Summary
Ekstracellulære vesikler holder enormt løfte om biomedisinske applikasjoner, men dagens isolasjonsmetoder er tidkrevende og upraktiske for klinisk bruk. I denne studien presenterer vi en mikrofluidisk enhet som muliggjør direkte isolering av ekstracellulære vesikler fra store mengder biofluider på en kontinuerlig måte med minimale trinn.
Abstract
Ekstracellulære vesikler (EV) har et enormt potensial for ulike biomedisinske applikasjoner, inkludert diagnostikk, legemiddellevering og regenerativ medisin. Likevel gir dagens metoder for å isolere elbiler betydelige utfordringer, som kompleksitet, tidsforbruk og behovet for klumpete utstyr, noe som hindrer deres kliniske oversettelse. For å møte disse begrensningene hadde vi som mål å utvikle et innovativt mikrofluidisk system basert på syklisk olefinkopolymer-off-støkiometri-tiol-en (COC-OSTE) for effektiv isolering av elbiler fra store volumprøver på en kontinuerlig måte. Ved å utnytte størrelses- og oppdriftsbasert separasjon oppnådde teknologien som ble brukt i denne studien en betydelig smalere størrelsesfordeling sammenlignet med eksisterende tilnærminger fra urin- og cellemedieprøver, noe som muliggjorde målretting av spesifikke EV-størrelsesfraksjoner i fremtidige applikasjoner. Vår innovative COC-OSTE mikrofluidiske enhetsdesign, som bruker todelt asymmetrisk strømningsfelt-fraksjoneringsteknologi, tilbyr en enkel og kontinuerlig EV-isolasjonstilnærming for store volumprøver. Videre gir potensialet for masseproduksjon av denne mikrofluidiske enheten skalerbarhet og konsistens, noe som gjør det mulig å integrere EV-isolasjon i rutinemessig klinisk diagnostikk og industrielle prosesser, der høy konsistens og gjennomstrømning er viktige krav.
Introduction
Ekstracellulære vesikler (EV) er celleavledede membranbundne partikler som omfatter to hovedtyper: eksosomer (30-200 nm) og mikrovesikler (200-1000 nm)1. Eksosomer dannes gjennom innadvendt spiring av endosomalmembranen i en multivesikulær kropp (MVB), og frigjør intraluminale vesikler (ILV) i det ekstracellulære rommet ved fusjon med plasmamembranen1. I motsetning til dette genereres mikrovesikler ved utadgående spiring og fisjon av cellemembranen2. EV spiller en avgjørende rolle i intercellulær kommunikasjon ved å transportere proteiner, nukleinsyrer, lipider og metabolitter, som reflekterer cellens fysiologiske tilstand, inkludert vekst, angiogenese, metastase, proliferasjon og terapiresistens3. Som et resultat har de dukket opp som lovende biomarkører og terapeutiske mål for sykdommer, inkludert kreft, og fremhever potensialet i diagnostikk og legemiddelleveringssystemer4.
For å utnytte elbiler fullt ut i sykdomsdiagnostikk og terapi, er effektiv isolering fra ulike biofluider avgjørende5. Vanlige metoder inkluderer ultrasentrifugering (UC), sentrifugering av tetthetsgradient, størrelseseksklusjonskromatografi (SEC), filtrering og immunisolasjon6. UC er en mye brukt teknikk, men kan gi partikler med tilsvarende tetthet som ikke er EV og kan generere EV-aggregater7. SEC har vunnet popularitet på grunn av sin evne til å gi prøver med høyere renhet ved å ekskludere partikler basert på størrelse i stedet for tetthet8. Imidlertid er nøye valg av passende porestørrelse for SEC-kolonnen og optimalisering av kromatografiforhold avgjørende for å minimere samisolering av uønskede partikler som kylomikroner og lipoproteiner med lav tetthet8. Til tross for effektiviteten er begge metodene tidkrevende og utfordrende å automatisere, spesielt for større volumprøver som cellemedier eller urin, noe som begrenser skalerbarheten for industrielle applikasjoner9.
I de senere år har asymmetrisk feltfeltfraksjonering (A4F) utviklet seg som en kraftig separasjonsteknikk for størrelse og oppdriftsbasert mikro- og nanometerstørrelse partikkelseparasjon10. Operasjonsprinsippet til A4F er avhengig av en mikrofluidisk kanal utstyrt med en porøs membran ved basen, og genererer en kraft som utøves mot membranen kalt kryssstrøm10. Når det kombineres med brownsk bevegelse og Poiseuille-strømning som er iboende i systemet, muliggjør kryssstrøm effektiv partikkelseparasjon på grunn av varierende partikkelposisjon i strømningsdynamikken11. Til tross for fordelene er denne metoden begrenset til prøvevolumer innenfor mikroliterområdet12 og krever et ekstra fokuseringstrinn, noe som forlenger varigheten av prosessen10.
I løpet av det siste tiåret har mikrofluidikk blitt fremtredende som et verktøy for rask, effektiv og klinisk pålitelig EV-separasjon13. Imidlertid er de fleste mikrofluidiske metoder designet for EV-separasjon optimalisert for små volum, høykonsentrerte EV-prøver eller avhenger av komplekse separasjonsprosedyrer14. Videre, innen mikrofluidikk, er polydimetylsiloksan (PDMS) anerkjent som det gyldne standardmaterialet på grunn av dets optiske gjennomsiktighet, biokompatibilitet og brukervennlighet15. Likevel kan dens kjente tilbøyelighet til å absorbere små lipofile molekyler, inkludert EV, være problematisk for anvendelsen i EV-feltet13.
Syklisk olefinkopolymer (COC) er et hyppig brukt materiale i mikrofluidikk på grunn av biokompatibilitet, liten absorpsjon av molekyler og høy kjemisk resistens15. Imidlertid involverer fabrikasjon av COC-enheter ofte komplekse prosesser eller spesialutstyr16. Alternativt er off-støkiometri tiol-en (OSTE) et lovende alternativ til PDMS på grunn av redusert absorpsjon av små molekyler, overlegen kjemisk stabilitet, enkel fabrikasjon og skalerbar fabrikasjonsprosess17,18. På grunn av komplekse tilkoblinger til slanger kan enheter imidlertid være utsatt for lekkasje19.
Målet med denne studien var å konstruere og fremstille en mikrofluidisk enhet som kombinerer OSTE og COC og bifurcated A4F-prinsippet for EV-separasjon fra store volumprøver som urin eller cellemedier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prøvetakingen ble godkjent av Latvian University Life and Medical Science Research Ethics Committee (vedtak N0-71-35/54)
MERK: Materialene som brukes i denne studien er inkludert i materialfortegnelsen .
1. Tredimensjonal (3D) trykt formfabrikasjon
- Design en serpentinformet dobbel negativ form i CAD-programvare med følgende dimensjoner for toppkanalen: høyde på 0,5 mm, bredde på 1 mm og lengde på 210 mm. For bunnkanalen, bruk samme design med en bredde på 1,5 mm, høyde på 0,6 mm og lengde på 210 mm. Dimensjoner som formbredde, lengde, høyde og designisometrisk illustrasjon er vist i figur 1. Lagre utformingen som .stl-fil.
- Forbered filen i Z-Suite; Ingen støtte trenger å legges til. Skriv ut formene med en ultrafiolett flytende krystallskjerm (UV LCD) 3D-skriver med tøff svart harpiks.
- Etter utskrift, fjern formene forsiktig fra skriveroverflaten. Vask formene i isopropanol (IPA) i sonikering i 20 minutter.
- Føn formene med N2.
- Utsett formene for flomeksponering ved hjelp av et ND33-filter i 810 s, og plasser dem deretter i en ovn ved 60 °C i 48 timer.
2. Klargjøring av PDMS-formene
- Vekt PDMS i forholdet 10: 1 w / w (for hver form, bruk 16 g elastomerbase og 1,6 g tverrbindingsmiddel). Bland komponentene i en planetarisk sentrifugalblander, bland i 1 min ved 500 RPM.
- Støp de blandede PDM-ene inn i 3D-printede former og degaer i en vakuumtørker ved -800 mbar i 30 minutter eller til ingen bobler blir observert.
- Legg forsiktig en 100 μm tykk polyvinylkloridforing på toppen av flytende PDMS.
MERK: Påfør foringen sakte fra den ene siden til den andre for å unngå bobledannelse. - Sett formen med PDMS inn i en Mold-in-Place-jigg og stram jiggen ved å bruke en momentnøkkel satt til 0,3 Nm.
- Sett jiggen i en ovn på 60 °C i 3 timer for å herde PDMS.
- Demonter jiggen med en sekskantnøkkel og fjern den 3D-printede formen fra jiggen.
- Fjern forsiktig PDMS-former fra de 3D-printede hovedformene, løp rundt kantene på formen med en skalpell, og fjern deretter formen med pinsett.
MERK: For enklere muggfjerning kan IPA brukes; Formene må imidlertid varmes opp ved 60 °C i 10 minutter etterpå for å fordampe overflødig IPA.
3. Klargjøring av OSTE-COC toppkanal
- Vekt OSTE ved forholdet 1,09:1 w/w (for 5 enheter er det nødvendig med 1,56 g A-del og 1,44 g B-del). Bland komponentene i en planetarisk sentrifugalblander: bland i 5 minutter ved 750 RPM, deretter degas i 5 minutter ved 750 RPM.
- Overfør blandet OSTE til et sentrifugerør og degas ved -800 mbar i vakuumtørker i 30 minutter.
- Rengjør COC-lysbilder med 2 x 16 mini Luer-kontakter ved sonikering i IPA i 10 minutter. Tørk lysbildene forsiktig med N2.
- Plasser de rene COC-lysbildene i plasmaasken slik at den flate overflaten plasseres oppover, og behandle overflaten med 800 SCCM oksygenplasma i 2 minutter ved 700 W effekt med 0,133 mbar trykk.
- Plasser det oksiderte COC-lysbildet på PDMS-formen for toppkanalen slik at den behandlede overflaten er i kontakt med den strukturerte overflaten av PDMS. Plasser forsamlingen i en Mold-in-Place-jigg, og stram jiggen med en momentnøkkel satt til 0,3 Nm.
- Koble trykksystemet til trykkluftledningen ved 6 bar. Ta sentrifugerøret med avgasset OSTE og monter det i henhold til trykksysteminstruksjonene ved hjelp av polytetrafluoretylen (PTFE) slange med 0,8 mm indre diameter (ID).
- Koble PTFE-røret til innløpet til PDMS-formen, og fyll enheten ved hjelp av 1000 mbar trykk opprettholdt av en piezoelektrisk pumpe plassert i trykksystemet. Plasser jiggen med glasssiden opp i maskereguleringen og eksponer med 850 mJ dose ved bruk av ND33-filter.
- Etter eksponering, demonter jiggen med en sekskantnøkkel og fjern COC-lysbildet forsiktig med det strukturerte OSTE-laget fra PDMS-formen.
- Ta den strukturerte OSTE i kontakt med en 25 mm x 75 mm membran med 50 nm porer og 11,8% poretetthet slik at kanalene er helt dekket med membranen.
MERK: Det er spesielt viktig å holde membranen så rett som mulig under påføringsprosessen. - Plasser enheten på en kokeplate satt til 60 ° C med membransiden opp, plasser et rent glassglass på toppen av membranen, og påfør et trykk på 1,6 kPa fra toppen for å sikre jevn liming. Varm opp forsamlingen over natten.
MERK: Etter dette trinnet er det spesielt viktig å evaluere bindingsytelsen og kanaldeformasjonen.
4. Klargjøring av OSTE-COC bunnkanal og enhetsenhet
- Bland OSTE i forholdet 1,09:1 w/w (for 5 enheter er det nødvendig med 1,56 g A-del og 1,44 g B-del). Bland komponentene i en planetarisk sentrifugalblander: bland i 5 minutter ved 750 RPM, deretter degas i 5 minutter ved 750 RPM.
- Overfør blandet OSTE til et falkrør og degaer ved -800 mbar i vakuumtørker i 30 minutter.
- Rengjør COC lysbilder ved sonikering i IPA i 10 minutter. Tørk lysbildene forsiktig med N2.
- Plasser de rene COC-glidningene i plasmaaske og behandle overflaten med 800 SCCM oksygenplasma i 2 minutter ved 700 W effekt med 0,133 mbar trykk.
- Plasser det oksiderte COC-lysbildet på PDMS-formen for bunnkanalen slik at den behandlede overflaten er i kontakt med den strukturerte overflaten av PDMS. Plasser forsamlingen i en Mold-in-Place-jigg, og stram jiggen med en momentnøkkel satt til 0,3 Nm.
- Ta falkrøret med avgasset OSTE og monter det i henhold til trykksysteminstruksjonene ved bruk av PTFE-slange med 0,8 mm ID.
- Koble PTFE-røret til innløpet til PDMS-formen og fyll enheten med 1000 mbar trykk. Plasser jiggen med glasssiden opp i maskeregulering og eksponer med 1100 mJ dose ved bruk av ND33-filter.
- Etter eksponering, demonter jiggen med en sekskantnøkkel og fjern COC-lysbildet forsiktig med det strukturerte OSTE-laget fra PDMS-formen.
- Kombiner det strukturerte OSTE-laget med toppkanalenheten slik at utformingen av topp- og bunnlaget er på linje med hverandre og at OSTE-bunnlaget er i kontakt med membranen.
- Sett designet inn i en Mold-in-Place-jigg, og bruk et trykk på enheten på 1,6 kPa ved hjelp av bulldogklips. Sett jiggen i en 60 °C ovn over natten.
MERK: Ujevn plassering av klippene kan føre til ujevn binding.
5. Evaluering av enheter
- Etter liming, vurder enhetene visuelt med et mikroskop for visuelle defekter, for eksempel deformasjon av kanalen eller mislykket binding.
- Test enhetene uten feil ved å føre 0,02 μm filtrert avionisert vann gjennom kanalene med 30 mbar trykk. Vær oppmerksom på strømningskanal- og luerportlekkasjer og vannføring.
MERK: Hvis ingen lekkasje kan oppdages og kanalstrømmen er uavbrutt, anses enheter som brukbare for videre eksperimenter.
6. Oppsett av enhet
- Fyll to 5 ml sprøyter med 2 ml 20 nm filtrert 3% H2O2 og sett dem på en sprøytepumpe (bruk bevegelsespilene for ønsket avstand, sett inn sprøyter og fest dem på plass med toppstangen).
FORSIKTIGHET! Vær alltid forsiktig når du håndterer H2O2. Bruk laboratoriefrakk, beskyttende gummihansker og øyevern. - Koble 14 cm lange 800 μm ID PTFE-slanger til sprøytene ved hjelp av sprøytenålene og til innløpene til enheten ved hjelp av Luer-koblinger.
- Koble 20 cm lange 200 μm ID polyetereterketon (PEEK) rør til uttakene.
- Koble den andre enden av PEEK-slangen til en avfallsbeholder. Oppsettet kan sees i figur 3.
- Start sprøytepumpen med en strømningshastighet på 500 μL/min for hvert inntak (på instrumentskjermen: Innstillinger > Systeminnstilling > sprøyte (produsent: medisinsk sprøyte, sprøyte: 5 ml) > Tilbake-knapp > Parametere (Velg: infuse, Gjenta: 1, Volum: 1,5 ml, Mengde: 500 μL/min) > Tilbake-knapp > Tilbake-knapp ). Samle gjennomstrømningen i en avfallsbeholder.
- Fyll to nye 5 ml sprøyter med 2 ml 20 nm filtrert 70 % etanol.
- Bytt ut de tidligere sprøytene med etanolfylte sprøyter og start sprøytepumpen med de samme parametrene som beskrevet i trinn 6.5.
- Bruk nye 5 ml sprøyter og fyll dem med 5 ml 20 nm filtrert fosfatbufret saltvann (PBS).
- Bytt ut de tidligere sprøytene med PBS-fylte sprøyter og skyll enheten med 4 ml PBS ved å gjenta trinn 6.1. og 6.5.
MERK: Sørg for å endre parametrene for systemoppsett til Volum: 4 ml (på instrumentskjermen: Innstillinger > parametere > (Velg: Volum: 4 ml). - Koble slangen fra enheten og lukk hvert inntak og utløp med Luer-plugger.
MERK: La PBS være i enheten og unngå å fange luft ved å legge til ekstra PBS på hvert inntak og utløp ved hjelp av en mikropipette før du lukker. - La enheten stå over natten på et mørkt sted ved romtemperatur (RT).
- Neste dag skyller du den PBS-fylte enheten med 4 ml 20 nm filtrert PBS (som beskrevet i trinn 6.8).
- Samle de siste 1 ml av gjennomstrømningen fra begge uttakene i et 2 ml protein lavbindende rør og oppbevar ved 4 °C som et emne for partikler introdusert av enheten.
- Fjern de PBS-fylte sprøytene og erstatt dem med nye 5 ml sprøyter fylt med luft.
- Rens enheten med 4 ml luft til all væske har gått ut av enheten og slangen.
7. Enhetstesting med standardiserte latexperler
- Forbered en standardisert dråpeprøve ved bruk av 1,0 μm polystyren og 0,1 μm karboksylatperler. Til et 15 ml rør, tilsett 500 μL av 1,0 μm polystyrenperlestandarder, 1 μL 0,1 μm karboksylatperlestandarder og 9499 μL 20 nm filtrert PBS (endelig konsentrasjon på 1,0 og 0,1 μm perleblanding vil være 5 × 108 perler / ml og 3,6 × 1010 perler / ml respektfullt).
- Virv perleprøven i 30 s og oppbevar den ved +4 °C når den ikke er i bruk.
- Fyll en ny 5 ml sprøyte med 1,5 ml av den standardiserte dråpeblandingen og en annen med 1,5 ml 20 nm filtrert PBS.
- Fjern de tidligere vedlagte sprøytene og fest dråpeblandingssprøyten til det første innløpsslangen og det andre til det andre innløpet.
- Fjern avfallsbeholderen og klargjør minst fem 0,5 ml mikrosentrifugerør for hvert utløpsrør.
- Endre oppstartsparametrene for sprøytepumpesystemet til volum: 1 ml; Mengde: 250 μL/min.
MERK: Avhengig av brukerens behov kan forskjellige strømningshastigheter som 250 μL/min, 200 μL/min, 150 μL/min, 100 μL/min og 50 μL/min stilles inn. En foreløpig studie for å velge den gunstigste hastigheten for ønsket utfall anbefales. - Start sprøytepumpen og samle utstrømningen - 5 til 6 dråper i hvert mikrosentrifugerør.
MERK: Hvis den samme enheten brukes flere ganger, skyller du enheten som beskrevet i trinn 6.8 og bytter alle kontakter, plugger og nåler. Vask de brukte kontaktene, pluggene og nålene ved å la dem stå i 20 nm filtrert 70% etanol i minst 30 minutter. Deretter flytter du alle delene til et rør som inneholder 20 nm filtrert avionisert vann, rist røret grundig og overfør dem til en petriskål som inneholder 20 ml 20 nm filtrert avionisert vann. La petriskålen stå på shakeren i minst 30 min ved 100 o / min, og la deretter tingene tørke i en tørr petriskål (i minst 12 timer) før du bruker den på nytt.
8. Enhetstesting med urinprøver
- Klargjør enheten som beskrevet i trinn 6.1–6.15.
- Samle 100 ml morgenurin per donor ved hjelp av sterile urinbeholdere og lever den til laboratoriet for behandling innen 2 timer etter innsamling.
- Separer hver urinprøve i to 50 ml rør og sentrifuge ved 2'000 x g i 15 minutter ved RT.
- Samle supernatanten og kast pelleten.
- Sentrifuger supernatanten ved 10 000 x g i 30 minutter ved RT for å bli kvitt store partikler og cellerester.
- Samle supernatanten og kast pelleten.
- Vask enheten som beskrevet i 6.6.
- Bytt 5 ml sprøytene til en 20 ml sprøyte fylt med den klargjorte urinprøven for prøveinntaket og en annen 20 ml sprøyte fylt med 20 ml 20 nm filtrert DEPC-PBS for bufferinnløpet. Endre innstillingene for sprøytepumpen til BDPlastipak; Sprøyte: cc; Volum: 20 ml; Mengde: 250 μL/min (optimal strømningshastighet), tilsvarende som beskrevet i trinn 6.2. Start sprøytepumpen og samle gjennomstrømningen fra hvert utløp i separate 50 ml rør.
- Konsentrer hver gjennomstrømning separat ved hjelp av 100 000 molekylvekts cut-off konsentrasjonsrør til 100 μL hver ved 3000 x g i 4 °C.
- Overfør konsentratene til 0,5 ml mikrosentrifugerør.
- Virvel de konsentrerte prøvene i 30 sekunder, og spinn deretter i 10 sekunder.
- Aliquot prøvene ved å overføre 25 μL prøve per tube, merk dem og frys ved -80 °C for langtidslagring.
9. Enhetstesting med betingede medier
- Klargjør enheten som beskrevet i trinn 6.1–6.15.
- Dyrkningsceller i et 5% CO2 fuktet miljø ved 37 ° C til det totale antallet når 100 millioner i henhold til Bajo-Santos et al.20 Pass cellene til en enkelt T175 suspensjonskolbe i 100 ml serumfrie medier supplert med 2% B-27 serumerstatningstilskudd og kultur i et 5% CO2 fuktet miljø ved 37 ° C i ytterligere 48 timer.
- Samle cellesuspensjonen og sentrifuge den ved 300 x g i 5 minutter ved RT for å kvitte seg med celler.
- Samle opp og sentrifuger supernatanten igjen ved 3000 x g i 30 minutter ved +4 °C for å bli kvitt store partikler og cellerester.
- Samle supernatanten og oppbevar den ved +4 °C til separasjonen kan finne sted, men ikke lenger enn 3 timer.
- Bytt 5 ml sprøytene med 20 ml sprøyter fylt med det klargjorte betingede mediet for prøveinntaket og fylt med 20 ml 20 nm filtrert PBS for bufferinnløpet.
- Still inn innstillingene på pumpestasjonen som beskrevet i trinn 7.8.
- Start sprøytepumpen og samle gjennomstrømningen fra hvert utløp i et separat 50 ml rør.
- Konsentrer hver gjennomstrømning separat ved hjelp av 100 000 molekylvekts cut-off konsentrasjonsrør til 150 μL hver ved 3000 x g ved +4 °C.
- Overfør konsentratene til 0,5 ml mikrosentrifugerør.
- Vortex konsentrerte prøver i 30 s.
- Spinn konsentrerte prøver i 10 s.
- Aliquot prøvene ved å overføre 25 μL prøve per tube, merk dem og frys dem ved -80 °C for langtidslagring.
10. Isolering av elbiler ved hjelp av ultrasentrifugering
- Sentrifuge 20 ml urin eller kondisjonerte cellemedier ved 100 000 x g i 70 minutter ved +4 °C ved bruk av en sentrifuge med en rotor med fast vinkel.
- Kast supernatanten og resuspender pelleten i 20 ml av 20 nm filtrert PBS.
- Sentrifuge igjen, som forklart i 10.1.
- Kast supernatanten og resuspender pelleten i 12 ml 20 nm filtrert PBS.
- Sentrifuge ved 100 000 x g i 70 minutter ved +4 °C ved bruk av en svingrotor.
- Kast supernatanten.
MERK: Vær forsiktig når du kaster supernatanten denne gangen. Det anbefales å gjøre det med en pipette. - Resuspender pelleten i 100 μL av 20 nm filtrert PBS.
- Aliquot prøven og fortsett til setion 12 for EV karakterisering. Ellers oppbevares ved -80 °C inntil videre bruk.
11. Isolering av elbiler ved bruk av størrelsesekskluderingskromatografi (SEC)
- Konsentrer 20 ml urin eller kondisjonerte cellemedier til 500 μL ved bruk av 100 kDa MWCO (molecular weight cut-off) sentrifugalfilterenheter ved 3000 x g ved +4 °C i 15 minutter.
- Overfør konsentratet til SEC-kolonnen (35 nm belastningsområde).
- Hell 20 nm filtrert PBS på kolonnen og samle 15 fraksjoner på 0,5 ml.
- Analyser fraksjoner med et dynamisk lysspredningssystem (DLS) i henhold til produsentens instruksjoner.
- Slå sammen de valgte fraksjonene. Velg fraksjoner med en demper lavere enn 11 og minst 30% av totale partikler som er større enn 40 nm.
- Konsentrer utvalgte fraksjoner til 100 μL ved bruk av 3 kDa molekylvekt cut-off (MWCO) sentrifugalfilterenheter ved 14 000 x g ved +4 °C i 15 minutter.
- Aliquot prøven og gå videre til § 12 for EV-karakterisering. Ellers oppbevares ved -80 °C inntil videre bruk.
12. EV-karakterisering
- Ta prøven som skal karakteriseres fra fryseren og tin den sakte (på en isblokk eller ved +4 °C).
- Utfør nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) for å bestemme partikkelstørrelsesfordeling og mengde13. Utfør høy affinitet T-cellemembranprotein 4 (TIM-4) dobbel sandwich enzymbundet immunosorbentanalyse (dsELISA)14 for å bekrefte EV-tilstedeværelse i prøvene.
13. NTA
- Vortex den tinte EV-prøven i 30 s og spinn i 10 s, overfør deretter 1 μL til 999 μL av 20 nm filtrert PBS i et 2 ml mikrosentrifugerør for å fortynne det 1000 ganger. Spar 1 ml ekstra PBS som brukes til fortynning for å kontrollere at den ikke inneholder partikler. Oppbevar alt ved +4 °C til måling.
MERK: Filtrer PBS gjennom et 0,02 nm filter før bruk. - Vortex EV-prøven eller blank i 30 s og sett den inn i modulen ved hjelp av en sprøyte. Fyll modulen med ca. 0,7 ml prøve og plasser den i instrumentet.
- Mål prøven ved hjelp av nanopartikkelanalysatorinstrumentet i henhold til produsentens instruksjoner.
14. dsELISA for EV-markører
- Lag en oppløsning av 1 μg / ml TIM4-Fc protein. Belegg brønnene på en 96-brønns ELISA-plate ved å overføre 100 μL oppløsning til hver nødvendig brønn og inkuber over natten ved +4 °C risting ved 200 RPM.
- Neste dag, lag vaskeoppløsning (1x TBS + 0,05% Tween20 + 2 mM CaCl2).
- Kast all væske i hver brønn. Vask hver brønn ved å tilsette 200 μL vaskeoppløsning, rist ved 200 RPM i 5 min ved RT, og kast. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Forbered blokkeringsløsning (1x TBS + 0,05% Tween20 + 1% bovint serumalbumin. Tilsett 200 μL blokkeringsløsning til hver brønn og inkuber ved RT i 1 time mens du rister ved 200 RPM.
- Vask hver brønn som beskrevet i trinn 14.3.
- Forbered 220 μL av hver prøvefortynning i vaskebuffer (optimal EV-konsentrasjon er 2,7 × 105 EV/μL). Tilsett 100 μL av den fortynnede prøven per brønn og utfør to replikater. Inkuber ved RT i 90 min mens du rister ved 200 RPM.
- Vask hver brønn som beskrevet i trinn 14.3.
- Tilsett 100 μL tilsvarende antistoffer mot hver brønn. Bruk riktige EV-markører for å bekrefte elbiler og forurensninger4. Inkuber ved RT i 2 timer mens du rister ved 200 RPM. MERK: Hvis sekundære antistoffer brukes, gjenta trinn 14.7-14.8. Reduser imidlertid inkubasjonsperioden for sekundære antistoffer til 1 time.
- Vask hver brønn som beskrevet i trinn 14.3.
- Tilsett 100 μL pepperrotperoksidasesubstrat til hver brønn, bland platen i 1 min og inkuber ved RT i 30 minutter.
- Tilsett 1 MH 2SO4 til hver brønn for å stoppe reaksjonen.
- Bruk en mikroplateleser til å måle absorbansen ved 450 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi fremstilte en mikrofluidisk enhet ved hjelp av en 3D-trykt dobbel negativ form (figur 1) via myk litografi (figur 2A) for høy gjennomstrømnings EV-separasjon basert på det todelte A4F-prinsippet (figur 2B, C). Oppsettet krever en pumpe og en gjennomstrømningsstasjon, som det fremgår av figur 3, for isolering av elbiler på en automatisert måte. For det første, for å evaluere konseptbeviset for enhetene, ble det utarbeidet en blanding av polystyrenperler med diametre på 100 nm og 1000 nm for å representere vesikler og fincelleavfall, henholdsvis10. Eksperimenter ble utført med varierende strømningshastigheter for dråpeblandingen, både med og uten bifurcating flow, for å undersøke effekten av lineær hastighet på separasjonseffektivitet. På tvers av alle eksperimenter forble utvinningen av små perler konsistent og over 90%10, noe som viser potensialet til enheten for å gjenopprette EV.
Deretter vurderte og sammenlignet vi potensialet til COC-OSTE-enheten ved å isolere elbiler fra store volumer (>1 ml) fra komplekse biofluider med minimal forbehandling. Urin fra 10 friske donorer (figur 4) og cellemedier fra to ulike prostatacellelinjer (figur 5) ble derfor brukt som mal for samtidig isolering av elbiler etter tre ulike prosedyrer: ultrasentrifugering (UC), størrelseseksklusjonskromatografi (SEC) og A4F-mikrofluidikkbasert OSTE-COC-enhet. Etter isolering ble det totale antall partikler og deres størrelsesfordeling vurdert ved hjelp av nanopartikkelsporingsanalyse (NTA). I gjennomsnitt viste OSTE-COC-enheten bedre total partikkelgjenvinning fra biofluider sammenlignet med UC, men den statistiske signifikansen ble bare oppnådd ved kombinasjon av partikkelnumrene fra begge havnene (figur 4A). For å sammenligne enhetens ytelse med andre systemer, bør FoU-uttak sammen tas i betraktning. Som vist i figur 4, overgår L &; R-uttaket sammen ytelsen på gjenvinning av elbiler UC og SEC. Separat ble L-porten designet for å fange den lille EV-fraksjonen, mens R-porten ble designet for å samle den større EV-fraksjonen med andre molekyler av tilsvarende størrelse. Interessant nok var utvinningen ved hjelp av R-PORT på OSTE-COC-enheten litt høyere enn SEC og UC alene (figur 4A). CD63-uttrykk viste et lignende mønster (figur 4C). Dette funnet indikerer at OSTE-COC-enheten var mer effektiv i total EV-gjenoppretting. Det ble funnet ekvivalent størrelsesfordeling mellom de ulike metodene, bortsett fra UC, som viser en større partikkelstørrelsesfordeling (figur 4B).
Sammenlignbare resultater ble observert i cellemediekulturer. I begge scenariene viste den totale partikkelgjenopprettingen fra begge enhetsportene overlegen ytelse sammenlignet med SEC- eller UC-metoder (som vist i figur 5A, B). Spesielt viste EV avledet fra PC3-celler en distinkt størrelsesfordeling, med større homogenitet i L-PORT-fordelingen i motsetning til andre eksperimentelle grupper (figur 5C, D). Videre bekreftet analysen av CD63-uttrykk de høyere EV-utvinningsgradene oppnådd ved bruk av COC-OSTE-enheten (som illustrert i figur 5E, F). En oppsummering av isolasjonskarakteristika ved de ulike metodene som ble undersøkt i denne studien, finnes i tabell 1.
Figur 1: 3DP serpentinformede doble negative formdimensjoner og isometrisk visning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: COC-OSTE mikrofluidisk enhet. (A) Skjema for de forskjellige hovedtrinnene for fremstilling av OSTE-COC-enheten. (B) Enhetens arbeidsprinsipp. (C) Bilde av den ferdige enheten. Skala bar: 15 mm. Denne figuren er modifisert med tillatelse fra Priedols et al.10 og Bajo-Santos et al.20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Eksperimentell konfigurasjon av enheten. Sprøytepumpen er til venstre, OSTE-COC-enheten er i midten, og gjenopprettingsstasjonen er til høyre. Denne figuren er modifisert med tillatelse fra Priedols et al.10 og Bajo-Santos et al.20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Urin EV-størrelsesfordeling og partikkelgjenvinning fra 10 givere ved hjelp av ultrasentrifugering (UC), størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) og COC-OSTE-enheten. (A) Partikkelmengde gjenvunnet fra hver isolasjonsmetode ved nanopartikkelsporingsanalyse (NTA). Data representert som gjennomsnitt +/- standardavvik. Statistisk signifikans betegnet med * (s<0,05). (B) Boxplots viser gjennomsnittlig partikkelstørrelsesfordeling blant alle urinprøver vurdert av NTA, med værhår som indikerer minimums- og maksimumsverdier. P-verdier ble avledet fra sammenligninger med UC, med **** som indikerer høy statistisk signifikans (p<0,0001). (C) Median og rekkevidde av gjennomsnittlig CD63-mengde, vurdert ved hjelp av dobbelsandwich enzymbundet immunosorbentanalyse (dsELISA), for hver isolasjonsmetode, ble beregnet på tvers av alle prøver. L-port: Venstre port; R-port: Høyre port. Denne figuren er modifisert med tillatelse fra Bajo-Santos et al.20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Karakterisering av elbiler isolert fra PC3- og LNCaP-celler ved hjelp av forskjellige metoder. (A) Partikkelmengde gjenvunnet fra PC3-medier ved hjelp av nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) representert ved gjennomsnittlig +/- standardavvik. (B) Partikkelmengde gjenvunnet fra LNCaP-cellemedier ved bruk av NTA representert som gjennomsnittlig +/- standardavvik. (C) Median partikkelstørrelsesfordeling av EV fra PC3-kulturer, sammen med rekkevidden, ble bestemt av NTA. (D) Median størrelsesfordeling av elbiler isolert fra LNCaP-kulturer med rekkevidde. (E) Median og rekkevidde av CD63-ekspresjon for hver isolasjonsmetode for PC3-cellelinjederivert EV, ved bruk av dobbeltsandwich-enzymbundet immunosorbentanalyse (dsELISA). (F) Median og rekkevidde av LNCaP-derivert EV CD63-uttrykk av dsELISA for hver isolasjonsmetode. UC: Ultrasentrifugering; SEC: Størrelse-ekskludering kromatografi; L-port: Venstre port; R-port: Høyre port. Denne figuren er modifisert med tillatelse fra Bajo-Santos et al.20. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| UC | SEK | COC-OSTE | |
| Saksbehandlingstid/utvalg | ++/+++ | +++ | + |
| Gjennomstrømming | ++ | + | +++ |
| Kostnad/utvalg | + | +++ | ++ |
| Renhet | + | +++ | ++ |
| Automatisering | ++ | + | +++ |
| EV Yield | ++ | ++ | +++ |
| Valg av størrelse | + | ++ | ++ |
Tabell 1. Sammenligning av isolasjonsegenskapene til elbiler med de tre metodene UC, SEC og COC-OSTE-enheten. UC: Ultrasentrifugering; SEC: Størrelse-ekskludering kromatografi. COC-OSTE: syklisk olefinkopolymer-off-støkiometri tiol-en. +: lav; ++: middels; +++: Høy. * Avhengig av enheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den presenterte mikrofluidiske enheten tilbyr en lovende metode for isolering og ekstraksjon av EV fra biologiske væsker, og adresserer noen av de kritiske begrensningene i eksisterende gullstandardmetoder som UC og SEC12. UC og SEC er kjent for å være arbeidskrevende, tidkrevende og lider av lav avkastning, noe som gjør dem mindre egnet for applikasjoner med høy gjennomstrømning der det er behov for store mengder elbiler21,22. I motsetning til dette kan den beskrevne mikrofluidiske enheten kontinuerlig behandle et betydelig volum på opptil 20 ml biologisk væske med minimal brukerinngang, noe som gjør den til en potensiell spillveksler for industrielle eller kliniske omgivelser. En av de viktigste fordelene med denne mikrofluidiske enheten er dens evne til å standardisere EV-isolasjon og forbedre reproduserbarheten sammenlignet med tradisjonelle metoder som involverer manuelle trinn. Ved å redusere variasjonen i produksjon av EV-isolasjonsenheter gjennom masseproduksjon, kan enhetens ytelse kontrolleres bedre og konsistent, noe som er avgjørende for applikasjoner som EV-basert terapi og diagnostikk. Videre forbedrer enhetens kompatibilitet med storvolumproduksjon via reaksjonssprøytestøping av egnede substrater ytterligere potensialet for skalerbarhet og bredere adopsjon.
For å sikre reproduserbarhet og konsistent ytelse er det nødvendig med en omfattende og veldefinert protokoll, både for å produsere brikken og for bruk i eksperimenter. Brikken er designet med industrialisering i tankene. Under fremstilling av enheten i laboratoriemiljøet må det imidlertid legges vekt på å unngå dannelse av bobler, sikre presis og robust binding og gjennomføre grundig testing ved høyere strømningshastigheter enn de som forventes i reelle eksperimenter. Denne forholdsregelen er spesielt viktig for COC-OSTE-enheter, da de kan være utsatt for lekkasje på grunn av mislykket binding, spesielt ved høyere strømningshastigheter. I tillegg, siden OSTE er et lysfølsomt materiale, bør enhetens fabrikasjon utføres i gult lys for å unngå unødvendig eksponering for UV. Siden denne teknologien fortsatt er i begynnelsen, bør forskere eksperimentere med forskjellige strømningshastigheter for å identifisere den optimale innstillingen for deres spesifikke applikasjon, siden standardiserte protokoller for denne nye metoden ennå ikke er etablert, og flytende viskositet kan tydelig påvirke EV-isolasjonseffektiviteten basert på resultatene våre. Ved å følge disse retningslinjene og adressere utfordringene ved standardisering, kan potensialet til denne mikrofluidiske enheten for EV-isolasjon realiseres fullt ut på tvers av ulike forskningsområder og applikasjoner.
Metoden for EV-isolasjon ved hjelp av den mikrofluidiske enheten muliggjør omfattende modifikasjon og feilsøking for å optimalisere ytelsen. For å forbedre partikkelseparasjonen kan forskere utforske lengre kanaler, forskjellige membranporøsiteter og poretettheter og endrede dimensjoner. Hvis det er mange store partikler i det lille partikkelutløpet, kan det være gunstig å teste en høyere bufferinnløpshastighet, mens hvis det er mange små partikler i det store partikkelutløpet, anbefales det å eksperimentere med en lengre kanal eller en membran med større porer. Adressering av partikkelabsorpsjon kan innebære justering av strømningshastigheter, overflatemodifikasjoner og OSTE-sammensetning eller endring av UV-eksponeringstiden. For enheter som opplever ustabilitet og lekkasje, er det avgjørende trinn å redusere strømningshastighetene og sikre riktig liming. For å minimere EV-skade kan forskere redusere strømningshastigheter, vaske med PBS grundigere etter enhetssterilisering, og vurdere å bruke mindre membranporer eller alternative formdesignteknikker og materialer. Gjennom disse justeringene kan den mikrofluidiske enheten finjusteres, og frigjøre potensialet for ulike applikasjoner innen EV-forskning og relaterte felt. I tillegg, for å optimalisere enhetens ytelse, kan oppstrøms prøvekarakterisering, inkludert tetthets- og viskositetsmålinger, innlemmes for å justere strømningsparametere. Videre må det legges særlig vekt på prøvens karakter, gitt den påviste ikke-steriliteten til biofluider23. Sterilisering av prøver bør derfor behørig overveies før administrering i kliniske anvendelser.
Til tross for disse utfordringene har den mikrofluidiske enheten et enormt potensial i ulike forskningsområder. Dens evne til kontinuerlig å isolere elbiler fra store mengder svært heterogene prøver åpner døren for automatisering, forenkler applikasjoner med høy gjennomstrømning og muliggjør mer dyptgående analyse av elbiler fra ulike kilder. Integrering av denne mikrofluidiske modulen i forskjellige enheter, for eksempel hulfibercellebioreaktorpatroner eller høyoppløselige strømningscytometre, kan gjøre EV-applikasjoner mer bransjevennlige og drive innovasjon innen felt som legemiddellevering, diagnostikk og kosmetikk4. Samlet sett representerer denne mikrofluidiske enheten et betydelig skritt fremover innen EV-forskning, og tilbyr en effektiv og standardisert metode for EV-isolasjon med lovende applikasjoner i et bredt spekter av forskning og industrielle omgivelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
AA, GM og RR er grunnleggere, styremedlemmer og egenkapitaleiere i Cellbox Labs, LLC
Acknowledgments
Vi takker alle giverne som deltok i denne studien, de ansatte i den latviske genomdatabasen for å gi prøvene. Institute of Solid-State Physics, University of Latvia som Center of Excellence har mottatt finansiering fra EUs Horizon 2020 rammeprogram H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 under tilskuddsavtale nr. 739508, prosjekt CAMART2. Dette arbeidet ble støttet av The Latvian Council of Science Project nr. lzp-2019/1-0142 og prosjektnr: lzp-2022/1-0373.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 µm carboxylate FluoSpheres | Invitrogen | #F8803 | Stock concentration: 3.6 x 1013 beads/mL (LOT dependent) |
| 0.5 mL microcentrifuge tubes | Starstedt | 72.704 | |
| 1 mL Luer cone syringe single use without needle | RAYS | TUB1ML | |
| 1.0 µm polystyrene FluoSpheres | Invitrogen | #F13083 | Stock concentration: 1 x 1010 beads/mL (LOT dependent) |
| 10 mL Serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| 15 mL (100k) Amicon Ultra centrifugal filters | Merck Millipore | UFC910024 | |
| 2.0 mL Protein LoBind tubes | Eppendorf | 30108132 | |
| 20 mL syringes | BD PlastikPak | 10569215 | |
| 250 µm ID polyether ether ketone tubing | Darwin Microfluidics | CIL-1581 | |
| 3 kDa MWCO centrifugal filter units | Merck Millipore, | UFC200324 | |
| 5 mL Medical Syringe without Needle | Anhui Hongyu Wuzhou Medical | 159646 | |
| 50 mL conical tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| 70 Ti fixed angle ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| 800 µm ID polytetrafluoroethylene tubing | Darwin Microfluidics | LVF-KTU-15 | |
| 96 well microplate, f-bottom, med. binding | Greiner Bio-One | 655001 | ELISA plate |
| B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| Bovine serum albumin | SigmaAldrich | A7906-100G | |
| COC Topas microscopy slide platform | Microfluidic Chipshop | 10000002 | |
| COC Topas microscopy slide platform 2 x 16 Mini Luer | Microfluidic Chipshop | 10000387 | |
| Elveflow OB1 pressure controller | Elvesys Group | ||
| Luer connectors | Darwin Microfluidics | CS-10000095 | |
| Mask aligner Suss MA/BA6 | SUSS MicroTec Group | ||
| Mixer Thinky ARE-250 | Thinky Corporation | ||
| NanoSight NS300 | Malvern Panalytical | NS300 | nanoparticle analyzer |
| Optical microscope Nikon Eclipse LV150N | Nikon Metrology NV | ||
| OSTE 322 Crystal Clear | Mercene Labs | ||
| PBS TABLETS.Ca/Mg free. Fisher Bioreagents. 100 g | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| PC membrane (50 nm pore diameter, 11.8% density) | it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgium | ||
| Petri dishes, sterile | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| Plasma Asher GIGAbatch 360 M | PVA TePla America, LLC | ||
| qEVoriginal/35 nm column | Izon | SP5 | SEC column |
| QSIL 216 Silicone Elastomer Kit | PP&S | ||
| Resin Tough Black | Zortrax | ||
| SW40 Ti swing ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | 331301 | |
| Syringe pump | DK Infusetek | ISPLab002 | |
| T175 suspension flask | Sarstedt | 83.3912.502 | |
| TIM4-Fc protein | Adipogen LifeSciences | AG-40B-0180B-3010 | |
| TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) | SigmaAldrich | T0440-100ML | Horseradish peroxidase substrate |
| Tween20 | SigmaAldrich | P1379-100ML | |
| Ultracentrifuge Optima L100XP | Beckman Coulter | ||
| Ultrasonic cleaning unit P 60 H | Elma Schmidbauer GmbH | ||
| Universal Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek instruments | 71777-1 | |
| Urine collection cup, 150mL, sterile | APTACA | 2120_SG | |
| Whatman Anotop 25 Syringe Filter | SigmaAldrich | 68092002 | |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern Panalytical | dynamic light scattering (DLS) system | |
| Zortrax Inkspire | Zortrax |
References
- Colombo, M., et al. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
- Tricarico, C., et al. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
- Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066 (2015).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Wang, Z. Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances. Biomed Pharmacother. 153, 113480 (2022).
- Royo, F., et al. Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee. Cells. 9 (9), 1955 (2020).
- Sidhom, K., et al. A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option. Int J Mol Sci. 21 (18), 6466 (2020).
- Reshi, Q. U. A., et al. Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns. Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).
- Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. J Chromatogr A. 1636, 461773 (2021).
- Priedols, M., et al. Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation. Polymers. 15 (4), 789 (2023).
- Zhang, H., Lyden, D. Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization. Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).
- Talebjedi, B., et al. Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment. Front Vet Sci. 7, 620809 (2020).
- van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).
- Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
- Bussooa, A., et al. Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices. Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198 (2022).
- Tang, L., Lee, N. Y. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).
- Borda, E., et al. Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets. Biomaterials. 293, 121979 (2023).
- Sandström, N., et al. Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002 (2015).
- Sticker, D., et al. Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).
- Bajo-Santos, C., et al. Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device. Int J Mol Sci. 24 (9), 7971 (2023).
- Claridge, B., et al. Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities. Front Cell Dev Biol. 9, 734720 (2021).
- Rezaie, J., et al. Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges. Cell Commun Signal. 20 (1), 145 (2022).
- Aragón, I. M., et al. The urinary tract microbiome in health and disease. Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).
