जोड़ें और 200 आरपीएम पर मिलाते हुए 1 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं।
  5. चरण 14.3 में वर्णित प्रत्येक अच्छी तरह से धो लें।
  6. धोने बफर में प्रत्येक नमूना कमजोर पड़ने के 220 माइक्रोन तैयार करें (इष्टतम ईवी एकाग्रता 2.7 × 105 ईवीएस / अच्छी तरह से प्रति पतला नमूना के 100 माइक्रोन जोड़ें और दो प्रतिकृतियां करें। 200 आरपीएम पर मिलाते हुए 90 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  7. चरण 14.3 में वर्णित प्रत्येक अच्छी तरह से धो लें।
  8. प्रत्येक अच्छी तरह से इसी एंटीबॉडी के 100 माइक्रोन जोड़ें। ईवीएस और दूषित पदार्थों की पुष्टि के लिए उचित ईवी मार्करों का उपयोग करें4. 200 आरपीएम पर मिलाते हुए 2 घंटे के लिए आरटी पर सेते हैं. नोट: यदि माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, तो चरण 14.7-14.8 दोहराएं। हालांकि, माध्यमिक एंटीबॉडी की इनक्यूबेशन अवधि को 1 घंटे तक कम करें।
  9. चरण 14.3 में वर्णित प्रत्येक अच्छी तरह से धो लें।
  10. प्रत्येक अच्छी तरह से हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज सब्सट्रेट के 100 माइक्रोन जोड़ें, 1 मिन के लिए प्लेट मिलाएं, और 30 मिन के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  11. प्रतिक्रिया को रोकने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 1 एम एच2एसओ4 जोड़ें।
  12. माइक्रोप्लेट रीडर का उपयोग करके, 450 एनएम पर अवशोषण को मापें।

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Representative Results

हमने द्विभाजित ए 4 एफ सिद्धांत(चित्रा 2बी,सी)के आधार पर उच्च थ्रूपुट ईवी पृथक्करण के लिए सॉफ्ट-लिथोग्राफी (चित्रा 2ए) के माध्यम से 3 डी प्रिंटेड डबल नेगेटिव मोल्ड (चित्रा 1) का उपयोग करके एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का निर्माण किया। सेटअप के लिए एक पंप और एक फ्लो-थ्रू स्टेशन की आवश्यकता होती है, जैसा कि चित्र 3 में देखा जा सकता है, स्वचालित तरीके से ईवीएस के अलगाव के लिए। सबसे पहले, उपकरणों की अवधारणा के प्रमाण का मूल्यांकन करने के लिए, 100 एनएम और 1000 एनएम के व्यास के साथ पॉलीस्टाइनिन मोतियों का मिश्रण क्रमशः पुटिकाओं और ठीक सेल मलबे का प्रतिनिधित्व करने के लिए तैयार किया गया था,क्रमशः 10. प्रयोगों मनका मिश्रण के लिए अलग-अलग प्रवाह दरों के साथ आयोजित किए गए थे, दोनों के साथ और बिना विभाजन प्रवाह के, जुदाई दक्षता पर रैखिक वेग के प्रभाव की जांच करने के लिए. सभी प्रयोगों के पार, छोटे मोतियों की वसूली लगातार बनी रही और 90% 10 से ऊपर, ईवीएस को पुनर्प्राप्त करने के लिए डिवाइस की क्षमता दिखा रही है।

फिर, हमने न्यूनतम प्री-प्रोसेसिंग के साथ जटिल बायोफ्लुइड से बड़ी मात्रा (>1 एमएल) से ईवीएस को अलग करने में सीओसी-ओएसटीई डिवाइस की क्षमता का आकलन और तुलना की। जैसे, 10 स्वस्थ दाताओं (चित्रा 4) से मूत्र और दो अलग-अलग प्रोस्टेट सेल लाइनों (चित्रा 5) से सेल मीडिया का उपयोग तीन अलग-अलग प्रक्रियाओं के बाद ईवीएस को एक साथ अलग करने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में किया गया था: अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (यूसी), आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी), और ए 4 एफ माइक्रोफ्लुइडिक्स-आधारित ओएसटीई-सीओसी डिवाइस। अलगाव के बाद, कणों की कुल संख्या और उनके आकार वितरण का मूल्यांकन नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) का उपयोग करके किया गया था। औसतन, ओएसटीई-सीओसी डिवाइस ने यूसी की तुलना में बायोफ्लुइड से बेहतर कुल कण वसूली दिखाई, लेकिन सांख्यिकीय महत्व केवल दोनों बंदरगाहों (चित्रा 4ए)से कण संख्याओं के संयोजन के दौरान हासिल किया गया था। अन्य प्रणालियों के साथ डिवाइस के प्रदर्शन की तुलना करने के लिए, आर एंड एल आउटलेट को एक साथ ध्यान में रखा जाना चाहिए। जैसा कि चित्र 4 में दिखाया गया है, एल एंड आर आउटलेट ईवीएस को पुनर्प्राप्त करने पर एक साथ प्रदर्शन यूसी और एसईसी से बेहतर प्रदर्शन करता है। अलग-अलग, एल-पोर्ट को छोटे ईवी अंश को पकड़ने के लिए डिज़ाइन किया गया था, जबकि आर-पोर्ट को समान आकार के अन्य अणुओं के साथ बड़े ईवी अंश को इकट्ठा करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। दिलचस्प बात यह है कि ओएसटीई-सीओसी डिवाइस के आर-पोर्ट का उपयोग करके वसूली अकेले एसईसी और यूसी (चित्रा 4ए) से थोड़ी अधिक थी। सीडी 63 अभिव्यक्ति ने एक समान पैटर्न दिखाया(चित्रा 4सी)। यह खोज इंगित करती है कि ओएसटीई-सीओसी डिवाइस कुल ईवी रिकवरी में अधिक प्रभावी था। समतुल्य आकार वितरण यूसी को छोड़कर, विभिन्न पद्धतियों के बीच पाया गया था, जो एक बड़ा कण आकार वितरण(चित्रा 4बी)दिखाता है।

सेल मीडिया संस्कृतियों में तुलनीय परिणाम देखे गए। दोनों परिदृश्यों में, दोनों डिवाइस बंदरगाहों से कुल कण वसूली एसईसी या यूसी पद्धतियों ( चित्रा 5 ए, बी में दर्शाया गया है) की तुलना में बेहतर प्रदर्शन का प्रदर्शन किया। विशेष रूप से, पीसी 3 कोशिकाओं से प्राप्त ईवीएस ने एल-पोर्ट वितरण में अधिक एकरूपता के साथ एक अलग आकार वितरण का प्रदर्शन किया, जब अन्य प्रयोगात्मक समूहों (चित्रा 5 सी, डी) के साथ तुलना की गई। इसके अलावा, सीडी 63 अभिव्यक्ति के विश्लेषण ने सीओसी-ओएसटीई डिवाइस ( जैसा कि चित्रा 5ई, एफ में सचित्र है) का उपयोग करके प्राप्त उच्च ईवी रिकवरी दरों की पुष्टि की। इस अध्ययन में जांच की गई विभिन्न पद्धतियों की अलगाव विशेषताओं की तुलना करने वाला सारांश तालिका 1में पाया जा सकता है।

Figure 1
चित्र 1: 3DP सर्पेन्टाइन के आकार का डबल नकारात्मक मोल्ड आयाम और आइसोमेट्रिक दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: सीओसी-ओएसटीई माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस। (ए) ओएसटीई-सीओसी डिवाइस बनाने के विभिन्न मुख्य चरणों की योजना। (बी) डिवाइस काम करने का सिद्धांत। (सी) तैयार डिवाइस की छवि। स्केल बार: 15 मिमी। इस आंकड़े Priedols एट al.10 और Bajo-Santos एट अल 20 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: डिवाइस का प्रायोगिक विन्यास। सिरिंज पंप बाईं ओर है, ओएसटीई-सीओसी डिवाइस बीच में है, और रिकवरी स्टेशन दाईं ओर है। इस आंकड़े Priedols एट al.10 और Bajo-Santos एट अल 20 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन (यूसी), आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी), और सीओसी-ओएसटीई डिवाइस का उपयोग करके 10 दाताओं से मूत्र ईवी आकार वितरण और कण वसूली। (ए) नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) द्वारा प्रत्येक अलगाव विधि से बरामद कण राशि। डेटा को माध्य +/- मानक विचलन के रूप में दर्शाया गया है। सांख्यिकीय महत्व * (पृष्ठ <0.05) द्वारा निरूपित किया गया। (बी) बॉक्सप्लॉट एनटीए द्वारा मूल्यांकन किए गए सभी मूत्र नमूनों के बीच औसत कण आकार वितरण प्रदर्शित करते हैं, जिसमें मूंछें न्यूनतम और अधिकतम मूल्यों को दर्शाती हैं। पी-मान यूसी की तुलना से प्राप्त किए गए थे, **** उच्च सांख्यिकीय महत्व (पी <0.0001) का संकेत देते हैं। (सी) प्रत्येक अलगाव विधि के लिए डबल-सैंडविच एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (डीएसएलिसा) का उपयोग करके मूल्यांकन की गई औसत सीडी 63 राशि की औसत और सीमा की गणना सभी नमूनों में की गई थी। एल-पोर्ट: लेफ्ट पोर्ट; आर-पोर्ट: राइट पोर्ट। इस आंकड़े को बाजो-सैंटोस एट अल.20 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: विभिन्न तरीकों का उपयोग करके पीसी 3 और एलएनसीएपी कोशिकाओं से अलग ईवीएस की विशेषता। (ए) नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण (एनटीए) का उपयोग करके पीसी 3 मीडिया से बरामद कण राशि का मतलब +/- मानक विचलन द्वारा दर्शाया गया है। (बी) एनटीए का उपयोग करके एलएनसीएपी सेल मीडिया से बरामद कण राशि को माध्य +/- मानक विचलन के रूप में दर्शाया गया है। (सी) पीसी 3 संस्कृतियों से ईवीएस का औसत कण आकार वितरण, रेंज के साथ, एनटीए द्वारा निर्धारित किया गया था। (डी) रेंज के साथ एलएनसीएपी संस्कृतियों से अलग ईवीएस का औसत आकार वितरण। (ई) डबल-सैंडविच एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (डीएसएलिसा) का उपयोग करके पीसी 3 सेल लाइन-व्युत्पन्न ईवी के लिए प्रत्येक अलगाव विधि के लिए सीडी 63 अभिव्यक्ति की औसत और सीमा। (एफ) प्रत्येक अलगाव विधि के लिए डीएसलिसा द्वारा एलएनसीएपी-व्युत्पन्न ईवी सीडी 63 अभिव्यक्ति की माध्यिका और सीमा। यूसी: अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन; एसईसी: आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी; एल-पोर्ट: लेफ्ट पोर्ट; आर-पोर्ट: राइट पोर्ट। इस आंकड़े को बाजो-सैंटोस एट अल.20 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

यूसी सेकण्ड सीओसी-ओएसटीई
प्रसंस्करण समय/नमूना ++/+++ +++ +
थ्रूपुट ++ + +++
लागत/नमूना + +++ ++
पवित्रता + +++ ++
स्वचालितीकरण ++ + +++
ईवी यील्ड ++ ++ +++
आकार चयन + ++ ++

तालिका 1. तीन तरीकों यूसी एसईसी और सीओसी-ओएसटीई डिवाइस के साथ ईवीएस की अलगाव विशेषताओं की तुलना। यूसी: अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन; एसईसी: आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी। COC-OSTE: चक्रीय ओलेफिन कॉपोलीमर-ऑफ-स्टोइकोमेट्री थिओल-एन। +: कम; ++: मध्यम; +++: उच्च। * डिवाइस निर्भर।

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Discussion

प्रस्तुत माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस जैविक तरल पदार्थ से ईवीएस के अलगाव और निष्कर्षण के लिए एक आशाजनक विधि प्रदान करता है, जो यूसी और एसईसी12 जैसे मौजूदा स्वर्ण मानक तरीकों की कुछ महत्वपूर्ण सीमाओं को संबोधित करता है। यूसी और एसईसी श्रम-गहन, समय लेने वाली और कम उपज से पीड़ित होने के लिए जाने जाते हैं, जिससे उन्हें उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों के लिए कम उपयुक्त बना दिया जाता है जहां बड़ी मात्रा में ईवीएस 21,22की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, वर्णित माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस लगातार न्यूनतम उपयोगकर्ता इनपुट के साथ जैविक तरल पदार्थ के 20 एमएल तक की पर्याप्त मात्रा को संसाधित कर सकता है, जिससे यह औद्योगिक या नैदानिक सेटिंग्स के लिए संभावित गेम-चेंजर बन जाता है। इस माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस के प्रमुख लाभों में से एक इसकी ईवी अलगाव को मानकीकृत करने और पारंपरिक तरीकों की तुलना में प्रजनन क्षमता में सुधार करने की क्षमता है जिसमें मैनुअल कदम शामिल हैं। बड़े पैमाने पर निर्माण के माध्यम से ईवी आइसोलेशन डिवाइस निर्माण की परिवर्तनशीलता को कम करके, डिवाइस के प्रदर्शन को बेहतर नियंत्रित और सुसंगत किया जा सकता है, जो ईवी-आधारित चिकित्सीय और निदान जैसे अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, उपयुक्त सब्सट्रेट की प्रतिक्रिया इंजेक्शन मोल्डिंग के माध्यम से बड़ी मात्रा में विनिर्माण के साथ डिवाइस की संगतता आगे स्केलेबिलिटी और व्यापक गोद लेने के लिए अपनी क्षमता को बढ़ाती है।

प्रजनन क्षमता और लगातार प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए, एक व्यापक और अच्छी तरह से परिभाषित प्रोटोकॉल आवश्यक है, दोनों चिप का उत्पादन करने के लिए और प्रयोगों में इसके उपयोग के लिए. चिप को औद्योगिकीकरण को ध्यान में रखकर बनाया गया है। हालांकि, प्रयोगशाला वातावरण में डिवाइस निर्माण के दौरान, बुलबुले के गठन से बचने, सटीक और मजबूत संबंध सुनिश्चित करने, और वास्तविक प्रयोगों में अपेक्षित लोगों की तुलना में उच्च प्रवाह गति पर पूरी तरह से परीक्षण करने के लिए ध्यान दिया जाना चाहिए। यह एहतियात सीओसी-ओएसटीई उपकरणों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि वे असफल बंधन के कारण लीक होने का खतरा हो सकता है, खासकर उच्च प्रवाह दर पर। इसके अतिरिक्त, चूंकि ओएसटीई एक प्रकाश संवेदनशील सामग्री है, इसलिए यूवी के अनावश्यक जोखिम से बचने के लिए डिवाइस निर्माण को पीले प्रकाश में किया जाना चाहिए। चूंकि यह तकनीक अभी भी अपने प्रारंभिक चरण में है, शोधकर्ताओं को अपने विशिष्ट अनुप्रयोग के लिए इष्टतम सेटिंग की पहचान करने के लिए विभिन्न प्रवाह गति के साथ प्रयोग करना चाहिए क्योंकि इस उपन्यास पद्धति के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल अभी तक स्थापित नहीं किए गए हैं, और तरल चिपचिपाहट स्पष्ट रूप से ईवी अलगाव प्रभावकारिता को प्रभावित कर सकती है हमारे परिणामों के आधार पर। इन दिशानिर्देशों का पालन करके और मानकीकरण की चुनौतियों का समाधान करके, ईवी अलगाव के लिए इस माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस की क्षमता को विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों और अनुप्रयोगों में पूरी तरह से महसूस किया जा सकता है।

माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग करके ईवी अलगाव की विधि प्रदर्शन को अनुकूलित करने के लिए व्यापक संशोधन और समस्या निवारण की अनुमति देती है। कण पृथक्करण में सुधार करने के लिए, शोधकर्ता लंबे चैनलों, विभिन्न झिल्ली छिद्रों और छिद्र घनत्व और परिवर्तित आयामों का पता लगा सकते हैं। यदि छोटे कण आउटलेट में बहुत सारे बड़े कण हैं, तो उच्च बफर इनलेट गति का परीक्षण करना फायदेमंद हो सकता है, जबकि यदि बड़े कण आउटलेट में कई छोटे कण हैं, तो लंबे चैनल या बड़े छिद्रों वाली झिल्ली के साथ प्रयोग करने की सिफारिश की जाती है। कण अवशोषण को संबोधित करने में प्रवाह की गति, सतह संशोधनों और ओएसटीई संरचना को समायोजित करना या यूवी एक्सपोजर समय को बदलना शामिल हो सकता है। अस्थिरता और रिसाव का अनुभव करने वाले उपकरणों के लिए, प्रवाह की गति कम करना और उचित ग्लूइंग सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण कदम हैं। ईवी क्षति को कम करने के लिए, शोधकर्ता प्रवाह की गति को कम कर सकते हैं, डिवाइस नसबंदी के बाद पीबीएस के साथ अधिक अच्छी तरह से धो सकते हैं, और छोटे झिल्ली छिद्रों या वैकल्पिक मोल्ड डिजाइन तकनीकों और सामग्रियों का उपयोग करने पर विचार कर सकते हैं। इन समायोजनों के माध्यम से, माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस को ठीक किया जा सकता है, ईवी अनुसंधान और संबंधित क्षेत्रों में विविध अनुप्रयोगों के लिए इसकी क्षमता को उजागर किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, डिवाइस के प्रदर्शन को अनुकूलित करने के लिए, घनत्व और चिपचिपाहट माप सहित अपस्ट्रीम नमूना लक्षण वर्णन, प्रवाह मापदंडों को समायोजित करने के लिए शामिल किया जा सकता है। इसके अलावा, विशेष जोर नमूना की प्रकृति में रखा जाना चाहिए, biofluids23 की स्थापित गैर बाँझपन को देखते हुए. नतीजतन, नैदानिक अनुप्रयोगों में उनके प्रशासन से पहले नमूनों की नसबंदी पर विधिवत विचार किया जाना चाहिए।

इन चुनौतियों के बावजूद, माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में अपार क्षमता रखता है। अत्यधिक विषम नमूनों की बड़ी मात्रा से ईवीएस को लगातार अलग करने की इसकी क्षमता स्वचालन के लिए द्वार खोलती है, उच्च-थ्रूपुट अनुप्रयोगों की सुविधा प्रदान करती है और विभिन्न स्रोतों से ईवीएस के अधिक गहन विश्लेषण को सक्षम करती है। इस माइक्रोफ्लुइडिक मॉड्यूल को विभिन्न उपकरणों में एकीकृत करना, जैसे कि खोखले फाइबर सेल बायोरिएक्टर कारतूस या उच्च-रिज़ॉल्यूशन फ्लो साइटोमीटर, ईवी अनुप्रयोगों को अधिक उद्योग के अनुकूल बना सकते हैं और दवा वितरण, निदान और सौंदर्य प्रसाधन जैसे क्षेत्रों में नवाचार कर सकतेहैं। कुल मिलाकर, यह माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस ईवी अनुसंधान के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है, जो अनुसंधान और औद्योगिक सेटिंग्स की एक विस्तृत श्रृंखला में आशाजनक अनुप्रयोगों के साथ ईवी अलगाव के लिए एक कुशल और मानकीकृत विधि प्रदान करता है।

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Disclosures

ए.ए., जीएम, और आरआर सेलबॉक्स लैब्स, एलएलसी में संस्थापक, बोर्ड के सदस्य और इक्विटी धारक हैं

Acknowledgments

हम इस अध्ययन में भाग लेने वाले सभी दाताओं, नमूने प्रदान करने के लिए लातवियाई जीनोम डेटाबेस के कर्मचारियों को धन्यवाद देते हैं। इंस्टीट्यूट ऑफ सॉलिड-स्टेट फिजिक्स, लातविया विश्वविद्यालय उत्कृष्टता केंद्र के रूप में अनुदान समझौते संख्या 739508, परियोजना CAMART2 के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 फ्रेमवर्क कार्यक्रम H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 से धन प्राप्त किया है। इस काम को लातवियाई काउंसिल ऑफ साइंस प्रोजेक्ट नं। lzp-2019/1-0142 और प्रोजेक्ट नंबर: lzp-2022/1-0373।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1 µm carboxylate FluoSpheres Invitrogen #F8803 Stock concentration: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT dependent)
0.5 mL microcentrifuge tubes Starstedt 72.704
1 mL Luer cone syringe single use without needle RAYS TUB1ML
1.0 µm polystyrene FluoSpheres Invitrogen #F13083 Stock concentration: 1 x 1010 beads/mL (LOT dependent)
10 mL Serological pipettes Sarstedt 86.1254.001
15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filters Merck Millipore UFC910024
2.0 mL Protein LoBind tubes Eppendorf 30108132
20 mL syringes BD PlastikPak 10569215
250 µm ID polyether ether ketone tubing Darwin Microfluidics CIL-1581
3 kDa MWCO centrifugal filter units Merck Millipore, UFC200324
5 mL Medical Syringe without Needle Anhui Hongyu Wuzhou Medical 159646
50 mL conical tubes Sarstedt 62.547.254
70 Ti fixed angle ultracentrifuge rotor Beckman Coulter 337922
800 µm ID polytetrafluoroethylene tubing Darwin Microfluidics LVF-KTU-15
96 well microplate, f-bottom, med. binding Greiner Bio-One 655001 ELISA plate
B-27 Supplement (50x), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044
Bovine serum albumin SigmaAldrich A7906-100G
COC Topas microscopy slide platform Microfluidic Chipshop 10000002
COC Topas microscopy slide platform 2 x 16 Mini Luer  Microfluidic Chipshop 10000387
Elveflow OB1 pressure controller Elvesys Group
Luer connectors Darwin Microfluidics  CS-10000095
Mask aligner Suss MA/BA6 SUSS MicroTec Group
Mixer Thinky ARE-250 Thinky Corporation
NanoSight NS300 Malvern Panalytical NS300 nanoparticle analyzer 
Optical microscope Nikon Eclipse LV150N Nikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal Clear Mercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg free. Fisher Bioreagents. 100 g Fisher Scientific BP2944-100
PC membrane (50 nm pore diameter, 11.8% density) it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium
Petri dishes, sterile Sarstedt 82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 M PVA TePla America, LLC
qEVoriginal/35 nm column Izon SP5 SEC column
QSIL 216 Silicone Elastomer Kit PP&S
Resin Tough Black Zortrax
SW40 Ti swing ultracentrifuge rotor Beckman Coulter 331301
Syringe pump DK Infusetek ISPLab002
T175 suspension flask Sarstedt 83.3912.502
TIM4-Fc protein Adipogen LifeSciences AG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) SigmaAldrich T0440-100ML Horseradish peroxidase substrate
Tween20 SigmaAldrich P1379-100ML
Ultracentrifuge Optima L100XP Beckman Coulter
Ultrasonic cleaning unit P 60 H Elma Schmidbauer GmbH
Universal Microplate Spectrophotometer Bio-Tek instruments 71777-1
Urine collection cup, 150mL, sterile APTACA 2120_SG
Whatman Anotop 25 Syringe Filter SigmaAldrich 68092002
Zetasizer Nano ZS Malvern Panalytical dynamic light scattering (DLS) system 
Zortrax Inkspire Zortrax

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References

  1. Colombo, M., et al. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  2. Tricarico, C., et al. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
  3. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066 (2015).
  4. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  5. Wang, Z. Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances. Biomed Pharmacother. 153, 113480 (2022).
  6. Royo, F., et al. Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee. Cells. 9 (9), 1955 (2020).
  7. Sidhom, K., et al. A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option. Int J Mol Sci. 21 (18), 6466 (2020).
  8. Reshi, Q. U. A., et al. Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns. Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).
  9. Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. J Chromatogr A. 1636, 461773 (2021).
  10. Priedols, M., et al. Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation. Polymers. 15 (4), 789 (2023).
  11. Zhang, H., Lyden, D. Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization. Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).
  12. Talebjedi, B., et al. Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment. Front Vet Sci. 7, 620809 (2020).
  13. van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).
  14. Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
  15. Bussooa, A., et al. Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices. Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198 (2022).
  16. Tang, L., Lee, N. Y. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).
  17. Borda, E., et al. Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets. Biomaterials. 293, 121979 (2023).
  18. Sandström, N., et al. Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002 (2015).
  19. Sticker, D., et al. Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).
  20. Bajo-Santos, C., et al. Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device. Int J Mol Sci. 24 (9), 7971 (2023).
  21. Claridge, B., et al. Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities. Front Cell Dev Biol. 9, 734720 (2021).
  22. Rezaie, J., et al. Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges. Cell Commun Signal. 20 (1), 145 (2022).
  23. Aragón, I. M., et al. The urinary tract microbiome in health and disease. Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).

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Priedols, M., Paidere, G., Kaukis, P., Bajo-Santos, C., Spule, A., Miscenko, A., Mozolevskis, G., Rimsa, R., Abols, A. Single Step Isolation of Extracellular Vesicles from Large-Volume Samples with a Bifurcated A4F Microfluidic Device. J. Vis. Exp. (204), e66019, doi:10.3791/66019 (2024).

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