Summary
Denne protokol skitserer de primære trin for at opnå kimfrie (GF) fiskeembryoner og opretholde dem fra larver indtil ungdomsstadiet, herunder prøveudtagning og påvisning af deres sterile status. Brugen af GF-modeller med infektion er vigtig for at forstå mikrobernes rolle i værtssundheden.
Abstract
Zebrafisk tjener som værdifulde modeller for forskning i vækst, immunitet og tarmmikrobiota på grund af deres genomiske ligheder med pattedyr, gennemsigtige embryoner udviklet i et relativt rent chorionmiljø og ekstremt hurtig udvikling af larver sammenlignet med gnavermodeller. Kimfri (GF) zebrafisk (Danio rerio) er afgørende for evaluering af forurenende toksicitet og etablering af menneskelignende sygdomsmodeller relateret til mikrobielle funktioner. I sammenligning med konventionelt opdrættede (CR) modeller (fisk i almindeligt husdyrhold) giver GF-zebrafisk mulighed for mere nøjagtig manipulation af værtsmikrobiotaen, hvilket hjælper med at bestemme årsagssammenhængen mellem mikroorganismer og værter. Derfor spiller de en afgørende rolle i at fremme vores forståelse af disse forhold. GF zebrafiskmodeller genereres og undersøges dog typisk i de tidlige livsstadier (fra embryoner til larver) på grund af begrænsninger i immunfunktion og næringsabsorption. Denne undersøgelse optimerer generering, vedligeholdelse og identifikation af tidlige GF zebrafiskmodeller uden fodring og med langvarig fodring ved hjælp af GF-mad (såsom Artemia sp., artemia). Gennem hele processen blev daglig prøveudtagning og kultur udført og identificeret gennem flere detektioner, herunder plader og 16S rRNA-sekventering. De aseptiske hastigheds-, overlevelses- og udviklingsindekser for GF-zebrafisk blev registreret for at sikre kvaliteten og kvantiteten af de genererede modeller. Det er vigtigt, at denne undersøgelse giver detaljer om bakteriel isolering og infektionsteknikker for GF-fisk, hvilket muliggør effektiv oprettelse af GF-fiskemodeller fra larver til ungdomsstadier med GF-fødevarestøtte. Ved at anvende disse procedurer i biomedicinsk forskning kan forskere bedre forstå forholdet mellem tarmbakteriefunktioner og værtssundhed.
Introduction
Mikrobiota (dvs. arkæer, bakterier, eukarya og vira) spiller afgørende roller for at opretholde værtssundhed og bidrage til udviklingen af forskellige sygdomme ved at påvirke fysiologiske og patologiske processer gennem symbiotiske interaktioner inden for tarmbarrieren, epiteloverfladen og mucinfunktioner hos individer 1,2,3. Sammensætningen af mikrobiota på tværs af forskellige livsstadier, fra barndom til juvenilitet, voksenalder og aldring, samt dens tilstedeværelse på forskellige steder såsom nares, oral, hud og tarmsteder, er dynamisk formet af forskellige levesteder og miljøer4. Den intestinale mikrobiota i organismer er involveret i næringsabsorption, immunrespons, patogeninvasion, metabolisk regulering osv. 5,6. Undersøgelser af patienter har vist, at forstyrrelser i tarmmikrobiota er relateret til menneskelig fedme, søvnforstyrrelser, depression, inflammatorisk tarmsygdom (IBD), neurodegenerative sygdomme (Parkinsons, Alzheimers), aldring og forskellige kræftformer 7,8,9. Desuden involverer interaktive veje mellem tarmmikrobiota og værter inflammatoriske faktorer, neurotransmittere, metabolitter, tarmbarriere og oxidativt stress, som observeret i tidligere forskning ved hjælp af mus og fiskemodeller10,11.
For nylig er flere bakterierelaterede tilgange eller terapier, herunder potentielle probiotika og fækal mikrobiotatransplantation (FMT), blevet undersøgt for disse lidelser i kliniske og dyremodeller. Disse udforskninger er baseret på opdagelser relateret til mikrobiota-tarm-hjerne / lever / nyreaksen, mikrobiotaafledte produkter og ændret receptoraktivitet12,13. Imidlertid er udviklingen, forskellige funktioner og mekanismer i mikrobiota-værtssystemet stadig ufuldstændigt forstået og identificeret på grund af kompleksiteten af det mikrobielle samfund og udfordringen med at generere kraftfulde menneskelignende sygdomsmodeller.
For at løse disse problemer blev kimfrie (GF) dyremodeller hurtigt foreslået i midten af det 19. århundrede og primært udviklet i løbetaf det 20. århundrede. Efterfølgende forbedringer, herunder antibiotikabehandlede og gnotobiotiske modeller, sammen med fremskridt inden for mikrobiel detektion og observationsteknologier, perfektionerede yderligere disse modeller 14,15,16. GF-dyr, skabt ved at slette deres egen baggrund og undgå miljømikrober, tilbyder en fremragende strategi til at udforske interaktionerne mellem mikroorganismer og deres værter17. Gennem anvendelse af dyremodeller og raffinerede protokoller har forskere med succes replikeret lignende mikrobielle sammensætninger, der findes hos patienter i GF-mus og fisk. Derudover giver andre GF-dyremodeller, såsom hunde, kyllinger og svin, forskellige muligheder som forskningsemner 18,19,20,21. Denne tilgang har muliggjort undersøgelser af de potentielle terapeutiske virkninger af kommensale mikrobiomer på forskellige sygdomme, herunder kræftimmunterapi hos mennesker16,18. GF-modeller giver mere præcis indsigt i karakteristika og mekanismer for specifik bakteriel kolonisering, migration, multiplikation og interaktion inden for værter. Dette giver afgørende ny indsigt i forekomsten og udviklingen af mikrobiota-relaterede sygdomme22,23. Historien om etablering og anvendelse af GF-zebrafisk i mikrobiel forskning har udviklet sig fra rapporterne fra Rawls et al. i 2004 og Bates et al. i 2006 til Melancon et al.'s protokol i 2017 16,24,25. Imidlertid er gennemførligheden af voksne eller avls GF-modeller stadig en langvarig proces ledsaget af variabel levetid, succesrater og sundhedsmæssige udfordringer.
Blandt forskellige dyremodeller skiller zebrafisk (Danio rerio) sig ud som et kritisk værktøj til både grundlæggende og biomedicinsk forskning på grund af dets fordelagtige lighed med menneskelige organer og genomik, kort udviklingscyklus, høj frugtbarhed og gennemsigtige embryoner19,26. Zebrafisk, der tjener som pålidelige humane sygdomsmodeller, tilbyder en visuel repræsentation af fysiologiske og patologiske processer in vivo, hvilket giver indsigt i de attraktive træk ved værtsmikrobeinteraktioner. Især udviser zebrafisk forskellige cellelinjer, hvilket muliggør billeddannelse af tarmfysiologi, mikrobiel dynamik, gonader og reproduktiv udvikling, modning af værtsimmunsystemet, adfærd og metabolisme27. Zebrafiskembryoner udvikler sig inden for beskyttende korioner indtil udklækning og bliver larver 3 dage efter befrugtning (dpf). De jager aktivt efter mad ved 5 dpf og når seksuel modenhed omkring 3 måneder efter befrugtning (mpf)28. Den første vellykkede kimfri (GF) zebrafisk, rapporteret af Rawls et al.24, viste, at larver fodret med autoklaveret foder efter æggeblommeabsorption udviste vævsnekrose fra 8 dpf og total død ved 20 dpf. Dette indikerede virkningerne af kost eller vigtigheden af at overveje eksogen næringsstofforsyning i forsøg, der involverede langsigtede (>7 dpf) GF-fisk29. Efterfølgende undersøgelser forbedrede generationsprotokollen for GF-fisk ved at anvende steril mad og metoder perfektioneret i forskellige fiskemodeller16.
Imidlertid har det meste forskning på GF zebrafiskmodeller fokuseret på tidlige livsstadier, der involverer bakteriel infektion ved 5 dpf i 24 timer til 48 timer, med prøver indsamlet før 7 dpf ved afslutningen af forsøgene 25,30,31. Det er almindeligt anerkendt, at mikrobiota i organismer, herunder mennesker og zebrafisk, koloniseres i begyndelsen af livet og formes under vækst og udvikling. Sammensætningen forbliver stabil i voksne stadier, hvor mikrobiotas roller i værten er afgørende gennem hele livet, især i aldring, neurodegenerativ, metabolisk relateret fedme og tarmsygdomsaspekter3. Således kan perspektiver fra GF-dyr med længere overlevelse give indsigt i mekanismerne for mikrobielle roller i værtsorganudvikling og funktioner i betragtning af fiskelarvernes umodne immun- og reproduktionssystemer tidligt i livet. Mens bakteriestammer i zebrafiskens tarme er blevet isoleret og identificeret i tidligere undersøgelser, hvilket giver potentialet til at inficere GF-dyremodeller til at vælge probiotika eller forskningsbakterielle funktioner i værten19,25, har generering og anvendelse af GF-fiskemodeller primært været begrænset til tidlige livsstadier. Denne begrænsning, der tilskrives den komplekse produktionsproces, høje vedligeholdelsesomkostninger og tilknyttede problemer med mad og immunitet, hindrer forskningsindsats, der sigter mod at undersøge de udviklingsmæssige og kroniske virkninger af mikrobiota i værten.
Overlevelsesraten, adfærd, vækst, modning og generel sundhed hos fisk, især i kimfrie (GF) modeller, påvirkes signifikant af fodringspraksis, der omfatter ernæringsindtag og absorption i den åbne periode fra tidlige larver til unge32,33. En af udfordringerne i GF-fiskeopdræt er imidlertid manglen på egnede sterile kostvaner, hvilket begrænser effektiviteten af ernæringsmæssig støtte til opretholdelse af larvernes vækst og overlevelse. Løsning af dette problem er afgørende for at genoprette GF-fiskens liv i betragtning af deres udviklingsforsvarsmekanismer og svage fordøjelsesevner på grund af fraværet af et tarmmikrobiom. Med hensyn til mad fremstår levende artemia (Artemia sp.) som den mest egnede diæt til mundåbne larver til unge fisk. Det er blevet observeret, at fisk, der fodres med levende artemia, udviser højere vækst- og overlevelsesrater sammenlignet med dem, der fodres med kogt æggeblomme eller andre naturlige og syntetiske lokkemad34. Mens tidlige livsmodeller af GF-fisk kan overleve med æggeblommestøtte, og GF-larvermodeller kan opretholdes med steril fodring, er det stadig udfordrende at generere langsigtede modeller fra larver til unge og nå seksuel modenhed. Derudover er flage- eller pulverfoder begrænset af ulige ernæringssammensætning og kan påvirke vandkvaliteten. I modsætning hertil har levende Artemia fordele som overlevelse i både salt og ferskvand, lille størrelse egnet til larver til voksne, let batching og højere rugekvalitet35. Med udgangspunkt i tidligere metoder 16,24,30 har vi forenklet den komplekse behandlingsproces og adresseret kostudfordringen ved at etablere let inkuberet GF levende Artemia sp. som steril mad i længere varighed end GF-fisk i det tidlige liv.
Denne undersøgelse præsenterer en optimeret protokol, der dækker (1) generation, (2) vedligeholdelse, (3) identifikation af steril hastighed og (4) vedligeholdelse og fodring for at sikre væksten af kimfri (GF) zebrafisk fra embryoner til larver og unge stadier. Resultaterne giver foreløbige beviser for udklækning, overlevelse, vækst og sterilitet af GF zebrafisk sammen med vigtige indekser for GF Artemia sp. som steril mad. De detaljerede trin i modelgenerering og tilberedning af sterile levende fødevarer giver afgørende teknisk støtte til konstruktion og anvendelse af langsigtede GF-fiskemodeller samt GF Artemia sp. i mikrobiota-værtsinteraktionsforskning. Protokollen omhandler bakteriel isolering, identifikation og infektion på GF-fiskemodeller, der skitserer metoder til bakteriel fluorescensmærkning og observerer deres kolonisering i fisketarme under et mikroskop. GF-fisk, gnotobiotiske fisk med bakteriel infektion eller overførte humane mikrobiotamodeller vil gennemgå forskellige påvisninger for at belyse deres funktioner og virkninger på værtsimmunitet, fordøjelse, adfærd, transkriptomisk regulering og metaboliske aspekter. På lang sigt kan denne protokol udvides til forskellige vildtypefiskearter, såsom marine medaka, og potentielt til andre udvalgte transgene zebrafisklinjer, der er korreleret med specifikke væv eller sygdomme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fiskeforsøgene blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra Animal Care and Use Committee of Chongqing og Institutional Animal Care and Use Committee of Chongqing Medical University, Kina, samt standarderne for forsøgsdyr udstedt af State Bureau of Quality and Technical Supervision (godkendelses-id: GB14922-2001 til GBT14927-2001). Zebrafisk (Danio rerio, vildtype, AB-stamme) blev hentet fra Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences og opretholdt i laboratoriet efter tidligere rapporterede procedurer36.
1. Vedligeholdelse af voksne zebrafisk og embryoindsamling
BEMÆRK: På baggrund af ændringer fra tidligere undersøgelser og rapporter 16,37,38,39 blev vedligeholdelsen af voksne zebrafisk, larveropdræt og praksis for kimfrie (GF) modeller i vores laboratorium udført ved at følge nedenstående trin. Det ultrarene flowsystem til fiskekultur blev opnået kommercielt (se materialetabel). Vandet, der holdes med en afbalanceret pH, salt og alkali, gennemgår filtrering under cykling for at sikre rene forhold.
- Oprethold voksne fisk med følgende standardprocedure i autocyklussystemet (se materialetabel) med en fotoperiode af mørket: lys = 10 timer: 14 timer ved 28 °C ± 0,5 °C og fodret med frisk inkuberet Artemia sp. to gange dagligt.
- Sæt den kønsmodne voksne zebrafisk (han: hun = 2:1) i tanke med frisk og rent vand aftenen før.
- Lad fiskene gyde næste morgen (ca. 8:30) under regelmæssig lysstimulering i laboratoriet. Efter 1-2 timer overføres fisken til en anden tank.
- Opsaml embryoner i vand fra auto-cykelsystemet som opdrætsmedium i en kulturskål ved hjælp af en engangs Pasteur-pipette.
2. Generering af GF zebrafisk fra embryoner til larver
BEMÆRK: Proceduren for generering af kimfrie (GF) fisk er skitseret i figur 1, mens de grundlæggende udviklingsindekser for konventionelle (CR) og GF-modeller er vist i supplerende figur 1. Følg nedenstående trin i et biologisk sikkerhedsskab på en bordplade eller en laminar flowhætte ved hjælp af en steril aseptisk teknik i et renrum.
- Vask embryonerne ved hjælp af fiskekulturvandet og fjern afføring, urenheder og døde eller ufrugtede æg.
- Embryonerne overføres ved 2 hpf til steriliserede plader (op til 480 embryoner pr. steril skål med en diameter på 10 cm) fyldt med antibiotikakimfrit zebrafiskmedium (AB-GZM, se materialetabel) opløsning og kultur ved 28,5 °C i 6-8 timer.
BEMÆRK: AB-GZM bruges til at behandle embryonerne i flere timer for at eliminere overflademikroorganismerne, og GZM uden antibiotika bruges til at dyrke GF-fisk i undersekvens. Normalt er den perfektionerede kulturtid 6 timer). - Ekskluder æg med hvide pletter eller et hvidligt udseende, og vælg dem, der normalt udvikles, og viser gennemsigtige og intakte konvolutter til videre behandling.
- Skyl embryonerne med AB-GZM tre gange inden for 10 min.
- Blødgør embryonerne i 0,2 g / L povidon-jodopløsning (PVP-I) i 1 min (se materialetabel).
BEMÆRK: Højere koncentration og længere end 2 min vil påvirke embryoners død og rugehastighed. - Vask embryonerne med bakteriefrit zebrafiskmedium (GZM) tre gange inden for 10 min.
- Tilsæt embryoner i natriumhypochlorit (NaClO) arbejdsløsning, dæk 50 ml mikrocentrifugerørene tæt og blegemiddel i 15 minutter. I løbet af denne periode suspenderes embryonerne i blegemiddelopløsning ved forsigtigt at ryste dem.
- Vask embryonerne med GZM tre gange inden for 10 min.
- Overfør embryonerne til sterile 6-brøndsplader med 5 embryoner og 10 ml GZM pr. Brønd. Dyrk dem i en ultraren platform eller inkubator med en fotoperiode af mørke: lys = 10 timer: 14 timer ved 28 °C ± 0,5 °C.Kulturtætheden vil påvirke sterilhastigheden.
- Forny dyrkningsmediet dagligt ved at fjerne den brugte GZM, indsamle den som prøver til steril statusdetektion og genopfylde hver brønd med det samme volumen steril GZM.
- Registrer de grundlæggende udviklingsindekser for GF-embryoner/larver, herunder overlevelsesrate, rugerate, hjerteslag, kropslængde og vægt osv.19.
- Overfør GF-fisken til egnede beholdere (tallerkener, cellekulturkolber eller glasflasker med dæksler) med udvidet volumen, hvilket giver steril mad gennem hele vækstprocessen.
3. Vedligeholdelse af GF zebrafisk fra larver til unge
- Forny GZM uden tilførsel før 7 dpf, og registrer dagligt de sterile tilstande (se trin 5).
- Foder zebrafisklarver fra 8 dpf til unge stadier med steril æggeblomme (10 μL forberedt stamopløsning pr. brønd) en gang dagligt, før GZM skiftes.
- Foder GF unge fra 14 dpf med steriliseret æggeblomme blandet med GF Artemia sp. en gang dagligt (1-3 Artemia / larver, se trin 4), gradvist stigende fødemasse med vækst og udvikling af GF fisk.
- Giv æggeblomme, indtil alle fisk kan forbruge Artemia nauplii.
BEMÆRK: GF Artemia bør gennemgå sterilitetstest før brug. Vurder antallet af Artemia nauplii tilbage, observer forfølgelse og fangst fremskridt, og undersøg fiskekroppen med forbrugt mad for at indikere fodringssucces. - Fra 28 dpf til tidlige voksne stadier, fodre GF Artemia en gang dagligt (3-5 Artemia / larver) og rengør utappet eller død Artemia, og døde fisk i affaldet GZM som daglige prøver.
- Under GF-fiskevækst ændres 6-brøndpladerne efter 7 dpf til sterile plader eller cellekulturkolber fra 8 til 21 dpf og derefter til sterile flasker efter 21 dpf. Forøg kulturmedium og fødemasse i henhold til antallet og vægten af GF-fisk i hver beholder.
- Forny GZM dagligt og kontroller prøver for at sikre succes med GF-modeller.
BEMÆRK: Vedligeholdelse af kimfrie (GF) fiskemodeller indtil tidlig voksenalder og seksuel modenhed er udfordrende, med en lav gennemsnitlig overlevelsesrate på 30 dpf, typisk mindre end 10%. Dette tilskrives primært svag immunitet, forsinket udvikling og nedsat tarmfunktion.
4. Tilberedning af GF Artemia nauplii som steril mad til kroniske GF fiskemodeller
BEMÆRK: Dyrknings- og forberedelsesmetoden for kimfri (GF) Artemia er skitseret i figur 2. Bemærk, at alle følgende trin udføres i et biologisk sikkerhedsskab på en bordplade ved hjælp af en steril aseptisk teknik.
- Skyl 0,25 g Artemia-cyster med 2,4 g / L natriumhypochlorit (NaClO, se materialetabel) i 5 minutter.
- Filtrer de skyllede Artemia-cyster med et steriliseret ultratæt filter (ca. 170 masker i åbning) og vask med steriliseret ultrarent vand tre gange, hver gang i 1-2 min.
- Overfør de vaskede Artemia-cyster til 100 ml 2,5% steriliseret saltvand, bland og pak til aseptisk ruge i henhold til nedenstående trin.
- Pak den 50 ml behandlede Artemia cyster blandingsopløsning i en steril flaske med et volumen på 100 ml, forsegl den med film og inkuber i en rystende inkubator ved 150 o / min, 30 ° C i 18 timer til 24 timer med lys.
- Udtag ca. 30 ml ruge Artemia nauplii fra det midterste og nederste lag ved hjælp af en engangs Pasteur-pipette.
BEMÆRK: Undgå flydende æg og tomme skaller i at nå det øverste lag. Indekserne for kimfrie (GF) Artemia cyster og nauplii inkuberet i 24 timer er vist i figur 3. - Filtrer Artemia med et steriliseringsfilter og vask dem i et steriliserende bægerglas med steriliserende ultrarent vand tre gange, ca. 30 s til 1 min for hver gang. Til sidst tilsættes 4 ml steriliseret ultrarent vand for at forberede Artemia blandet opløsning.
- Brug en engangs Pasteur-pipette til at hente aktivt svømmende Artemia fra det øverste lag, vaske og forberede nauplii-opløsningen til fodring og aseptisk identifikation.
5. Identifikation af GF-fiskemodeller i hele livsstadierne
BEMÆRK: Gennem hele levetiden for kimfri (GF) fisk er nøgleindekser og daglige prøvedetektioner afgørende for at sikre modellernes succes. Dette trin opsummerer den fælles klassificering af prøver og de sædvanlige identifikationsmetoder (figur 4).
- Overhold og tæl overlevelsesstatus og rate af GF zebrafisklarver dagligt. I eksperimenter, der beregner relaterede satser, dyrkes GF-fisk i plader med 24 eller 48 brønde med en fisk pr. Brønd.
- Overlevelsesrate = (antal levende fisk på observationstidspunktet / samlet antal æg) × 100%.
- Sterilitetsrate = (antal sterile fisk/antal overlevende fisk) × 100%.
BEMÆRK: Denne protokol fokuserer på den sterile hastighed af levende fisk. Antallet af sterile fisk bestemmes ved at tælle vellykkede GF-fisk efter flere kontroller blandt de levende fisk. Eventuelle døde fisk eller levende fisk GF-modeller, der har fejlet på grund af bakteriel tilstedeværelse, elimineres under efterfølgende GF-procedurer.
- Saml følgende prøver af GF zebrafisklarver.
- Kulturmedium af GF zebrafisk fra hver brønd eller flaskebeholder.
- Fiskemad, såsom steril æggeblomme og GF Artemia.
- Affaldsmedium, herunder fragmenter af ægmembran efter klækning og madrester eller afføring i fodringsperioderne fra larver til ungfisk.
- Døde fiskeprøver for at identificere tilstedeværelsen af bakterier.
- Fiskesubstrat og midler, der anvendes til embryobehandling som steril kontrol.
- Prøver fra materialer, driftsplatform og inkubator mv.
- Registrer prøver indsamlet dagligt ved hjælp af flere metoder.
- Først anvendes spredningsplademetoden og dyrkningspladerne i en inkubator ved 30 °C.
- Overtræk med 20-50 μL affaldsmediumprøve på Trypticase Soy Agar (TSA) pladen (se materialetabel) under aerobe forhold.
- Overtræk med 20-50 μL affaldsmediumprøve på TSA-pladen under anaerobe forhold.
- Overtræk med 20-50 μL affaldsmediumprøve på blodets TSA-plader (se materialetabel) under aerobe forhold.
- Overtræk med 20-50 μL affaldsmediumprøve på blodets TSA-plader under anaerobe forhold.
- For det andet skal du bruge væskekulturmetoden.
- Der udtages 200 μL prøve i aerobe rør med BHI-medium (Brain Heart Infusion Broth) (se materialetabel) og dyrkning i rysteinkubatoren ved 30 °C, 150-180 omdr./min.
- Der tilsættes 200 μL prøve i anaerobe glas med BHI-substrat og dyrkning i inkubatoren ved 30 °C.
- Tilsæt 200 μL prøve i aerobe rør med Trypticase Soy Broth (TSB) medium, og kultur derefter i rysteinkubatoren ved 30 ° C, 150-180 o / min.
- Der tilsættes 200 μL prøve i anaerobe rør med TSB-substrat og dyrkning i inkubatoren ved 30 °C.
- For det tredje skal du bruge molekylære teknikker-16s polymerasekædereaktion (PCR) assay.
- Spildevandsprøven analyseres med to par primere 27F og 1492R samt 63F og 1387R (tabel 1).
BEMÆRK: PCR-masterblandingen blev fremstillet i henhold til tabel 2 ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt DNA-polymerasesæt (se materialetabel), og PCR-maskinen blev konfigureret med det program, der er specificeret i tabel 3. - Når PCR-programmet er afsluttet, undersøges produkterne med 1% agarosegelelektroforese40 ved målbånd på 1465 bp (ved hjælp af primere 27F og 1492R) eller 1324 bp (ved hjælp af primere 63F og 1387R) for at udlede steriliteten af prøver.
- Spildevandsprøven analyseres med to par primere 27F og 1492R samt 63F og 1387R (tabel 1).
- Først anvendes spredningsplademetoden og dyrkningspladerne i en inkubator ved 30 °C.
- Optag og observer sterilitetstest, herunder plade- og mediumkultur fra 24 timer til 3 dage og 7 dage, hvor ingen koloni på plader og ingen turbiditet i væske indikerer den vellykkede konstruktion af GF-modeller. Overhold og registrer pladen og mediet ved 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer, 120 timer, 144 timer og 168 timer.
6. Identifikation af GF Artemia-prøver inden fodring med GF-fisk
BEMÆRK: Følg nedenstående trin for at detektere GF Artemia-prøverne , som er uundværlige som levende mad, før de fodrer med GF-fisk (figur 4).
- Saml prøver af GF Artemia modeller.
- Ubehandlede Artemia cyster.
- Behandlede GF Artemia cyster.
- Udklækket GF Artemia nauplii.
- Steriliseret ultrarent vand som kontrol.
- Opdag GF Artemia med følgende metoder.
- Brug spredningsplademetoden til at detektere prøverne ved at belægge dem på TSA-plader og blod-TSA-plader under aerobe og anaerobe forhold. De inkuberes ved 30 °C.
- Brug et flydende medium til at detektere prøverne i aerobe og anaerobe TSB- og BHI-rør. Kultur i en ryster ved 150-180 o / min, 30 ° C.
- Brug PCR-assay til at detektere tilstedeværelsen af bakterier i prøverne indsamlet ved hjælp af 16s ribosomale RNA-målgener primere 27F og 1492R, 63F og 1387R (tabel 1). Volumen og program er vist i tabel 2 og tabel 3.
- Registrer resultaterne: Detekter PCR-produktet med 1% agarosegelelektroforese40 for målbånd, der måler 1465 bp (ved hjælp af primere 27F og 1492R) eller 1324 bp (ved hjælp af primere 63F og 1387R). Resultaterne af plader og flydende medium kan sikre den sterile status af GF Artemia , før de anvendes som GF fiskefoder.
7. Isolering og identifikation af tarmbakteriestammer fra zebrafisk
BEMÆRK: For at undersøge tarmfunktioner in vitro og in vivo er det nødvendigt at isolere bakteriestammer fra zebrafisk, som også giver artskilden til potentielle probiotika, der screenes ved infektion ved hjælp af GF-dyr (figur 5). I denne protokol beskriver vi den traditionelle dissektionsmetode for at opnå tarmindhold, mens prøverne også kan indsamles direkte fra levende bedøvede fisk (data ikke vist).
- Vælg sunde voksne zebrafisk og vask dem med sterilt vand. Udfør følgende trin i den rene bænk.
- Bedøv fisken med 100 mg/L MS-222 i 5-10 min.
- Brug 75% alkohol til at behandle fiskens kropsoverflade.
- Disseker fisketarmene og ekstruder tarmindholdet med TSB eller BHI-medium.
- Inkuber tarmsupernatanten ved at anvende TSA, blodplade, TSB og BHI-medium under aerobe og anaerobe forhold.
- Oversæt bakterierne for at få signalstammen og registrere egenskaberne ved forskellige kolonier.
- Opbevar bakterierne inden for 30% glycerol ved -80 °C.
- Identificer derefter tarmbakterierne ved genomisk DNA-ekstraktion og PCR-sekventering.
BEMÆRK: De vigtigste trin i bakteriel genomisk DNA-ekstraktion inkluderer væskecentrifugering, RNase A og Protease K-dissociation, ethylalkoholekstraktion, skylning og opløsning ved hjælp af kommercielt tilgængelige sæt efter producentens anvisninger (se materialetabel). - Analyser 16S-sekvenserne ved hjælp af National Center for Biotechnology Information (NCBI) og Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) med bakterie- og arkæedatabasen 40,41 (se materialetabel).
- Vælg de bedst matchede bakterier og tegn for at identificere de isolerede tarmstammer på slægtsniveau.
- Detekter de metaboliske funktioner af bakteriestammer ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits (se materialetabel).
8. Influenza-mærkning, infektion og kolonisering af bakterier i GF zebrafisktarme
BEMÆRK: Før infektion af GF-zebrafisk blev de isolerede bakterier modificeret med farvestoffer og talt, hvilket gjorde mikrobiel kolonisering og migration synlig kontinuerligt og in vivo (figur 6).
- Vælg potentielle gavnlige bakterier eller dominerende stammer med høj overflod i værten for at inficere GF-fiskemodellerne.
BEMÆRK: De bakterier, der blev anvendt i denne undersøgelse, var Aeromonas sp. og Vibrio sp. (se materialetabel), udvalgt blandt de 8 slægter, der blev isoleret og identificeret fra voksne vildtypezebrafisk i laboratoriet42. - Mærk de friske bakterier med CM-Dil farvestoffer (se tabel over materialer) og udsæt dem for GF zebrafisk ved 5 dpf med en koncentration på 106-10 8 kolonidannende enheder (CFU'er) / ml.
- Overhold fluorescensen under fluorescerende mikroskop med 3× forstørrelse for at indikere kolonisering og fordeling af bakterier i tarmen hos GF zebrafisklarver fra 6 dpf og 14 dpf.
- Tæl manuelt antallet af bakterier i GF-fisk efter pladekultur på hvert tidspunkt.
- Registrer kolonierne og sekvenserne for at sikre, at infektionen var vellykket med målbakteriestammerne.
- Indsamle prøver af GF-fisk med bakteriel infektion til efterfølgende assays, herunder neuroadfærd, udviklingsindekser, histopatologisk analyse og hormonmålinger osv. 43,44,45.
BEMÆRK: De bakterier, der anvendes i infektionseksperimentet, skal genvindes for nylig og dyrkes frisk af det flydende medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GF zebrafisk modellerne kan produceres effektivt ved at udnytte de rigelige æg gydt af par zebrafisk, med protokollen optimeret baseret på tidligere GF fisk modeller35. En enkelt 6-brønds plade kan dyrke ca. 30-48 embryoner / larver, hvilket giver mulighed for rigelig dataindsamling og statistisk analyse. Efter steril behandling dyrkes GF-embryonerne i en ren inkubator, indtil de klækkes til larver ved 48-72 timer, og ændres GZM dagligt med påvisning af indsamlede prøver, hvilket er afgørende for at opretholde den kimfrie tilstand (figur 1). Efter 7 dpf bør mad af æggeblomme og levende Artemia være forberedt på larver til ungdomsstadier. Under fiskens vækst og udvikling bør volumen, beholder og densitet af GZM reguleres eller ændres i tide for at undgå død og svigt af steril status. Hvis detektionen ikke viser bakteriel forurening, kan de vellykkede GF-modeller opretholdes som kroniske fra ungdom til tidlig voksenalder, men overlevelsesraten er meget lavere i praksis. Endelig kan sterilhastigheden, overlevelsesraten, udviklingsindekset, adfærd, histopatologisk analyse og transkriptionsprofilen for GF- og CR-fiskemodeller måles for at undersøge indflydelsen af mikrobiota og lægemiddelskærmfelter. I denne undersøgelse blev de vigtigste udviklingsindekser sammenlignet (supplerende figur 1), og udklækningsraten for GF-fisk var 45,7% lavere end CR-fisk med 60% ved 72 hkf. Hjertefrekvensen for GF-larver ved 7 dpf var signifikant lavere ved 18,2 slag / 10 s sammenlignet med CR-fisk med 22,6 slag / 10 s, men der var ingen forskel mellem de to grupper ved 14 dpf med hastigheder på 23,5-23,8 slag / 10 s. Overlevelsesraten for GF-fisk ved 7 dpf var den samme som for CR-fisk på 86,7%, men faldt til 60% ved 14 dpf sammenlignet med 80% for CR-fisk. Imidlertid faldt overlevelsesraten for både GF- og CR-fisk til 25% -10% efter den åbne periode, hvor de erhvervede fodringsevner eller vaner. Den manglende opretholdelse af fiskens sterile status var en af årsagerne til den lavere overlevelsesrate. Derfor er fodring og vedligeholdelse af næringsstoffer fra unge til tidlige voksenstadier kritiske udfordringer i fiskekulturen.
En anden nøglefaktor, der påvirker vækst og udvikling af fisk, er fodring. I denne undersøgelse undersøger vi flere metoder til at opnå GF Artemia som levende mad til langsigtede GF zebrafisklarver til unge og voksne (proces vist i figur 2). På grund af den daglige brug af mad til GF-fisk bør den optimerede protokol for GF Artemia være let, tidsbesparende og økonomisk i praksis. Efter sammenligning af den aktive bevægelse og død / immobilitet af nauplii observeret af mikroskopet, karakteristika for nauplii, uudklækkede æg og skal, er metoden perfektioneret. Efter daglig inkubation blev indekserne for frisk GF Artemia opnået fra flasker, herunder udklæknings-, overlevelses- og deformitetshastigheden og længden og vægten af nauplii, observeret og målt under mikroskopet (figur 3). Efter behandling var udklækningshastigheden af Artemia-cyster høj, med et gennemsnit på 88,15%, overlevelsen af svømning nauplii var 77,83%, og misdannelsesraten var 1,87%. Kropslængden af nauplii var 546,70 μm, og kropsvægtindekset var 3,80 mg / 100, hvilket er egnet til fiskefangst og fodring fra larverne månedsåben periode til unge og voksne stadier.
Påvisning af GF-fisk og GF Artemia er også vigtig for modelvedligeholdelse. Ifølge prøveindsamling og flere testmetoder kan resultaterne give succes med behandlede zebrafiskembryoner og Artemia-cyster i den dyrkede plade og det flydende medium (figur 4). De forskellige prøver, der indsamles dagligt, skal detekteres som sterile i alle testmetoder, som derefter kan indikere GF-modellerne på indsamlingstidspunktet. GF Artemia bør detekteres før fodring med GF fisk, eller pladen og medium inkubator resultater bør henvise til den sterile tilstand af frisk levende nauplii. Det vil sige dyrke GF Artemia fra cyster på TSA-plader eller TSB eller BHI flydende mediumglas i rysteinkubation, som kan bruges til generering af GF Artemia og steril verifikation på samme tid. GF Artemia-protokollen kan rumme et begrænset antal larver til fodring. Under fodringsprocessen var det tydeligt, at GF Artemia svømmede inden for GZM og derefter blev fanget og fortæret af GF-fiskelarverne.
Anvendelserne af GF-fiskemodeller involverer forskellige områder inden for biologi og medicin, hvilket muliggør undersøgelse af mikrobielle funktioner, vækst og udvikling, sygdomsmekanismer og probiotisk eller lægemiddelscreening, blandt andre46. I denne undersøgelse blev for eksempel to store tarmbakterier, Aeromonas sp. og Vibrio sp., isoleret fra zebrafisk. Kolonikarakteristika og identifikation blev udført, og flere metaboliske funktioner blev målt in vitro ved hjælp af kommercielt tilgængelige kits (figur 5). Disse bakterier blev isoleret og identificeret med 16S-sekventering, og eksplosionsresultaterne blev præsenteret i en tidligere rapport42. De identificerede bakteriestammer muliggør videnskabelig forskning i virkningen af enkelt eller kombineret mikrobiota på værtssundheden ved at inficere GF-fiskemodellerne. Gennemsigtigheden af fiskelarver tillader observation af fluorescensmærkede bakterieceller ved hjælp af CM-Dil-farvestoffer, hvilket afslører kolonisering og distribution i tarmene hos GF-fisk (vist i figur 6). Efter bakteriel infektion ved 5 dpf kan GF zebrafisklarver afbildes med et fluorescensmikroskop og kontinuerligt observeres fra 6 til 14 dpf, hvilket giver indsigt i mikrobielle funktioner kombineret med udviklingsindekser, histopatologiske ændringer og molekylære ændringer47.
Figur 1: Protokol for GF-zebrafisk fra embryoner til larver og ungfisk. De vigtigste trin i genereringen af GF-zebrafisk omfatter: (1) Indsamling af embryoner fra vildtypezebrafisk og placering i AB-GZM. (2) Skyl behandlingen med PVP-I og NaClO-midler for at sikre fuldstændig sterilitet. (3) Dyrkning af GF-embryoner/larver i 6-brøndsplader med GZM, fornyelse af mediet dagligt. (4) Regulering af kulturbetingelser for optimal vækst og udvikling. (5) Prøveudtagning på forskellige udviklingsstadier efterfulgt af sterilitetstest ved hjælp af plade- og væskemediummetoder. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Protokol for GF Artemia tilberedning som levende mad til GF fisk. Vigtige trin omfatter: (1) Skyl behandling af Artemia cyster for fuldstændig sterilitet. (2) Fremstilling af GF-cyster i mediet. (3) Inkubation i en saltopløsning i 24 timer for at fremme ruge. (4) Filtrering af mislykket ruge og tomme æg for at opsamle aktive nauplii. (5) Vask af indsamlet nauplii for at fjerne snavs, hvilket sikrer levende fødevarer af høj kvalitet og fri for forurenende stoffer. (6) Sterilitetstest af GF Artemia før fodring af GF-fiskelarver. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Indekser over GF Artemia cyster og nauplii inkuberet i 24 timer. (A) Ubehandlede Artemia cyster med urenhedsfilm (skala bar: 500 μm). (B) Behandlede Artemia-cyster med en let konveks overflade efter vandabsorption og et renere udseende (skalastang: 500 μm). (C) Mikroskopisk undersøgelse af frisk inkuberet levende GF Artemia nauplii (skalastang: 2000 μm) og (D) forstørrelse med en skalastang på 1000 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Steril påvisning af GF-fisk på hvert livsstadie og GF-artemi. (A) Sterile test af CR- og GF-fiskeprøver ved hjælp af TSB og BHI flydende medium, TSA, og blodplader under aerobe og anaerobe forhold. (B) Sterile test af ubehandlede Artemia cyster, GF Artemia cyster, og nauplii ved anvendelse af TSB og BHI flydende medium, TSA, og blodplader under aerobe og anaerobe forhold. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Isolering og identifikation af tarmbakterier hos zebrafisk. (A) Bakteriestammer, koloniegenskaber, 16S-sekventeringskort (eksempler: Aeromonas sp. og Vibrio sp.). (B) Slægts- og NCBI-tiltrædelser. (C) Metaboliske funktioner hos bakterier isoleret fra zebrafiskens tarm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Infektion og kolonisering af tarmbakteriestammer i GF zebrafisk. (A) Genopretning af isolerede og identificerede bakteriestammer til infektionsforsøg. (B) Mærkning af bakterier med fluorescerende farvestoffer og infektion af GF zebrafisklarver ved 5 dpf. Forstørrelse: 1x. (C) Observation af fordeling og kolonisering af bakterier (Vibrio sp.) i tarmvæv in vivo. Forstørrelse: 3x. (D) Optælling af CFU'er af bakterier (Aeromonas sp. og Vibrio sp.) i hver fiskelarve ved daglig prøveudtagning. Data præsenterer betyder ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Primere | Sekvenser(5'-3') | Produktets længde |
| 27F | AGAGTTTGATCMTGGCTCAG | 1465 bp |
| 1492R | ACGGYTACCTTGTTACGACTT | |
| 63F | CAGGCCTAACACATGCAAGTC | 1324 bp |
| 1387R | GGGCGGWGTGTACAAGGC |
Tabel 1: Primere anvendt til bakteriel detektion.
| Komponenter | Enheder | Volumen (μL) |
| Taq DNA-polymerase | 2,5 U/μL | 0.1 |
| 10× buffer (mg2+) | --- | 2.1 |
| dNTP-blanding | 2,5 mM | 1.6 |
| Primer 27F | 10 μM | 1 |
| Primer 1492R | 10 μM | 1 |
| DNA/RNA-fri H2O | --- | 13.2 |
| Skabelon DNA | --- | 1 |
| Samlet volumen | --- | 20 |
Tabel 2: Endelig koncentration og volumen af komponenter pr. reaktion.
| Skridt | Temperatur | Tidspunkt | Cykler |
| Indledende denaturering | 95 °C | 4 minutter | -- |
| Denaturering | 94 °C | 1 min | 35 |
| Udglødning | 55 °C | 1 min | |
| Forlængelse | 72 °C | 1 min | |
| Endelig forlængelse | 72 °C | 10 minutter | -- |
| Holde | 4 °C | ∞ | -- |
Tabel 3: PCR-program til amplifikation af 16S rRNA-genet.
Supplerende figur 1: De kritiske udviklingsindekser for GF- og CR-zebrafiskmodeller. (A) Udklækningshastigheden for CR- og GF-zebrafisk ved 72 hpf og (B) hjerteslag/10 s CR- og GF-fisk ved 7 dpf og 14 dpf. Overlevelsesraten (%) af CR- og GF-fisk faldt fra 7 dage og 14 dage med 86%, 60%-80% til 10%-25% ved 30 dpf. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trin inden for protokollerne for GF fisk og GF madlavning
Under genereringen af GF-fiskemodeller var flere kritiske trin involveret, herunder fremstilling af sterile materialer, sterilisering af embryoner, daglig fornyelse af GZM, indsamling af forskellige prøver og steril undersøgelse af hver prøve ved hjælp af flere metoder. Blandt disse trin er den indledende behandling af embryoner grundlæggende og afgørende for GF-modellernes succes. Kontrollerende midler, deres koncentrationer og behandlingstider er afgørende for at opnå optimale steriliseringshastigheder og rugesucces. Omhyggelig opmærksomhed er nødvendig ved håndtering af GF-fiskeembryoner til larver, der involverer daglige medieændringer og sikrer, at materialer og platforme steriliseres grundigt ved hjælp af ultraviolet lys eller autoklavering, når plader fjernes fra inkubatoren. Overvågning af temperaturforhold og driftstid om vinteren er afgørende for at forhindre larvedød forårsaget af lavere temperaturer i rene bænke.
Steril æggeblomme og GF Artemia bør detekteres, før de fodres til fisk efter 7 dpf for at sikre deres sterile tilstand til langsigtede GF-modeller. I fodringsperioden er rengøring af madrester vigtig som en del af de prøver, der indsamles til påvisning ved fornyelse af affaldsmediet. Beholderen, mængden af GZM og fødemassen bør justeres sammen med vækst- og udviklingsstadierne for at forhindre GF-fisketab på grund af begrænsede omgivelser og vandkvalitetsproblemer. Regelmæssig overvågning og justeringer i disse parametre bidrager til en vellykket vedligeholdelse af GF-fiskemodeller.
Ændringer og betydningen af disse protokoller
Den forenklede tretrinsproces til generering af GF-zebrafiskembryoner, der involverer optimerede midler, koncentrationer og eksponeringstider for AB-GZM-, PVP-I- og NaClO-opløsninger, sikrer en høj steril hastighed og sund udvikling af modeller. Derudover er de sterile detektionsmetoder til daglige prøver blevet perfektioneret til at omfatte plader og flydende mediumkulturer under aerobe og anaerobe forhold sammen med molekylære teknikker ved hjælp af almindelige bakterielle primere. Yderligere erfaringer med test for bakterie- og svampekontaminanter sigter mod at optimere isolatorkontaminanter og sterile test under GF-dyreteknikker48.
Den specifikke protokol for GF Artemia nauplii som levende mad til fiskemodeller er blevet undersøgt i vores undersøgelse, og et patent blev udstedt til PPJ og DSP af China National Intellectual Property Administration (nr. ZL202210482684.8). Langsigtede GF-fiskemodeller er konsekvent begrænset af utilstrækkelig og uegnet ernæring, hvilket forværrer svagheder i tarmfunktioner relateret til fordøjelse og absorption. Som en troværdig fødekilde til medaka og zebrafisk modeller på forskellige livsstadier, bør GF Artemia sp. være let at forberede med en simpel procedure, kort inkubationstid og steril detektion i realtid til daglig brug. Ved denne metode skylles normale Artemia-cyster i en tilstrækkelig koncentration af NaClO til at være aseptisk og inkuberes derefter i en filmovertrukket flaske såvel som på en plade og i et flydende medium til påvisning. Dette understøtter nyklækning nauplii til GF fiskefodring. Artemias sterile hastighed og rugehastighed samt kropslængde, vægt og aktivitet er fremragende, hvilket indikerer tilgængelige anvendelser i praksis.
Betydningen af disse ændringer i GF-fisk og GF-fødevareprotokoller gavner forskere ved at generere modeller ved embryoner, larver, unge stadier og endda tidlige voksen- og voksenstadier i marine og ferskvandstilstand. Langsigtede GF-dyr vil give tilladelse som in vivo-modeller i forskning i lægemiddelscreening og mikrobielle funktioner under værtsvækst og udvikling, især i modenheden af immunitet og relaterede tarmcellelinjer. For eksempel har zebrafisklarver kun medfødt immunitet i den første uge og udvikler derefter det adaptive immunitetssystem under 7-21 dpf sammen med thymus modenhed31,49. Desuden kan GF-fiskemodeller give mulighed for at analysere bakterie-bakterier og mikrobiota-værtsinteraktioner med levende observation af dynamiske koloniserings- og migrationsprocesser i organismer50,51.
Begrænsninger af metoden
Dyrkning af GF-fisk fra unge til tidlige voksne (28 dpf-2,5 mpf) og seksuelt modne voksne (>2,5 mpf) er fortsat udfordrende på grund af øget dødelighed og risikoen for bakteriel kontaminering under modelvedligeholdelse. Disse begrænsninger skyldes primært manglen på egnede autokultursystemer til fisk, der lever i et GF-miljø. Disse systemer bør omfatte ren luft, vand og et fødevaresystem til effektivt at opretholde dyrene og deres miljø, hvilket sikrer fuldstændig isolering fra eksterne mikroorganismer. I modsætning til andre GF-dyremodeller som mus og kyllinger52 er det udfordrende at opnå GF-zebrafisk gennem anatomiske operationer fra CR-forældrene på grund af deres vandvaner og naturlige befrugtningsstil.
At behandle voksne dyr som fuldstændig blottet for tarmmikrobiota er også udfordrende. Mens antibiotikabehandling kan fremkalde en tilstand svarende til specifikke patogenfrie (SPF) dyr, der er kendetegnet ved en reduceret mikrobiota påvist i fækale prøver, er det fortsat vanskeligt at opnå ægte GF voksne fiskemodeller. De udfordringer, der er forbundet med at etablere og vedligeholde GF-modeller, især under overgangen fra ungdoms- til langsigtede stater, er betydelige. Betydningen af GF-afkom, såsom GF F1- eller F2-æg fra voksne GF-fisk, i mikrobiel forskning anerkendes. Det kræver imidlertid lang tid at overvinde udfordringer med at etablere og vedligeholde langsigtede voksne GF-fiskemodeller.
Det er værd at bemærke, at gnotobiotiske zebrafisk med specifik bakteriel kolonisering er blevet udviklet, hvilket viser kronisk overlevelse baseret på GF-modeller. Ikke desto mindre er det fortsat usikkert, om disse modeller kan tjene som levedygtige alternativer til GF-modeller i bakteriel infektion og biomedicinsk forskning.
Fremtidige anvendelser af GF fiskemodeller
I denne undersøgelse har vi forfinet protokollen til generering af GF-zebrafiskmodeller, der udvikler sig fra embryoner til unge. Dette fremskridt har betydelige anvendelser inden for udviklingsbiologi, immunologi, forskning i menneskelig sygdom og organogenese. Gennem masseisolering og identifikation undersøger undersøgelsen funktioner, mekanismer og tarmafledte metabolitter af enkelte bakteriestammer. Undersøgelsen involverer infektion af GF-zebrafiskmodeller, efter at udluftningen åbner trin47,53. Derudover letter mærkede bakterier med fluorescens observation af kolonisering og distribution i levende GF-larver, fri for andre mikrobielle påvirkninger54. Lignende GF-fiskemodeller, såsom marine eller ferskvands medaka, kan oprettes ved hjælp af sammenlignelige metoder med forskellige midler eller mellemstore ændringer.
For at undersøge humane sygdomsmekanismer anvender undersøgelsen FMT-metoder, der overfører prøver fra patienter eller donorer til raske dyr eller GF-modeller55. I modsætning til konventionelt opdrættede (CR) dyr tilbyder GF-modeller robust bevis for mikrobielle funktioner, påvirkninger eller reaktioner i værten, især når de kombineres med bakteriofager for at regulere målbakterier i mikrobiota46.
Sammenfattende tjener GF-zebrafisk som kraftfulde modeller til vurdering af bakteriel sikkerhed, lægemiddeleffektivitet, forurenende toksicitet eller sammensat interferens på grund af deres følsomme og rene tarmmiljø. Fremtidig udforskning af GF-fiskeapplikationer bør omfatte forskellige områder med behov for at skabe voksne GF-fiskemodeller for en dybere forståelse af mikrobielle funktioner på tværs af forskellige livsstadier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Protokollen for GF Artemia er blevet udstedt som et patent af China National Intellectual Property Administration, som vil lette den begrænsede brug af metoden efter at have fået tilladelse fra forfatterne. Forfatterne erklærer, at de ikke har andre konkurrerende eller økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker oprigtigt støtten fra Chongqing Medical University Talent Project (nr. R4014 til DSP og R4020 til PPJ), National Natural Science Foundation of China (NSFC, nr. 32200386 til PPJ), Chongqing Postdoctoral Innovation Mentor Studio (X7928 DSP) og Program for Kina-Sri Lanka Joint Center for Water Technology Research and Demonstration af Chinese Academy of Sciences (CAS) / Kina-Sri Lanka Joint Center for Education and Research af CAS.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB-GZM | Amphotericin:Solarbio; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio. | Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313. |
49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL). |
| 1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes | biosharp | BS-15-M | To collect samples, and hold agents |
| 2.4 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution. |
| 6-well plates, 24-, 48- well plates | LABSELECT | 11112 | To culture fish |
| Aeronomas | NCBI database | No.MK178499 | 2019-JPP-ESN |
| Anaerobic TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. |
The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system. |
| Anaerobic work station | GENE SCIENCE | E200G | Bacterial isolation, sterile testing |
| Analysis | GraphPad Prism 5 | v6.07 | To analysis the data |
| API 20 E kits | BioMerieux SA, France | No.1005915090 | Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism |
| Artemia (Brine shrimp) | Shangjia Aquarium Co., Ltd. | Aquamaster brand | Artemia cysts, and brine shrimp eggs |
| Auto cycle system for fish culture | Ningbo Hairui Technology Co., Ltd | No Cat | Maintain the fish |
| Autoclave | Zeal Way | G154DWS | Prepare the materials |
| BHI Aerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder. |
| BHI Anaerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system. |
| Biochemical incubator | LongYue Co., Ltd | SPX | For fish and plates |
| Biosafety cabinet | Haier | HR40-IIA2 | Sterile treatment and testing |
| Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water. |
| Blood plates | sheep blood:Solarbio | Cat. NO. TX0030 | Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates. |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | To culture fish |
| CM-Dil dyes | Molecular Probes | Cat#C7000 | To label the bacteria |
| Constant temperature shaking incubator | Peiving Co., Ltd | HZQ-X100 | Bacterial culture |
| Database | NCBI | Bacteria and Archaea database | Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/ |
| Disposable Pasteur pipette | biosharp | bs-xh-03l | Used to change water, and transfer eggs |
| Disposable petri dish | biosharp | BS-90-D | To culture fish |
| DNA kits | Solaribio | Cat#D1600 | Bacterial genomic DNA extraction kits |
| Electric pipette | SCILOGEX | Levo me | Change water |
| Exiguobacterium | NCBI database | No.MK178504 | 2019-JPP-ESN |
| GZM | Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd. | No Cat | Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L. |
| Laboratory pure water system | Hitech Co., Ltd | Prima-S15 | Prepare the agents |
| Microscope | Nikon | SMZ18 | With fluorescent light to observe fish larvae |
| PCR kits | TIANGEN | Cat#ET101 | Taq DNA Polymerase kit |
| Pipette | LABSELECT | sp-013-10 | Change water |
| Povidone iodine (PVP-I) | Aladdin | Lot#H1217005 | Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water. |
| Timing converter | PinYi Co., Ltd | AL-06 | To regulate the light |
| TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. |
TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder. |
| TSB Aerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; |
TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl. |
| TSB Anaerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; |
TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system. |
| Ultra-clean workbench | Airtech | SW-CJ-2FD | Sterile treatment and testing |
| Ultra-pure flow system for fish culture | Marine Biological Equipment company | No Cat | Produce water for fish |
| Vibrio | NCBI database | No.MK178501 | 2019-JPP-ESN |
References
- Sieber, M., Traulsen, A., Schulenburg, H., Douglas, A. E. On the evolutionary origins of host-microbe associations. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (9), e2016487118 (2021).
- Sommer, F., Backhed, F. The gut microbiota--masters of host development and physiology. Nat Rev Microbiol. 11 (4), 227-238 (2013).
- Kim, S., Jazwinski, S. M. The gut microbiota and healthy aging: A mini-review. Gerontology. 64 (6), 513-520 (2018).
- Milani, C., et al. The first microbial colonizers of the human gut: Composition, activities, and health implications of the infant gut microbiota. Microbiol Mol Biol Rev. 81 (4), e00036 (2017).
- De Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: Mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
- Shi, N., Li, N., Duan, X., Niu, H. Interaction between the gut microbiome and mucosal immune system. Mil Med Res. 4 (1), 14 (2017).
- Liu, B. N., Liu, X. T., Liang, Z. H., Wang, J. H.
- Aron-Wisnewsky, J., Warmbrunn, M. V., Nieuwdorp, M., Clément, K. Metabolism and metabolic disorders and the microbiome: The intestinal microbiota associated with obesity, lipid metabolism, and metabolic health-pathophysiology and therapeutic strategies. Gastroenterology. 160 (2), 573-599 (2021).
- Chen, Y. W., Zhou, J. H., Wang, L. Role and mechanism of gut microbiota in human disease. Front Cell Infect Microbiol. 11, 625913 (2021).
- Hao, W. Z., Li, X. J., Zhang, P. W., Chen, J. X. A review of antibiotics, depression, and the gut microbiome. Psychiatry Res. 284, 112691 (2020).
- Nadal, A. L., et al. gut immunity: Using the zebrafish model to understand fish health. Front Immunol. 11, 114 (2020).
- Asadi, A., et al. Obesity and gut-microbiota-brain axis: A narrative review. J Clin Lab Anal. 36 (5), e24420 (2022).
- Mlynarska, E., et al. The role of the microbiome-brain-gut axis in the pathogenesis of depressive disorder. Nutrients. 14 (9), 1921 (2022).
- Yu, Y. J., Raka, F., Adeli, K. The role of the gut microbiota in lipid and lipoprotein metabolism. J Clin Med. 8 (12), 2227 (2019).
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. J Microbiol Biotechnol. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Melancon, E., et al. Best practices for germ-free derivation and gnotobiotic zebrafish husbandry. Methods Cell Biol. 138, 61-100 (2017).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods Mol Biol. 1438, 123-135 (2016).
- Wang, X. N., Wu, C. W., Wei, H. Humanized germ-free mice for investigating the intervention effect of commensal microbiome on cancer immunotherapy. Antioxid Redox Signal. 37 (16), 1291-1302 (2022).
- Jia, P. P., et al. Role of germ-free animal models in understanding interactions of gut microbiota to host and environmental health: A special reference to zebrafish. Environ Pollut. 279, 116925 (2021).
- Gootenberg, D. B., Turnbaugh, P. J. Companion animals symposium: Humanized animal models of the microbiome. J Anim Sci. 89 (5), 1531-1537 (2011).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Kamareddine, L., Najjar, H., Sohail, M. U., Abdulkader, H., Al-Asmakh, M. The microbiota and gut-related disorders: Insights from animal models. Cells. 9 (11), 2401 (2020).
- Rogala, A. R., Oka, A., Sartor, R. B. Strategies to dissect host-microbial immune interactions that determine mucosal homeostasis vs. Intestinal inflammation in gnotobiotic mice. Front Immunol. 11, 214 (2020).
- Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4596-4601 (2004).
- Bates, J. M., et al. Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation. Dev Biol. 297 (2), 374-386 (2006).
- Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
- Xia, H., et al. Zebrafish: An efficient vertebrate model for understanding role of gut microbiota. Mol Med. 28 (1), 161 (2022).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: Staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nat Protoc. 3 (12), 1862-1875 (2008).
- Shan, Y., et al. Immersion infection of germ-free zebrafish with listeria monocytogenes induces transient expression of innate immune response genes. Front Microbiol. 6, 373 (2015).
- Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. A. Zebrafish axenic larvae colonization with human intestinal microbiota. Zebrafish. 15 (2), 96-106 (2018).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, danio rerio: A staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
- Clift, D., Richendrfer, H., Thorn, R. J., Colwill, R. M., Creton, R. High-throughput analysis of behavior in zebrafish larvae: Effects of feeding. Zebrafish. 11 (5), 455-461 (2014).
- Nascimento, M. D., Schorer, M., Dos Santos, J. C. E., Rocha, M. S. A., Pedreira, M. M. Live and frozen Artemia nauplii for catfish (steindachner, 1876) larvae in different salinities. Trop Anim Health Prod. 52 (2), 653-659 (2020).
- Jia, P. P., et al. Breaking the mold: The first report on germ-free adult marine medaka (oryzias melastigma) models. bioRxiv. , (2023).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. JoVE. (69), e4196 (2012).
- Wilson, C.
- Aleström, P. a-O., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C.
- Nursyirwani, N., et al. Phenotype and genotype of lactic acid bacteria (lab) isolated from the tiger grouper Epinephelus fuscoguttatus alimentary tract. F1000Res. 6, 1984 (2017).
- Karolenko, C., Desilva, U., Muriana, P. M. Microbial profiling of biltong processing using culture-dependent and culture-independent microbiome analysis. Foods. 12 (4), 844 (2023).
- Jia, P. P., et al. Chronic exposure to graphene oxide (go) induced inflammation and differentially disturbed the intestinal microbiota in zebrafish. Environ Sci Nano. 6 (8), 2452-2469 (2019).
- Sun, B. L., et al. Probiotic supplementation mitigates the developmental toxicity of perfluorobutanesulfonate in zebrafish larvae. Sci Total Environ. 799, 149458 (2021).
- Qian, H. F., Liu, G. F., Lu, T., Sun, L. W. Developmental neurotoxicity of microcystis aeruginosa in the early life stages of zebrafish. Ecotoxicol Environ Saf. 151, 35-41 (2018).
- Bertotto, L. B., Catron, T. R., Tal, T. Exploring interactions between xenobiotics, microbiota, and neurotoxicity in zebrafish. Neurotoxicology. 76, 235-244 (2020).
- Jia, P. P., et al. Bacteriophage-based techniques for elucidating the function of zebrafish gut microbiota. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (7-8), 2039-2059 (2023).
- Xin, G. Y., et al. Gut bacteria vibrio sp. And aeromonas sp. Trigger the expression levels of proinflammatory cytokine: First evidence from the germ-free zebrafish. Fish Shellfish Immunol. 106, 518-525 (2020).
- Dremova, O., et al. Sterility testing of germ-free mouse colonies. Front Immunol. 14, 1275109 (2023).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, danio rerio: A gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Rolig, A. S., Parthasarathy, R., Burns, A. R., Bohannan, B. J. M., Guillemin, K. Individual members of the microbiota disproportionately modulate host innate immune responses. Cell Host Microbe. 18 (5), 613-620 (2015).
- Stressmann, F. A., et al. Mining zebrafish microbiota reveals key community-level resistance against fish pathogen infection. ISME J. 15 (3), 702-719 (2021).
- Guitton, E., et al. Production of germ-free fast-growing broilers from a commercial line for microbiota studies. JoVE. (160), e61148 (2020).
- Rea, V., Bell, I., Ball, T., Van Raay, T. Gut-derived metabolites influence neurodevelopmental gene expression and wnt signaling events in a germ-free zebrafish model. Microbiome. 10 (1), 132 (2022).
- Russo, P., et al. Zebrafish gut colonization by mcherry-labelled lactic acid bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 99 (8), 3479-3490 (2015).
- Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Ley, R. E., Gordon, J. I. Reciprocal gut microbiota transplants from zebrafish and mice to germ-free recipients reveal host habitat selection. Cell. 127 (2), 423-433 (2006).
