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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Génération, maintenance et identification de modèles de poissons-zèbres exempts de germes, des larves aux stades juvéniles

Published: April 12, 2024 doi: 10.3791/66512
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1School of Public Health, Chongqing Medical University

Summary

Ce protocole décrit les principales étapes à suivre pour obtenir des embryons de poissons exempts de germes (GF) et les maintenir depuis l’état larvaire jusqu’au stade juvénile, y compris l’échantillonnage et la détection de leur statut stérile. L’utilisation de modèles GF avec infection est importante pour comprendre le rôle des microbes dans la santé de l’hôte.

Abstract

Les poissons-zèbres servent de modèles précieux pour la recherche sur la croissance, l’immunité et le microbiote intestinal en raison de leurs similitudes génomiques avec les mammifères, de leurs embryons transparents développés dans un environnement de chorion relativement propre et du développement extrêmement rapide des larves par rapport aux modèles de rongeurs. Les poissons-zèbres exempts de germes (Danio rerio) sont essentiels pour évaluer la toxicité des polluants et établir des modèles de maladies similaires à celles de l’homme liées aux fonctions microbiennes. Par rapport aux modèles élevés de manière conventionnelle (RC) (poissons en élevage commun), le poisson-zèbre GF permet une manipulation plus précise du microbiote de l’hôte, aidant à déterminer la relation de cause à effet entre les micro-organismes et les hôtes. Par conséquent, ils jouent un rôle essentiel dans l’avancement de notre compréhension de ces relations. Cependant, les modèles de poisson-zèbre GF sont généralement générés et étudiés au cours des premiers stades de la vie (de l’embryon à la larve) en raison des limitations de la fonction immunitaire et de l’absorption des nutriments. Cette étude optimise la génération, la maintenance et l’identification des premiers modèles de poissons-zèbres GF sans alimentation et avec une alimentation à long terme avec des aliments GF (tels que Artemia sp., artémias ). Tout au long du processus, des échantillonnages et des cultures quotidiens ont été effectués et identifiés grâce à de multiples détections, y compris des plaques et le séquençage de l’ARNr 16S. Le taux d’asepsie, la survie et les indices de développement du poisson-zèbre GF ont été enregistrés pour garantir la qualité et la quantité des modèles générés. Il est important de noter que cette étude fournit des détails sur les techniques d’isolement bactérien et d’infection des poissons GF, permettant la création efficace de modèles de poissons GF des larves aux stades juvéniles avec un soutien alimentaire GF. En appliquant ces procédures dans la recherche biomédicale, les scientifiques peuvent mieux comprendre les relations entre les fonctions bactériennes intestinales et la santé de l’hôte.

Introduction

Le microbiote (c’est-à-dire les archées, les bactéries, les eucarya et les virus) joue un rôle crucial dans le maintien de la santé de l’hôte et contribue au développement de diverses maladies en influençant les processus physiologiques et pathologiques par le biais d’interactions symbiotiques au sein de la barrière intestinale, de la surface épithéliale et des fonctions de la mucine chez les individus 1,2,3. La composition du microbiote à travers les différents stades de la vie, de la petite enfance à la jeunesse, à l’âge adulte et au vieillissement, ainsi que sa présence à divers endroits tels que les narines, la bouche, la peau et les intestins, sont façonnées de manière dynamique par divers habitats et environnements4. Le microbiote intestinal dans les organismes est impliqué dans l’absorption des nutriments, la réponse immunitaire, l’invasion d’agents pathogènes, la régulation métabolique, etc. 5,6. Des études sur des patients ont démontré que les perturbations du microbiote intestinal sont liées à l’obésité humaine, aux troubles du sommeil, à la dépression, aux maladies inflammatoires de l’intestin (MICI), aux maladies neurodégénératives (Parkinson, Alzheimer), au vieillissement et à divers cancers 7,8,9. De plus, les voies interactives entre le microbiote intestinal et les hôtes impliquent des facteurs inflammatoires, des neurotransmetteurs, des métabolites, la barrière intestinale et le stress oxydatif, comme observé dans des recherches antérieures utilisant des modèles de souris et de poissons10,11.

Récemment, de multiples approches ou thérapies liées aux bactéries, y compris des probiotiques potentiels et la transplantation de microbiote fécal (FMT), ont été explorées pour ces troubles dans des modèles cliniques et animaux. Ces explorations sont basées sur des découvertes liées à l’axe microbiote-intestin-cerveau/foie/rein, aux produits dérivés du microbiote et à l’activité altérée des récepteurs12,13. Cependant, le développement, les diverses fonctions et les mécanismes du système microbiote-hôte sont encore incomplètement compris et identifiés en raison de la complexité de la communauté microbienne et du défi de générer de puissants modèles de maladies semblables à celles de l’homme.

Pour résoudre ces problèmes, des modèles animaux exempts de germes (GF) ont été proposés d’urgence au milieu du 19e siècle et principalement développés au cours du 20e siècle. Des améliorations ultérieures, y compris des modèles traités aux antibiotiques et gnotobiotiques, ainsi que des progrès dans les technologies de détection et d’observation microbiennes, ont perfectionné ces modèles 14,15,16. Les animaux GF, créés en effaçant leur propre arrière-plan et en évitant les microbes environnementaux, offrent une excellente stratégie pour explorer les interactions entre les micro-organismes et leurs hôtes17. Grâce à l’application de modèles animaux et de protocoles affinés, les chercheurs ont réussi à reproduire des compositions microbiennes similaires trouvées chez des patients chez des souris et des poissons GF. De plus, d’autres modèles d’animaux GF, tels que les chiens, les poulets et les porcs, offrent diverses options en tant que sujets de recherche 18,19,20,21. Cette approche a permis d’étudier les effets thérapeutiques potentiels des microbiomes commensales sur diverses maladies, y compris l’immunothérapie du cancer chez l’homme16,18. Les modèles GF offrent des informations plus précises sur les caractéristiques et les mécanismes de la colonisation, de la migration, de la multiplication et de l’interaction bactériennes spécifiques au sein des hôtes. Cela fournit de nouvelles informations cruciales sur l’apparition et le développement des maladies liées au microbiote22,23. L’histoire de l’établissement et de l’application du poisson-zèbre GF dans la recherche microbienne a évolué depuis les rapports de Rawls et al. en 2004 et de Bates et al. en 2006 jusqu’au protocole de Melancon et al. en 2017 16,24,25. Cependant, la faisabilité de modèles de GF adultes ou reproducteurs est encore un processus prolongé, accompagné d’une longévité, de taux de réussite et de problèmes de santé variables.

Parmi les différents modèles animaux, le poisson-zèbre (Danio rerio) se distingue comme un outil essentiel pour la recherche fondamentale et biomédicale en raison de sa similitude avantageuse avec les organes humains et la génomique, de son cycle de développement court, de sa fécondité élevée et de ses embryons transparents19,26. Les poissons-zèbres, qui servent de modèles fiables de maladies humaines, offrent une représentation visuelle des processus physiologiques et pathologiques in vivo, donnant un aperçu des caractéristiques attrayantes des interactions hôte-microbe. Notamment, les poissons-zèbres présentent des lignées cellulaires distinctes, permettant l’imagerie de la physiologie intestinale, de la dynamique microbienne, des gonades et du développement reproducteur, de la maturation du système immunitaire de l’hôte, du comportement et dumétabolisme27. Les embryons de poisson-zèbre se développent dans des chorions protecteurs jusqu’à l’éclosion, devenant des larves 3 jours après la fécondation (dpf). Ils chassent activement pour se nourrir à 5 dpf et atteignent la maturité sexuelle environ 3 mois après la fécondation (mpf)28. Le premier poisson-zèbre sans germes (GF) réussi, rapporté par Rawls et al.24, a montré que les larves nourries avec de la nourriture autoclavée après absorption du vitellus présentaient une nécrose tissulaire à partir de 8 dpf et une mort totale à 20 dpf. Cela a révélé les effets de l’alimentation ou l’importance de tenir compte de l’apport exogène en nutriments dans les expériences impliquant des poissons SG à long terme (>7 dpf)29. Des études ultérieures ont amélioré le protocole de génération des poissons GF, en utilisant des aliments stériles et des méthodes perfectionnées dans différents modèles de poissons16.

Cependant, la plupart des recherches sur les modèles de poissons-zèbres GF se sont concentrées sur les premiers stades de la vie, impliquant une infection bactérienne à 5 dpf pendant 24 h à 48 h, avec des échantillons collectés avant 7 dpf à la fin des expériences 25,30,31. Il est largement reconnu que le microbiote des organismes, y compris les humains et les poissons-zèbres, est colonisé au début de la vie et façonné au cours de la croissance et du développement. La composition reste stable aux stades adultes, les rôles du microbiote chez l’hôte étant cruciaux tout au long de la vie, en particulier dans les aspects du vieillissement, des maladies neurodégénératives, métaboliques et des maladies intestinales3. Ainsi, les perspectives d’animaux GF ayant une survie plus longue peuvent donner un aperçu des mécanismes des rôles microbiens dans le développement et les fonctions des organes de l’hôte, compte tenu des systèmes immunitaires et reproducteurs immatures des larves de poissons au début de la vie. Alors que des souches bactériennes dans les intestins du poisson-zèbre ont été isolées et identifiées dans des études antérieures, offrant le potentiel d’infecter des modèles animaux GF pour sélectionner des probiotiques ou rechercher les fonctions bactériennes chez l’hôte19,25, la génération et l’application de modèles de poissons GF ont été principalement limitées aux premiers stades de la vie. Cette limitation, attribuée à la complexité du processus de production, aux coûts d’entretien élevés et aux problèmes associés à l’alimentation et à l’immunité, entrave les efforts de recherche visant à étudier les effets développementaux et chroniques du microbiote chez l’hôte.

Le taux de survie, le comportement, la croissance, la maturation et la santé globale des poissons, en particulier dans les modèles sans germes (GF), sont significativement influencés par les pratiques alimentaires, englobant l’apport nutritionnel et l’absorption pendant la période d’ouverture de la bouche, des larves précoces aux juvéniles32,33. Cependant, l’un des défis de l’élevage des poissons GF est la rareté des régimes stériles appropriés, ce qui limite l’efficacité du soutien nutritionnel pour soutenir la croissance et la survie des larves. La résolution de ce problème est cruciale pour restaurer la vie des poissons GF, compte tenu de leurs mécanismes de défense développementaux et de leurs faibles capacités de digestion dues à l’absence de microbiome intestinal. En termes de nourriture, les artémias vivants (Artemia sp.) apparaissent comme le régime alimentaire le plus approprié pour les larves à bouche ouverte comme pour les poissons juvéniles. Il a été observé que les poissons nourris avec des artémias vivants présentent des taux de croissance et de survie plus élevés que ceux nourris avec du jaune d’œuf cuit ou d’autres appâts naturels et synthétiques34. Bien que les modèles précoces de poissons GF puissent survivre avec le soutien du vitellin et que les modèles de larves GF puissent être maintenus avec une alimentation stérile, il reste difficile de générer des modèles à long terme des larves aux juvéniles et d’atteindre la maturité sexuelle. De plus, les aliments en flocons ou en poudre sont limités par une composition nutritionnelle inégale et peuvent avoir un impact sur la qualité de l’eau. En revanche, les artémias vivants présentent des avantages tels que la survie en eau salée et douce, une petite taille adaptée aux larves aux adultes, une facilité de dosage et une qualité d’éclosion supérieure35. En nous appuyant sur les méthodes précédentes 16,24,30, nous avons simplifié le processus de traitement complexe et relevé le défi de l’alimentation en établissant des Artemia sp. vivants sans gluten facilement incubés comme nourriture stérile pendant de plus longues durées que les poissons sans gluten en début de vie.

Cette étude présente un protocole optimisé couvrant (1) la génération, (2) l’entretien, (3) l’identification du taux de stérileté, et (4) l’entretien et l’alimentation pour assurer la croissance du poisson-zèbre sans germes (GF) de l’embryon au stade larvaire et juvénile. Les résultats offrent des preuves préliminaires sur l’éclosion, la survie, la croissance et la stérilité du poisson-zèbre GF, ainsi que des indices essentiels pour GF Artemia sp. en tant qu’aliment stérile. Les étapes détaillées de la génération de modèles et de la préparation d’aliments vivants stériles fournissent un soutien technique crucial pour la construction et l’application de modèles à long terme de poissons GF, ainsi que GF Artemia sp. dans la recherche sur l’interaction microbiote-hôte. Le protocole aborde l’isolement, l’identification et l’infection bactériennes sur des modèles de poissons GF, en décrivant les méthodes de marquage par fluorescence bactérienne et en observant leur colonisation dans les intestins des poissons au microscope. Les poissons GF, les poissons gnotobiotiques atteints d’une infection bactérienne ou les modèles de microbiote humain transférés subiront diverses détections pour élucider leurs fonctions et leurs effets sur l’immunité de l’hôte, la digestion, le comportement, la régulation transcriptomique et les aspects métaboliques. À long terme, ce protocole peut être étendu à différentes espèces de poissons sauvages, comme le medaka marin, et potentiellement à d’autres lignées de poissons-zèbres transgéniques sélectionnées corrélées à des tissus ou à des maladies spécifiques.

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Protocol

Les expériences sur les poissons ont été menées conformément aux directives du Comité de protection et d’utilisation des animaux de Chongqing et du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine de Chongqing, en Chine, ainsi qu’aux normes pour les animaux de laboratoire publiées par le Bureau d’État de la qualité et de la supervision technique (ID d’approbation : GB14922-2001 à GBT14927-2001). Les poissons-zèbres (Danio rerio, type sauvage, souche AB) proviennent de l’Institut d’hydrobiologie de l’Académie chinoise des sciences et sont conservés en laboratoire selon les procédures précédemment rapportées36.

1. Entretien du poisson-zèbre adulte et collecte d’embryons

REMARQUE : S’appuyant sur les modifications apportées aux études et rapports précédents 16,37,38,39, le maintien du poisson zèbre adulte, l’élevage des larves et les pratiques pour les modèles sans germes (GF) dans notre laboratoire ont été effectués en suivant les étapes décrites ci-dessous. Le système d’écoulement ultra-pur pour la pisciculture a été obtenu commercialement (voir le tableau des matériaux). L’eau, maintenue avec un pH équilibré, du sel et des alcalis, subit une filtration pendant le cyclisme pour assurer des conditions propres.

  1. Maintenir les poissons adultes selon la procédure standard suivante dans le système de cycle automatique (voir le tableau des matériaux) avec une photopériode de l’obscurité : lumière = 10 h : 14 h à 28 °C ± 0,5 °C et nourris avec des Artemia sp fraîchement incubés. deux fois par jour.
  2. Mettez le poisson-zèbre adulte sexuellement mature (mâle : femelle = 2:1) dans des bassins avec de l’eau fraîche et propre la nuit précédente.
  3. Laissez les poissons frayer le lendemain matin (vers 8 h 30) sous une stimulation lumineuse régulière en laboratoire. Après 1-2 h, transférez le poisson dans un autre réservoir.
  4. Prélever des embryons dans l’eau à partir du système d’autocyclage comme milieu d’élevage dans une boîte de culture à l’aide d’une pipette Pasteur jetable.

2. Génération de poisson-zèbre GF de l’embryon à la larve

REMARQUE : La procédure de génération de poissons exempts de germes (GF) est décrite à la figure 1, tandis que les indices de développement de base des modèles conventionnels (CR) et GF sont présentés à la figure supplémentaire 1. Veuillez suivre les étapes décrites ci-dessous dans une enceinte de sécurité biologique de paillasse ou une hotte à flux laminaire en utilisant une technique aseptique stérile dans une salle blanche.

  1. Lavez les embryons avec l’eau de la pisciculture et retirez les excréments, les impuretés et les œufs morts ou non fécondés.
  2. Transférez les embryons à 2 hpf dans des plaques stérilisées (jusqu’à 480 embryons par boîte stérile de 10 cm de diamètre) remplies d’une solution de poisson-zèbre sans germes d’antibiotiques (AB-GZM, voir tableau des matériaux) et cultivez à 28,5 °C pendant 6 à 8 h.
    REMARQUE : AB-GZM est utilisé pour traiter les embryons pendant plusieurs heures afin d’éliminer les micro-organismes de surface, et GZM sans antibiotiques est utilisé pour élever des poissons GF en sous-séquence. Habituellement, le temps de culture perfectionné est de 6 h).
  3. Excluez les œufs avec des taches blanches ou un aspect blanchâtre, et sélectionnez ceux qui sont normalement développés, affichant des enveloppes transparentes et intactes pour un traitement ultérieur.
  4. Rincez les embryons à l’aide d’AB-GZM trois fois en 10 minutes.
  5. Faire tremper les embryons dans une solution de povidone iodée de 0,2 g/L (PVP-I) pendant 1 min (voir le tableau des matières).
    REMARQUE : Une concentration plus élevée et plus de 2 minutes influencera le taux de mort et d’éclosion des embryons.
  6. Lavez les embryons à l’aide d’un milieu de poisson-zèbre exempt de germes (GZM) trois fois en 10 minutes.
  7. Ajouter les embryons dans la solution de travail d’hypochlorite de sodium (NaClO), couvrir hermétiquement les tubes de microcentrifugation de 50 ml et blanchir pendant 15 min. Pendant cette période, suspendez les embryons dans une solution d’eau de Javel en les secouant doucement.
  8. Lavez les embryons à l’aide de GZM trois fois en 10 minutes.
  9. Transférez les embryons dans des plaques stériles à 6 puits contenant 5 embryons et 10 mL de GZM par puits. Cultivez-les dans une plate-forme ou un incubateur ultra-propre avec une photopériode d’obscurité : lumière = 10 h : 14 h à 28 °C ± 0,5 °C. La densité de culture influencera le taux de stérileté.
  10. Renouveler le milieu de culture tous les jours en retirant le GZM épuisé, en le prélevant sous forme d’échantillons pour la détection de l’état stérile et en réapprovisionnant chaque puits avec le même volume de GZM stérile.
  11. Enregistrer les indices de développement de base des embryons/larves GF, y compris le taux de survie, le taux d’éclosion, les battements cardiaques, la longueur et le poids du corps, etc.19.
  12. Transférez les poissons GF dans des récipients appropriés (plats, flacons de culture cellulaire ou bouteilles en verre avec couvercle) avec un volume élargi, fournissant une nourriture stérile tout au long du processus de croissance.

3. Maintien du poisson-zèbre GF de la larve à la juvénile

  1. Renouveler le GZM sans alimentation avant 7 dpf et détecter quotidiennement les états stériles (voir étape 5).
  2. Nourrir les larves de poisson-zèbre de 8 dpf aux stades juvéniles avec du jaune d’œuf stérile (10 μL de solution mère préparée par puits) une fois par jour avant de changer de GZM.
  3. Nourrissez les juvéniles GF à partir de 14 dpf avec du jaune d’œuf stérilisé mélangé à GF Artemia sp. une fois par jour (1-3 artémias/larves, voir étape 4), en augmentant progressivement la masse alimentaire avec la croissance et le développement des poissons GF.
  4. Fournissez du jaune d’œuf jusqu’à ce que tous les poissons puissent consommer des nauplies d’Artemia.
    REMARQUE : GF Artemia doit subir un test de stérilité avant utilisation. Évaluez le nombre de nauplii d’Artemia restants, observez la poursuite et la progression de la capture, et examinez le corps du poisson avec la nourriture consommée pour indiquer le succès de l’alimentation.
  5. De 28 dpf aux premiers stades adultes, nourrir GF Artemia une fois par jour (3 à 5 artémias/larves) et nettoyer les artémias inexploités ou morts, ainsi que les poissons morts dans les déchets GZM en tant qu’échantillons quotidiens.
  6. Pendant la croissance des poissons GF, changez les plaques à 6 puits après 7 dpf en plaques stériles ou en flacons de culture cellulaire de 8 à 21 dpf, puis en bouteilles stériles après 21 dpf. Augmentez le milieu de culture et la masse alimentaire en fonction du nombre et du poids de poissons SG dans chaque récipient.
  7. Renouvelez GZM tous les jours et vérifiez les échantillons pour assurer le succès des modèles GF.
    REMARQUE : Il est difficile de maintenir des modèles de poissons exempts de germes (GF) jusqu’au début de l’âge adulte et de la maturité sexuelle, avec un faible taux de survie moyen à 30 dpf, généralement inférieur à 10 %. Ceci est principalement attribué à une immunité faible, un développement retardé et une fonction intestinale altérée.

4. Préparation de nauplii d’Artemia GF comme aliment stérile pour les modèles de poissons GF chroniques

REMARQUE : La méthode de culture et de préparation de l’artémia sans germes (GF) est décrite à la figure 2. Notez que toutes les étapes suivantes sont effectuées dans une enceinte de sécurité biologique de paillasse, à l’aide d’une technique aseptique stérile.

  1. Rincer 0,25 g de kystes d’Artemia avec 2,4 g/L d’hypochlorite de sodium (NaClO, voir le tableau des matières) pendant 5 min.
  2. Filtrez les kystes d’Artemia rincés avec un filtre ultra-dense stérilisé (environ 170 mailles d’ouverture) et lavez-les trois fois avec de l’eau ultrapure stérilisée, chaque fois pendant 1 à 2 min.
  3. Transvasez les kystes d’artémias lavés dans 100 ml d’eau saline stérilisée à 2,5 %, mélangez et emballez pour l’éclosion aseptique selon les étapes mentionnées ci-dessous.
  4. Emballez la solution de mélange de kystes d’artémie traitée de 50 ml dans un flacon stérile d’un volume de 100 ml, fermez-le avec un film et incubez dans un incubateur à agitation à 150 tr/min, 30 °C pendant 18 h à 24 h avec de la lumière.
  5. Extraire environ 30 mL de nauplii d’Artemia à éclosion des couches intermédiaire et inférieure à l’aide d’une pipette Pasteur jetable.
    REMARQUE : Empêchez les œufs flottants et les coquilles vides d’atteindre la couche supérieure. Les indices de kystes d’artémias exempts de germes (GF) et de nauplii incubés pendant 24 h sont présentés à la figure 3.
  6. Filtrez les Artemia avec un filtre stérilisant et lavez-les dans un bécher stérilisant avec de l’eau ultrapure stérilisante trois fois, environ 30 s à 1 min pour chaque fois. Enfin, ajoutez 4 mL d’eau ultrapure stérilisée pour préparer la solution mixte d’Artemia .
  7. À l’aide d’une pipette Pasteur jetable, prélever les artémias nageant activement dans la couche supérieure, laver et préparer la solution de nauplii pour l’alimentation et l’identification aseptique.

5. Identification de modèles de poissons GF à tous les stades de la vie

REMARQUE : Tout au long des étapes de la vie des poissons exempts de germes (GF), les indices clés et les détections quotidiennes d’échantillons sont cruciaux pour assurer le succès des modèles. Cette étape résume la classification commune des échantillons et les méthodes habituelles d’identification (figure 4).

  1. Observez et comptez quotidiennement l’état de survie et le taux de larves de poisson-zèbre GF. Dans les expériences calculant les taux associés, les poissons GF sont élevés dans des plaques de 24 ou 48 puits avec un poisson par puits.
    1. Taux de survie = (nombre de poissons vivants au moment de l’observation / nombre total d’œufs) × 100%.
    2. Taux de stérilité = (nombre de poissons stériles/nombre de poissons survivants) × 100%.
      REMARQUE : Ce protocole met l’accent sur le taux de stérilité des poissons vivants. Le nombre de poissons stériles est déterminé en comptant les poissons GF réussis après plusieurs vérifications parmi les poissons vivants. Tous les modèles de GF de poissons morts ou de poissons vivants qui ont échoué en raison de la présence de bactéries sont éliminés lors des procédures GF ultérieures.
  2. Prélevez les échantillons suivants de larves de poisson-zèbre GF.
    1. Milieu de culture de poisson-zèbre GF à partir de chaque puits ou récipient de bouteille.
    2. Aliments pour poissons, tels que le jaune d’œuf stérile et l’artémia GF.
    3. Milieu de déchets, y compris des fragments de membrane d’œuf après l’éclosion et des résidus de nourriture ou des matières fécales pendant les périodes d’alimentation, des larves aux poissons juvéniles.
    4. Échantillons de poissons morts pour identifier la présence de bactéries.
    5. Milieu de poisson et agents utilisés dans le traitement des embryons comme contrôle stérile.
    6. Échantillons de matériaux, de plate-forme d’exploitation, d’incubateur, etc.
  3. Détectez les échantillons collectés quotidiennement à l’aide de plusieurs méthodes.
    1. Tout d’abord, utilisez la méthode des plaques d’épandage et des plaques de culture dans un incubateur à 30 °C.
      1. Enduire avec 20 à 50 μL d’échantillon de déchet sur la plaque de gélose de soja trypticase (voir le tableau des matériaux) dans des conditions aérobies.
      2. Enduire avec 20 à 50 μL d’échantillon de déchet sur la plaque TSA dans des conditions anaérobies.
      3. Enduire avec 20 à 50 μL d’échantillon de déchets sur les plaques de TSA de sang (voir le tableau des matériaux) dans des conditions aérobies.
      4. Enduire avec 20 à 50 μL d’échantillon de déchets sur les plaques de TSA de sang dans des conditions anaérobies.
    2. Deuxièmement, utilisez la méthode de culture liquide.
      1. Prélever 200 μL d’échantillon dans des tubes aérobies avec un milieu de bouillon d’infusion Cerveau-Cœur (BHI) (voir le tableau des matériaux) et cultiver dans l’incubateur à agitation à 30 °C, 150-180 tr/min.
      2. Ajouter 200 μL d’échantillon dans des tubes anaérobies avec un milieu BHI et la culture dans l’incubateur à 30 °C.
      3. Ajouter 200 μL d’échantillon dans des tubes aérobies avec du bouillon de soja à la trypticase (TSB), puis cultiver dans l’incubateur à agitation à 30 °C, 150-180 tr/min.
      4. Ajouter 200 μL d’échantillon dans des tubes anaérobies avec un milieu TSB et cultiver dans l’incubateur à 30 °C.
    3. Troisièmement, utilisez des techniques moléculaires - test de réaction en chaîne par polymérase (PCR) 16s.
      1. Analysez l’échantillon d’eaux usées à l’aide de deux paires d’amorces 27F et 1492R, ainsi que 63F et 1387R (tableau 1).
        REMARQUE : Le mélange maître PCR a été préparé conformément au tableau 2 à l’aide d’un kit d’ADN polymérase disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux), et l’appareil de PCR a été configuré selon le programme spécifié dans le tableau 3.
      2. Une fois le programme de PCR terminé, examiner les produits par électrophorèse sur gel d’agaroseà 1 % 40 à des bandes cibles de 1465 pb (à l’aide des amorces 27F et 1492R) ou de 1324 pb (à l’aide des amorces 63F et 1387R) pour déduire la stérilité des échantillons.
  4. Enregistrer et observer les tests de stérilité, y compris la culture sur plaque et sur milieu de 24 h à 3 jours et 7 jours, au cours desquels aucune colonie sur plaque et aucune turbidité dans le liquide indiquent la construction réussie des modèles GF. Observer et consigner la plaque et le support à 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h et 168 h.

6. Identification des échantillons d’artémias GF avant de se nourrir de poissons GF

REMARQUE : Pour détecter les échantillons d’artémias GF, qui sont indispensables comme nourriture vivante avant de se nourrir de poissons GF (figure 4), suivez les étapes ci-dessous.

  1. Collectez des échantillons de modèles GF Artemia .
    1. Kystes d’artémias non traités.
    2. Kystes d’artémia GF traités.
    3. GF Artemia nauplii éclos.
    4. Eau ultrapure stérilisée comme contrôle.
  2. Détectez l’artémie GF avec les méthodes suivantes.
    1. Utilisez la méthode de l’étalement des plaques pour détecter les échantillons en les enrobant sur des plaques TSA et des plaques TSA sanguines dans des conditions aérobies et anaérobies. Incuber à 30 °C.
    2. Utilisez un milieu liquide pour détecter les échantillons dans les tubes aérobies et anaérobies TSB et BHI. Culture dans un agitateur à 150-180 tr/min, 30 °C.
    3. Utiliser le test PCR pour détecter la présence de bactéries dans les échantillons prélevés à l’aide des amorces des gènes cibles de l’ARN ribosomique 16s 27F et 1492R, 63F et 1387R (tableau 1). Le volume et le programme sont indiqués dans les tableaux 2 et 3.
  3. Enregistrer les résultats : Détecter le produit de PCR par électrophorèse sur gel d’agarose à 1 %40 pour les bandes cibles mesurant 1465 pb (avec les amorces 27F et 1492R) ou 1324 pb (avec les amorces 63F et 1387R). Les résultats des plaques et du milieu liquide peuvent garantir le statut stérile des artémias GF avant d’être utilisés comme nourriture pour poissons GF.

7. Isolement et identification de souches bactériennes intestinales de poisson-zèbre

REMARQUE : Pour explorer les fonctions intestinales in vitro et in vivo, il est nécessaire d’isoler les souches bactériennes du poisson-zèbre, qui fournissent également la source de probiotiques potentiels dépistés par infection à l’aide d’animaux GF (Figure 5). Dans ce protocole, nous décrivons la méthode de dissection traditionnelle pour obtenir le contenu intestinal, tandis que les échantillons peuvent également être prélevés directement sur des poissons anesthésiés vivants (données non présentées).

  1. Choisissez des poissons-zèbres adultes en bonne santé et lavez-les à l’eau stérile. Effectuez les étapes suivantes sur le banc propre.
  2. Anesthésier le poisson avec 100 mg/L de MS-222 pendant 5 à 10 min.
  3. Utilisez de l’alcool à 75 % pour traiter la surface du corps du poisson.
  4. Disséquez les intestins des poissons et extrudez le contenu intestinal avec un milieu TSB ou BHI.
  5. Incuber le surnageant intestinal en appliquant du TSA, une plaque de sang, du TSB et un milieu BHI dans des conditions aérobies et anaérobies.
  6. Traduisez les bactéries pour obtenir la souche signal et enregistrer les caractéristiques des différentes colonies.
  7. Stockez les bactéries dans un rayon de glycérol de 30 % à -80 °C.
  8. Ensuite, identifiez les bactéries intestinales par extraction d’ADN génomique et séquençage par PCR.
    REMARQUE : Les principales étapes de l’extraction de l’ADN génomique bactérien comprennent la centrifugation liquide, la dissociation de la RNase A et de la protéase K, l’extraction de l’alcool éthylique, le rinçage et la dissolution à l’aide de kits disponibles dans le commerce en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
  9. Analysez les séquences 16S à l’aide du National Center for Biotechnology Information (NCBI) et de l’outil de recherche d’alignement local de base (BLAST) avec la base de données Bacteria and Archaea40,41 (voir la table des matériaux).
  10. Choisissez les bactéries et les caractères les mieux adaptés pour identifier les souches intestinales isolées au niveau du genre.
  11. Détecter les fonctions métaboliques des souches bactériennes à l’aide de kits disponibles dans le commerce (voir le tableau des matériaux).

8. Marquage grippal, infection et colonisation de bactéries dans les intestins du poisson-zèbre GF

REMARQUE : Avant d’infecter le poisson-zèbre GF, les bactéries isolées ont été modifiées avec des colorants et comptées, ce qui rend la colonisation et la migration microbiennes visibles en continu et in vivo (figure 6).

  1. Choisissez des bactéries bénéfiques potentielles ou des souches dominantes avec une grande abondance dans l’hôte pour infecter les modèles de poissons GF.
    REMARQUE : Les bactéries utilisées dans cette étude étaient Aeromonas sp. et Vibrio sp. (voir le tableau des matériaux), sélectionnées parmi les 8 genres qui ont été isolés et identifiés chez des poissons-zèbres sauvages adultes en laboratoire42.
  2. Étiquetez les bactéries fraîches avec des colorants CM-Dil (voir le tableau des matériaux) et exposez-les à du poisson-zèbre GF à 5 dpf avec une concentration de 106-10 8 unités formant colonies (UFC)/mL.
  3. Observez la fluorescence au microscope fluorescent avec un grossissement de 3× pour indiquer la colonisation et la distribution des bactéries dans l’intestin des larves de poisson-zèbre GF de 6 dpf et 14 dpf.
  4. Comptez manuellement le nombre de bactéries dans les poissons GF par culture sur plaque à chaque point temporel.
  5. Détecter les colonies et les séquences pour s’assurer que l’infection a réussi avec les souches bactériennes cibles.
  6. Prélever des échantillons de poissons GF atteints d’une infection bactérienne pour des tests ultérieurs, y compris le comportement neurologique, les indices de développement, l’analyse histopathologique et les mesures hormonales, etc. 43,44,45.
    REMARQUE : Les bactéries utilisées dans l’expérience d’infection doivent être nouvellement récupérées et fraîchement cultivées par le milieu liquide.

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Representative Results

Les modèles de poisson-zèbre GF peuvent être produits efficacement en utilisant les œufs abondants pondus par les couples de poissons-zèbres, avec le protocole optimisé sur la base des modèles de poissons GF précédents35. Une seule plaque à 6 puits peut élever environ 30 à 48 embryons/larves, ce qui permet une collecte de données et une analyse statistique suffisantes. Après le traitement stérile, les embryons GF sont cultivés dans un incubateur propre jusqu’à l’éclosion des larves à 48-72 h, et changent de GZM quotidiennement avec la détection des échantillons collectés, ce qui est crucial pour maintenir l’état exempt de germes (Figure 1). Après 7 dpf, la nourriture de jaune d’œuf et d’artémias vivants doit être préparée pour les larves aux stades juvéniles. Au cours de la croissance et du développement des poissons, le volume, le contenant et la densité du GZM doivent être régulés ou modifiés à temps pour éviter la mort et l’échec de l’état stérile. Si la détection ne montre pas de pollution bactérienne, les modèles GF réussis peuvent être maintenus en tant que modèles chroniques de la juvénile au début de l’âge adulte, mais le taux de survie est beaucoup plus faible dans la pratique. Enfin, le taux de stérilité, le taux de survie, l’indice de développement, le comportement, l’analyse histopathologique et le profil de transcription des modèles de poissons GF et CR peuvent être mesurés pour explorer l’influence du microbiote et des champs de dépistage de médicaments. Dans cette étude, les principaux indices de développement ont été comparés (figure supplémentaire 1), et le taux d’éclosion des poissons GF était inférieur de 45,7 % à celui des poissons CR, avec 60 % à 72 hpf. Les fréquences cardiaques des larves GF à 7 dpf étaient significativement plus faibles à 18,2 battements/10 s par rapport aux poissons CR avec 22,6 battements/10 s, mais il n’y avait pas de différence entre les deux groupes à 14 dpf avec des taux de 23,5 à 23,8 battements/10 s. Le taux de survie des poissons GF à 7 dpf était le même que celui des poissons CR à 86,7 %, mais a diminué à 60 % à 14 dpf contre 80 % pour les poissons CR. Cependant, les taux de survie des poissons GF et CR ont diminué à 25 % à 10 % après la période d’ouverture de la bouche lorsqu’ils ont acquis des capacités ou des habitudes alimentaires. L’incapacité à maintenir le statut stérile des poissons était l’une des raisons du taux de survie plus faible. Par conséquent, l’alimentation et l’entretien des nutriments des stades juvéniles au début de l’âge adulte sont des défis critiques dans la pisciculture.

Un autre facteur clé qui affecte la croissance et le développement des poissons est l’alimentation. Dans cette étude, nous explorons plusieurs méthodes pour obtenir des artémias GF comme nourriture vivante pour les larves de poisson-zèbre GF à long terme jusqu’aux juvéniles et aux adultes (processus illustré à la figure 2). En raison de l’utilisation quotidienne de nourriture pour les poissons GF, le protocole optimisé pour GF Artemia devrait être facile, rapide et économique en pratique. Après avoir comparé le mouvement actif et la mort/immobilité des nauplii observés au microscope, les caractéristiques des nauplii, des œufs non éclos et de la coquille, la méthode est perfectionnée. Après l’incubation quotidienne, les indices d’artémias GF frais obtenus à partir de bouteilles, y compris le taux d’éclosion, de survie et de difformité, ainsi que la longueur et le poids des nauplius, ont été observés et mesurés au microscope (figure 3). Après traitement, le taux d’éclosion des kystes d’artémia était élevé, avec une moyenne de 88,15%, la survie des nauplies nageuses était de 77,83% et le taux de malformation était de 1,87%. La longueur corporelle des nauplii était de 546,70 μm et l’indice de poids corporel était de 3,80 mg/100, ce qui convient à la capture et à l’alimentation des poissons depuis la période d’ouverture des larves jusqu’aux stades juvénile et adulte.

La détection des poissons GF et des artémias GF est également importante pour l’entretien des modèles. Selon le prélèvement d’échantillons et de multiples méthodes d’essai, les résultats peuvent fournir le succès des embryons de poisson-zèbre traités et des kystes d’artémias dans la plaque de culture et le milieu liquide (Figure 4). Les différents échantillons prélevés quotidiennement doivent être détectés comme stériles dans toutes les méthodes d’essai, qui peuvent alors indiquer les modèles GF au moment de la collecte. L’artémia GF doit être détectée avant de se nourrir de poissons GF, ou les résultats de l’incubateur à plaque et à milieu doivent faire référence à l’état stérile des nauplies vivantes fraîches. C’est-à-dire, cultivez GF Artemia à partir de kystes sur des plaques TSA ou du verre liquide TSB ou BHI en incubation shake, qui pourrait être utilisé pour générer des artémias GF et une vérification stérile en même temps. Le protocole GF Artemia peut accueillir un nombre limité de larves pour se nourrir. Au cours du processus d’alimentation, il était évident que l’artémia GF nageait à l’intérieur du GZM, puis qu’il était capturé et consommé par les larves de poisson GF.

Les applications des modèles de poissons GF impliquent divers domaines de la biologie et de la médecine, permettant l’étude des fonctions microbiennes, de la croissance et du développement, des mécanismes de la maladie et du criblage de probiotiques ou de médicaments, entre autres46. Dans cette étude, par exemple, deux bactéries intestinales majeures, Aeromonas sp. et Vibrio sp., ont été isolées chez le poisson zèbre. Les caractéristiques et l’identification de la colonie ont été effectuées, et plusieurs fonctions métaboliques ont été mesurées in vitro à l’aide de kits disponibles dans le commerce (figure 5). Ces bactéries ont été isolées et identifiées par séquençage 16S, et les résultats de l’explosion ont été présentés dans un rapport précédent42. Les souches bactériennes identifiées permettent des recherches scientifiques sur l’impact du microbiote simple ou combiné sur la santé de l’hôte en infectant les modèles de poissons GF. La transparence des larves de poissons permet d’observer des cellules bactériennes marquées en fluorescence à l’aide de colorants CM-Dil, révélant la colonisation et la distribution dans les intestins des poissons GF (illustré à la figure 6). Après une infection bactérienne à 5 dpf, les larves de poisson-zèbre GF peuvent être imagées avec un microscope à fluorescence et observées en continu de 6 à 14 dpf, fournissant des informations sur les fonctions microbiennes combinées aux indices de développement, aux changements histopathologiques et aux altérations moléculaires47.

Figure 1
Figure 1 : Protocole du poisson-zèbre GF de l’embryon à la larve et aux juvéniles. Les étapes clés de la génération du poisson-zèbre GF comprennent : (1) La collecte d’embryons de poissons-zèbres de type sauvage et leur placement dans AB-GZM. (2) Traitement de rinçage avec des agents PVP-I et NaClO pour assurer une stérilité complète. (3) Culture d’embryons/larves GF dans des plaques à 6 puits avec GZM, en renouvelant le milieu quotidiennement. (4) Régulation des conditions de culture pour une croissance et un développement optimaux. (5) Échantillonnage à différents stades de développement, suivi d’un test de stérilité à l’aide de méthodes sur plaque et en milieu liquide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Protocole de préparation d’artémias GF comme aliment vivant pour les poissons GF. Les étapes clés comprennent : (1) Traitement de rinçage des kystes d’artémia pour une stérilité complète. (2) Préparation des kystes GF dans le milieu. (3) Incubation dans une solution saline pendant 24 h pour favoriser l’éclosion. (4) Filtration des œufs échoués et des œufs vides pour recueillir les nauplii actifs. (5) Laver les nauplies collectées pour éliminer les débris, garantissant des aliments vivants de haute qualité et sans contaminants. (6) Test de stérilité de l’artémia GF avant l’alimentation des larves de poissons GF. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Indices des kystes d’artémias GF et des nauplii incubés pendant 24 h. (A) Kystes d’artémia non traités avec film d’impuretés (barre d’échelle : 500 μm). (B) Kystes artémiens traités avec une surface légèrement convexe après absorption d’eau et un aspect plus propre (barre d’échelle : 500 μm). (C) Examen microscopique de nauplii GF GF vivants frais incubés (barre d’échelle : 2000 μm) et (D) grossissement avec une barre d’échelle de 1000 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Détection stérile des poissons GF à chaque stade de leur cycle biologique et des artémias GF. (A) Essais stériles d’échantillons de poissons CR et GF à l’aide d’un milieu liquide TSB et BHI, d’un TSA et de plaques sanguines dans des conditions aérobies et anaérobies. (B) Tests stériles de kystes d’artémias non traités, de kystes d’artémia GF et de nauplii à l’aide d’un milieu liquide TSB et BHI, d’un TSA et de plaques sanguines dans des conditions aérobies et anaérobies. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Isolement et identification de bactéries intestinales chez le poisson zèbre. (A) Souches bactériennes, caractéristiques des colonies, cartes de séquençage 16S (exemples : Aeromonas sp. et Vibrio sp.). (B) Accessions du genre et du NCBI. (C) Fonctions métaboliques des bactéries isolées de l’intestin du poisson-zèbre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Infection et colonisation de souches de bactéries intestinales chez le poisson-zèbre GF. (A) Récupération de souches bactériennes isolées et identifiées pour des expériences d’infection. (B) Marquage des bactéries avec des colorants fluorescents et infection des larves de poisson-zèbre GF à 5 dpf. Grossissement : 1x. (C) Observation de la distribution et de la colonisation des bactéries (Vibrio sp.) dans les tissus intestinaux in vivo. Grossissement : 3x. (D) Comptage des UFC de bactéries (Aeromonas sp. et Vibrio sp.) dans chaque larve de poisson par échantillonnage quotidien. Les données présentent la moyenne ± SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Amorces Séquences(5'-3') Longueur du produit
27 ans AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 1465 pb
1492R ACGGYTACCTTGTTACGACTT
63F CAGGCCTAACACATGCAAGTC 1324 pb
1387R GGGCGGWGTGTACAAGGC

Tableau 1 : Amorces utilisées pour la détection bactérienne.

Composants Unités Volume (μL)
Taq ADN polymérase 2,5 U/μL 0.1
Tampon 10× (Mg2+) --- 2.1
Mélange dNTP 2,5 millions d’euros 1.6
Base de teint 27F 10 μM 1
Apprêt 1492R 10 μM 1
Sans ADN/ARN H2O --- 13.2
ADN matrice --- 1
Volume total --- 20

Tableau 2 : Concentration finale et volume des composants par réaction.

Pas Température Heure Cycles
Dénaturation initiale 95 °C 4 minutes --
Dénaturation 94 °C 1 minute 35
Recuit 55 °C 1 minute
Extension 72 °C 1 minute
Prolongation finale 72 °C Durée : 10 minutes --
Tenir 4 °C ∞ --

Tableau 3 : Programme de PCR pour l’amplification du gène de l’ARNr 16S.

Figure supplémentaire 1 : Les indices de développement critiques des modèles de poisson-zèbre GF et CR. (A) Le taux d’éclosion des poissons-zèbres CR et GF à 72 hpf, et (B) battements cardiaques/10 s des poissons CR et GF à 7 dpf et 14 dpf. Les taux de survie (%) des poissons RC et GF ont diminué de 7 jours à 14 jours avec 86 %, 60 % à 80 % à 10 % à 25 % à 30 dpf. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Étapes critiques dans les protocoles du poisson GF et de la préparation des aliments GF
Au cours de la génération des modèles de poissons GF, plusieurs étapes critiques ont été impliquées, notamment la préparation du matériel stérile, la stérilisation des embryons, le renouvellement quotidien du GZM, la collecte de divers échantillons et l’examen stérile de chaque échantillon à l’aide de plusieurs méthodes. Parmi ces étapes, le traitement initial des embryons est fondamental et décisif pour la réussite des modèles GF. Le contrôle des agents, de leurs concentrations et des temps de traitement est crucial pour obtenir des taux de stérilisation optimaux et le succès de l’éclosion. Une attention particulière est nécessaire lors de la manipulation des embryons de poissons GF jusqu’aux larves, ce qui implique des changements quotidiens de milieu et s’assure que les matériaux et les plates-formes sont soigneusement stérilisés à l’aide d’une lumière ultraviolette ou d’un autoclave lors du retrait des plaques de l’incubateur. La surveillance des conditions de température et du temps de fonctionnement pendant l’hiver est essentielle pour prévenir la mort des larves causée par des températures plus basses sur des bancs propres.

Le jaune d’œuf stérile et l’artémia GF doivent être détectés avant d’être donnés aux poissons après 7 dpf afin de garantir leur état stérile pour les modèles GF à long terme. Pendant la période d’alimentation, le nettoyage des résidus alimentaires est important dans le cadre des échantillons collectés pour la détection lors du renouvellement du déchet. Le contenant, le volume de GZM et la masse alimentaire doivent être ajustés en même temps que les stades de croissance et de développement afin d’éviter la perte de poissons GF en raison d’un environnement limité et de problèmes de qualité de l’eau. La surveillance régulière et l’ajustement de ces paramètres contribuent à la bonne tenue à jour des modèles de poissons GF.

Modifications et importance de ces protocoles
Le processus simplifié en trois étapes de génération d’embryons de poisson-zèbre GF, impliquant des agents, des concentrations et des temps d’exposition optimisés des solutions AB-GZM, PVP-I et NaClO, garantit un taux de stérile élevé et un développement sain des modèles. De plus, les méthodes de détection stérile pour les échantillons quotidiens ont été perfectionnées pour inclure des cultures sur plaques et en milieu liquide dans des conditions aérobies et anaérobies, ainsi que des techniques moléculaires utilisant des amorces bactériennes courantes. D’autres expériences dans le domaine des tests de contaminants bactériens et fongiques visent à optimiser les contaminants isolants et les tests stériles lors de techniques animales GF48.

Le protocole spécifique pour les nauplii GF Artemia en tant que nourriture vivante pour les modèles de poissons a été étudié dans notre étude, et un brevet a été accordé à PPJ et DSP par l’Administration nationale de la propriété intellectuelle de Chine (No. ZL202210482684.8). Les modèles de poissons GF à long terme sont constamment limités par une nutrition inadéquate et inadaptée, ce qui exacerbe les faiblesses des fonctions intestinales liées à la digestion et à l’absorption. En tant que source de nourriture crédible pour les modèles de medaka et de poisson-zèbre à différents stades de leur vie, GF Artemia sp. devrait être facile à préparer avec une procédure simple, un temps d’incubation court et une détection stérile en temps réel pour une utilisation quotidienne. Dans cette méthode, les kystes normaux d’Artemia sont rincés à une concentration suffisante de NaClO pour être aseptiques, puis incubés dans un flacon pelliculé, ainsi que sur une plaque et dans un milieu liquide pour la détection. Cela permet de faire éclore des nauplii fraîchement éclos pour nourrir les poissons GF. Le taux stérile et le taux d’éclosion des artémias, ainsi que la longueur du corps, le poids et l’activité de l’artémia, sont excellents, ce qui indique les applications disponibles dans la pratique.

L’importance de ces modifications dans les poissons GF et les protocoles alimentaires GF profite aux chercheurs dans la génération de modèles aux embryons, aux larves, aux stades juvéniles et même aux premiers stades adultes et adultes chez les espèces marines et d’eau douce. Les animaux GF à long terme fourniront l’autorisation en tant que modèles in vivo dans la recherche sur le criblage de médicaments et les fonctions microbiennes pendant la croissance et le développement de l’hôte, en particulier dans la maturité de l’immunité et des lignées cellulaires intestinales associées. Par exemple, les larves de poisson-zèbre ne possèdent une immunité innée qu’au cours de la première semaine, puis développent le système d’immunité adaptative au cours de 7 à 21 dpf, ainsi qu’une maturité du thymus31,49. De plus, les modèles de poissons GF peuvent offrir la possibilité d’analyser les interactions bactéries-bactéries et microbiote-hôte avec observation en direct des processus dynamiques de colonisation et de migration dans les organismes50,51.

Limites de la méthode
L’élevage de poissons GF des juvéniles aux adultes précoces (28 dpf-2,5 mpf) et aux adultes sexuellement matures (>2,5 mpf) reste difficile en raison de la mortalité accrue et du risque de contamination bactérienne pendant l’entretien du modèle. Ces limites proviennent principalement de l’absence de systèmes d’autoculture adaptés aux poissons vivant dans un environnement GF. Ces systèmes doivent inclure de l’air pur, de l’eau et un système alimentaire pour maintenir efficacement les animaux et leur environnement, assurant une isolation complète des micro-organismes externes. Contrairement à d’autres modèles d’animaux GF tels que les souris et les poulets52, il est difficile d’obtenir du poisson-zèbre GF par le biais d’opérations anatomiques à partir des parents CR en raison de leurs habitudes aquatiques et de leur style de fécondation naturel.

Traiter les animaux adultes comme étant complètement dépourvus de microbiote intestinal est également un défi. Bien que le traitement antibiotique puisse induire un état similaire à celui des animaux exempts d’agents pathogènes spécifiques (FPS), caractérisé par une réduction du microbiote détecté dans les échantillons fécaux, il reste difficile d’obtenir de véritables modèles de poissons adultes GF. Les défis liés à l’établissement et au maintien des modèles de GF, en particulier pendant la transition de l’état juvénile à l’état à long terme, sont importants. L’importance de la progéniture GF, comme les œufs GF F1 ou F2 de poissons GF adultes, dans la recherche microbienne est reconnue. Cependant, il faut beaucoup de temps pour surmonter les défis liés à l’établissement et au maintien de modèles de poissons GF adultes à long terme.

Il convient de noter que le poisson-zèbre gnotobiotique avec une colonisation bactérienne spécifique a été développé, montrant une survie chronique basée sur des modèles GF. Néanmoins, il n’est pas certain que ces modèles puissent servir d’alternatives viables aux modèles GF dans les infections bactériennes et la recherche biomédicale.

Applications futures des modèles de poissons GF
Dans cette étude, nous avons affiné le protocole de génération de modèles de poissons-zèbres GF, passant de l’embryon à la juvénile. Cette avancée a des applications importantes en biologie du développement, en immunologie, en recherche sur les maladies humaines et en organogenèse. Grâce à l’isolement et à l’identification de masse, l’étude explore les fonctions, les mécanismes et les métabolites dérivés de l’intestin de souches bactériennes uniques. L’enquête implique l’infection de modèles de poisson-zèbre GF après l’ouverture de l’évent au stade47,53. De plus, les bactéries marquées par fluorescence facilitent l’observation de la colonisation et de la distribution dans les larves vivantes de GF, exemptes d’autres influences microbiennes54. Des modèles de poissons GF similaires, tels que le medaka marin ou d’eau douce, peuvent être créés à l’aide de méthodes comparables avec divers agents ou changements de milieu.

Pour sonder les mécanismes de la maladie humaine, l’étude utilise des méthodes FMT, en transférant des échantillons de patients ou de donneurs à des animaux sains ou à des modèles GF55. Contrairement aux animaux élevés de manière conventionnelle, les modèles GF offrent des preuves solides des fonctions, des impacts ou des réponses microbiennes chez l’hôte, en particulier lorsqu’ils sont combinés à des bactériophages pour réguler les bactéries cibles dans le microbiote46.

En résumé, les poissons-zèbres GF servent de modèles puissants pour évaluer l’innocuité bactérienne, l’efficacité des médicaments, la toxicité des polluants ou l’interférence des composés, en raison de leur environnement intestinal sensible et pur. L’exploration future des applications des poissons GF devrait englober divers domaines, avec la nécessité de créer des modèles de poissons GF adultes pour une compréhension plus approfondie des fonctions microbiennes à différents stades de la vie.

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Disclosures

Le protocole de GF Artemia a été accordé en tant que brevet par l’Administration nationale chinoise de la propriété intellectuelle, ce qui permettra de lever l’utilisation restreinte de la méthode après avoir obtenu l’autorisation des auteurs. Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’autres intérêts concurrents ou financiers.

Acknowledgments

Nous remercions sincèrement le soutien du Chongqing Medical University Talent Project (n° R4014 au DSP et R4020 au PPJ), de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC, n° 32200386 à PPJ), du Chongqing Postdoctoral Innovation Mentor Studio (X7928 DSP) et du Programme du Centre conjoint Chine-Sri Lanka pour la recherche et la démonstration de la technologie de l’eau de l’Académie chinoise des sciences (CAS)/Centre conjoint Chine-Sri Lanka pour l’éducation et la recherche par le CAS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AB-GZM Amphotericin:Solarbio;  kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio. Amphotericin:CAS:1397-89-3;
kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.		 49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL).
1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes biosharp BS-15-M To collect samples, and hold agents
2.4 g/L NaClO XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. CAS: 7681-52-9 Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.
6-well plates, 24-, 48- well plates LABSELECT  11112 To culture fish
Aeronomas NCBI database No.MK178499 2019-JPP-ESN
Anaerobic TSA plates tryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
agar powder:BioFroxx.		 tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
agar powder:9002-18-0.		 The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.
Anaerobic work station GENE SCIENCE E200G Bacterial isolation, sterile testing
Analysis GraphPad Prism 5 v6.07 To analysis the data
API 20 E kits  BioMerieux SA, France No.1005915090 Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism
Artemia (Brine shrimp) Shangjia Aquarium Co., Ltd. Aquamaster brand Artemia cysts, and brine shrimp eggs 
Auto cycle system for fish culture Ningbo Hairui Technology Co., Ltd No Cat Maintain the fish
Autoclave Zeal Way G154DWS Prepare the materials
BHI Aerobic Coolaber Cat#PM0640 BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.
BHI Anaerobic Coolaber Cat#PM0640 BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.
Biochemical incubator LongYue Co., Ltd SPX For fish and plates
Biosafety cabinet Haier HR40-IIA2 Sterile treatment and testing
Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. CAS: 7681-52-9 Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.
Blood plates sheep blood:Solarbio Cat. NO. TX0030 Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.
Cell culture flask Corning 430639 To culture fish
CM-Dil dyes Molecular Probes Cat#C7000   To label the bacteria
Constant temperature shaking incubator Peiving Co., Ltd HZQ-X100 Bacterial culture
Database NCBI Bacteria and Archaea database Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/
Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
Disposable Pasteur pipette biosharp bs-xh-03l Used to change water, and transfer eggs
Disposable petri dish biosharp BS-90-D To culture fish
DNA kits Solaribio Cat#D1600 Bacterial genomic DNA extraction kits 
Electric pipette SCILOGEX Levo me Change water
Exiguobacterium NCBI database No.MK178504 2019-JPP-ESN
GZM Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd. No Cat Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.
Laboratory pure water system Hitech Co., Ltd Prima-S15 Prepare the agents
Microscope Nikon SMZ18 With fluorescent light to observe fish larvae
PCR kits TIANGEN Cat#ET101 Taq DNA Polymerase kit
Pipette LABSELECT  sp-013-10 Change water
Povidone iodine (PVP-I) Aladdin Lot#H1217005 Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.
Timing converter PinYi Co., Ltd AL-06 To regulate the light
TSA plates tryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
agar powder:BioFroxx.		 tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
agar powder:9002-18-0.		 TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.
TSB Aerobic tryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;		 tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;		 TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.
TSB Anaerobic tryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;		 tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;		 TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.
Ultra-clean workbench Airtech SW-CJ-2FD Sterile treatment and testing
Ultra-pure flow system for fish culture Marine Biological Equipment company No Cat Produce water for fish
Vibrio NCBI database No.MK178501 2019-JPP-ESN

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Ce mois-ci dans JoVE Numéro 206 Poisson-zèbre sans germes (GF) Nourriture Artemia Modèles embryonnaires-larvaires-juvéniles Bactéries intestinales Protocole optimisé
Génération, maintenance et identification de modèles de poissons-zèbres exempts de germes, des larves aux stades juvéniles
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Jia, P. P., Liu, X. R., Wu, M. F.,… More

Jia, P. P., Liu, X. R., Wu, M. F., Li, Y., Zhang, L. C., Pei, D. S. Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages. J. Vis. Exp. (206), e66512, doi:10.3791/66512 (2024).

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