Summary
Bu protokol, mikropsuz (GF) balık embriyoları elde etmek ve bunları larvalardan gençlik aşamasına kadar korumak için, örnekleme ve steril durumlarını tespit etme dahil olmak üzere birincil adımları özetlemektedir. Enfeksiyonlu GF modellerinin kullanılması, mikropların konak sağlığındaki rolünü anlamak için önemlidir.
Abstract
Zebra balıkları, memelilerle genomik benzerlikleri, nispeten temiz bir koryon ortamında gelişen şeffaf embriyoları ve kemirgen modellerine kıyasla son derece hızlı larva gelişimi nedeniyle büyüme, bağışıklık ve bağırsak mikrobiyotası araştırmaları için değerli modeller olarak hizmet eder. Mikropsuz (GF) zebra balığı (Danio rerio), kirletici toksisitesini değerlendirmek ve mikrobiyal işlevlerle ilgili insan benzeri hastalık modelleri oluşturmak için çok önemlidir. Geleneksel olarak yetiştirilen (CR) modellerle (ortak hayvancılıkta balıklar) karşılaştırıldığında, GF zebra balığı, konakçı mikrobiyotasının daha doğru bir şekilde manipüle edilmesine izin vererek mikroorganizmalar ve konakçılar arasındaki nedensel ilişkinin belirlenmesine yardımcı olur. Sonuç olarak, bu ilişkiler hakkındaki anlayışımızı ilerletmede kritik bir rol oynarlar. Bununla birlikte, GF zebra balığı modelleri, bağışıklık fonksiyonu ve besin emilimindeki sınırlamalar nedeniyle tipik olarak erken yaşam evrelerinde (embriyolardan larvalara kadar) üretilir ve araştırılır. Bu çalışma, erken GF zebra balığı modellerinin beslenmeden ve GF yemi ( Artemia sp., salamura karides gibi) kullanılarak uzun süreli beslenmeyle üretilmesini, bakımını ve tanımlanmasını optimize eder. Süreç boyunca, günlük örnekleme ve kültür gerçekleştirildi ve plakalar ve 16S rRNA dizilimi dahil olmak üzere çoklu tespitler yoluyla tanımlandı. GF zebra balığının aseptik hızı, hayatta kalma ve gelişim indeksleri, oluşturulan modellerin kalitesini ve miktarını sağlamak için kaydedildi. Daha da önemlisi, bu çalışma, GF balıkları için bakteri izolasyonu ve enfeksiyon teknikleri hakkında ayrıntılar sağlayarak, GF gıda desteği ile larvalardan gençlik aşamalarına kadar GF balık modellerinin verimli bir şekilde oluşturulmasını sağlar. Bilim adamları, bu prosedürleri biyomedikal araştırmalarda uygulayarak, bağırsak bakteri fonksiyonları ve konak sağlığı arasındaki ilişkileri daha iyi anlayabilirler.
Introduction
Mikrobiyota (yani Arkeler, Bakteriler, Ökarya ve virüsler), bireylerde bağırsak bariyeri, epitel yüzeyi ve müsin fonksiyonları içindeki simbiyotik etkileşimler yoluyla fizyolojik ve patolojik süreçleri etkileyerek konak sağlığının korunmasında ve çeşitli hastalıkların gelişimine katkıda bulunmada çok önemli roller oynar 1,2,3. Mikrobiyotanın bebeklikten gençliğe, yetişkinliğe ve yaşlanmaya kadar farklı yaşam evrelerindeki bileşimi ve ayrıca burun, ağız, cilt ve bağırsak bölgeleri gibi çeşitli yerlerdeki varlığı, çeşitli habitatlar ve ortamlar tarafından dinamik olarak şekillendirilir4. Organizmalardaki bağırsak mikrobiyotası, besin emilimi, bağışıklık tepkisi, patojen istilası, metabolik düzenleme vb.ile ilgilidir 5,6. Hastalar üzerinde yapılan çalışmalar, bağırsak mikrobiyotasındaki bozulmaların insan obezitesi, uyku bozuklukları, depresyon, inflamatuar bağırsak hastalığı (IBD), nörodejeneratif hastalıklar (Parkinson, Alzheimer), yaşlanma ve çeşitli kanserlerle ilişkili olduğunu göstermiştir 7,8,9. Ayrıca, bağırsak mikrobiyotası ve konakçılar arasındaki etkileşimli yollar, fareler ve balık modelleri kullanılarak yapılan önceki araştırmalarda gözlemlendiği gibi, inflamatuar faktörleri, nörotransmiterleri, metabolitleri, bağırsak bariyerini ve oksidatif stresi içerir10,11.
Son zamanlarda, potansiyel probiyotikler ve fekal mikrobiyota transplantasyonu (FMT) dahil olmak üzere çoklu bakteri ile ilgili yaklaşımlar veya tedaviler, klinik ve hayvan modellerinde bu bozukluklar için araştırılmıştır. Bu keşifler, mikrobiyota-bağırsak-beyin/karaciğer/böbrek ekseni, mikrobiyota türevi ürünler ve değiştirilmiş reseptör aktivitesi12,13 ile ilgili keşiflere dayanmaktadır. Bununla birlikte, mikrobiyota konak sisteminin gelişimi, çeşitli işlevleri ve mekanizmaları, mikrobiyal topluluğun karmaşıklığı ve güçlü insan benzeri hastalık modelleri üretmenin zorluğu nedeniyle hala tam olarak anlaşılmamış ve tanımlanmamıştır.
Bu sorunları ele almak için, mikropsuz (GF) hayvan modelleri 19. yüzyılın ortalarında acilen önerildi ve öncelikle 20. yüzyılda geliştirildi. Mikrobiyal tespit ve gözlem teknolojilerindeki gelişmelerin yanı sıra antibiyotikle tedavi edilmiş ve gnotobiyotik modeller de dahil olmak üzere müteakip iyileştirmeler, bu modelleri daha da mükemmelleştirdi 14,15,16. Kendi geçmişlerini silerek ve çevresel mikroplardan kaçınarak yaratılan GF hayvanları, mikroorganizmalar ve konakçıları arasındaki etkileşimleri keşfetmek için mükemmel bir strateji sunar17. Hayvan modellerinin ve rafine protokollerin uygulanmasıyla, araştırmacılar GF farelerinde ve balıklarda hastalarda bulunan benzer mikrobiyal bileşimleri başarıyla kopyaladılar. Ek olarak, köpekler, tavuklar ve domuzlar gibi diğer GF hayvan modelleri, araştırma konuları olarak çeşitli seçenekler sunar 18,19,20,21. Bu yaklaşım, kommensal mikrobiyomların insanlarda kanser immünoterapisi de dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar üzerindeki potansiyel terapötik etkilerinin araştırılmasını sağlamıştır 16,18. GF modelleri, konakçılar içindeki spesifik bakteri kolonizasyonu, göçü, çoğalması ve etkileşiminin özellikleri ve mekanizmaları hakkında daha doğru bilgiler sunar. Bu, mikrobiyota ile ilgili hastalıkların ortaya çıkışı ve gelişimi hakkında çok önemli yeni bilgiler sağlar22,23. Mikrobiyal araştırmalarda GF zebra balığının kurulması ve uygulanmasının tarihi, 2004'te Rawls ve ark. ve 2006'da Bates ve ark.'nın raporlarından 2017'deMelancon ve ark.'nın protokolüne kadar gelişmiştir 16,24,25. Bununla birlikte, yetişkin veya üreyen GF modellerinin fizibilitesi, değişken uzun ömür, başarı oranları ve sağlık sorunlarının eşlik ettiği uzun bir süreçtir.
Çeşitli hayvan modelleri arasında zebra balığı (Danio rerio), insan organlarına ve genomiklere avantajlı benzerliği, kısa gelişim döngüsü, yüksek doğurganlığı ve şeffaf embriyoları nedeniyle hem temel hem de biyomedikal araştırmalar için kritik bir araç olarak öne çıkmaktadır19,26. Güvenilir insan hastalığı modelleri olarak hizmet veren zebra balığı, in vivo fizyolojik ve patolojik süreçlerin görsel bir temsilini sunarak, konakçı-mikrop etkileşimlerinin çekici özellikleri hakkında fikir verir. Özellikle, zebra balığı, bağırsak fizyolojisi, mikrobiyal dinamikler, gonadlar ve üreme gelişimi, konakçı bağışıklık sisteminin olgunlaşması, davranış ve metabolizmanın görüntülenmesine izin veren farklı hücre soyları sergiler27. Zebra balığı embriyoları, yumurtadan çıkana kadar koruyucu koryonlar içinde gelişir ve döllenmeden 3 gün sonra (dpf) larva haline gelir. Aktif olarak 5 dpf'de yiyecek avlarlar ve döllenmeden yaklaşık 3 ay sonra (mpf) cinsel olgunluğa ulaşırlar28. Rawls ve ark.24 tarafından bildirilen ilk başarılı mikropsuz (GF) zebra balığı, yumurta sarısı emiliminden sonra otoklavlanmış yemle beslenen larvaların 8 dpf'den doku nekrozu ve 20 dpf'de toplam ölüm sergilediğini gösterdi. Bu, diyetin etkilerini veya uzun süreli (>7 dpf) GF balıklarını içeren deneylerde dışsal besin tedarikini dikkate almanın önemini gösterdi29. Daha sonraki çalışmalar, steril gıda ve farklı balık modellerinde mükemmelleştirilen yöntemler kullanarak GF balıklarının üretim protokolünü geliştirdi16.
Bununla birlikte, GF zebra balığı modelleri üzerine yapılan araştırmaların çoğu, deneylerin sonunda 24 ila 48 saat boyunca 5 dpf'de bakteriyel enfeksiyonu içeren erken yaşam evrelerine odaklanmıştırve deneylerin sonunda 7 dpf'den önce toplanan örnekler 25,30,31. İnsanlar ve zebra balıkları da dahil olmak üzere organizmalardaki mikrobiyotanın yaşamın başlangıcında kolonize olduğu ve büyüme ve gelişme sırasında şekillendiği yaygın olarak kabul edilmektedir. Bileşim yetişkin aşamalarında stabil kalır, konakçıdaki mikrobiyotanın rolleri, özellikle yaşlanma, nörodejeneratif, metabolik ilişkili obezite ve bağırsak hastalığı yönlerinde yaşam boyunca çok önemlidir3. Bu nedenle, daha uzun sağkalıma sahip GF hayvanlarından elde edilen bakış açıları, balık larvalarının erken yaşamdaki olgunlaşmamış bağışıklık ve üreme sistemlerini göz önünde bulundurarak, konakçı organ gelişimi ve işlevlerindeki mikrobiyal rollerin mekanizmaları hakkında fikir verebilir. Zebra balığı bağırsaklarındaki bakteri suşları önceki çalışmalarda izole edilmiş ve tanımlanmış olsa da, GF hayvan modellerini probiyotikleri seçmek veya konakçıdaki bakteri fonksiyonlarını araştırmak için enfekte etme potansiyeli sunarken19,25, GF balık modellerinin üretimi ve uygulanması öncelikle erken yaşam evreleriyle sınırlandırılmıştır. Karmaşık üretim sürecine, yüksek bakım maliyetlerine ve gıda ve bağışıklıkla ilgili sorunlara atfedilen bu sınırlama, konakçıdaki mikrobiyotanın gelişimsel ve kronik etkilerini araştırmayı amaçlayan araştırma çabalarını engellemektedir.
Balıkların hayatta kalma oranı, davranışı, büyümesi, olgunlaşması ve genel sağlığı, özellikle mikropsuz (GF) modellerde, erken larvalardan yavrulara kadar ağız açık döneminde besin alımını ve emilimini kapsayan beslenme uygulamalarından önemli ölçüde etkilenir32,33. Bununla birlikte, GF balık yetiştiriciliğindeki zorluklardan biri, larvaların büyümesini ve hayatta kalmasını sürdürmek için beslenme desteğinin etkinliğini sınırlayan uygun steril diyetlerin kıtlığıdır. Bu sorunu çözmek, gelişimsel savunma mekanizmaları ve bağırsak mikrobiyomunun olmaması nedeniyle zayıf sindirim yetenekleri göz önüne alındığında, GF balıklarının yaşamını eski haline getirmek için çok önemlidir. Gıda açısından canlı salamura karides (Artemia sp.) ağzı açık larvalar ve yavru balıklar için en uygun diyet olarak karşımıza çıkmaktadır. Canlı salamura karides ile beslenen balıkların, pişmiş yumurta sarısı veya diğer doğal ve sentetik yemlerle beslenenlere göre daha yüksek büyüme ve hayatta kalma oranları sergilediği görülmüştür34. GF balıklarının erken yaşam modelleri yumurta sarısı desteği ile hayatta kalabilirken ve GF larva modelleri steril besleme ile korunabilirken, larvalardan yavrulara kadar uzun vadeli modeller oluşturmak ve cinsel olgunluğa ulaşmak zor olmaya devam etmektedir. Ek olarak, pul veya toz gıdalar eşit olmayan besin bileşimi ile sınırlıdır ve su kalitesini etkileyebilir. Buna karşılık, canlı Artemia'nın hem tuzlu hem de tatlı suda hayatta kalması, larvalar için yetişkinlere uygun küçük boyut, harmanlama kolaylığı ve daha yüksek kuluçka kalitesi gibi avantajları vardır35. Önceki yöntemlere (16,24,30) dayanarak, karmaşık tedavi sürecini basitleştirdik ve erken yaştaki GF balıklarından daha uzun süre steril bir yem olarak kolayca kuluçkaya yatırılan GF live Artemia sp. oluşturarak diyet zorluğunu ele aldık.
Bu çalışma, mikropsuz (GF) zebra balıklarının embriyolardan larvalara ve gençlik aşamalarına kadar büyümesini sağlamak için (1) nesil, (2) bakım, (3) steril oranın belirlenmesi ve (4) bakım ve beslemeyi kapsayan optimize edilmiş bir protokol sunmaktadır. Sonuçlar, GF zebra balığının yumurtadan çıkması, hayatta kalması, büyümesi ve kısırlığı hakkında ön kanıtların yanı sıra GF Artemia sp. steril gıda olarak. Model oluşturma ve steril canlı mamaların hazırlanmasındaki ayrıntılı adımlar, mikrobiyota-konak etkileşimi araştırmalarında GF Artemia sp.'nin yanı sıra uzun vadeli GF balık modellerinin oluşturulması ve uygulanması için çok önemli teknik destek sağlar. Protokol, GF balık modellerinde bakteriyel izolasyon, tanımlama ve enfeksiyonu ele alarak, bakteriyel floresan etiketleme yöntemlerini ana hatlarıyla belirtir ve mikroskop altında balık bağırsaklarında kolonizasyonlarını gözlemler. GF balıkları, bakteriyel enfeksiyonu olan gnotobiyotik balıklar veya transfer edilen insan mikrobiyota modelleri, işlevlerini ve konakçı bağışıklığı, sindirim, davranış, transkriptomik düzenleme ve metabolik yönler üzerindeki etkilerini aydınlatmak için çeşitli tespitlere tabi tutulacaktır. Uzun vadede, bu protokol deniz medaka gibi farklı vahşi tip balık türlerine ve potansiyel olarak belirli dokular veya hastalıklarla ilişkili diğer seçilmiş transgenik zebra balığı hatlarına genişletilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Balık deneyleri, Chongqing Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi ve Çin'deki Chongqing Tıp Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin yönergelerinin yanı sıra Devlet Kalite ve Teknik Denetim Bürosu tarafından yayınlanan deney hayvanları standartlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir (Onay Kimliği: GB14922-2001 - GBT14927-2001). Zebra balığı (Danio rerio, yabani tip, AB suşu) Çin Bilimler Akademisi Hidrobiyoloji Enstitüsü'nden temin edildi ve daha önce bildirilen prosedürlere göre laboratuvarda tutuldu36.
1. Yetişkin zebra balığı bakımı ve embriyo toplama
NOT: Önceki çalışmalardan ve 16,37,38,39 raporlarından elde edilen değişikliklere dayanarak, laboratuvarımızda yetişkin zebra balıklarının bakımı, larva yetiştiriciliği ve mikropsuz (GF) modellere yönelik uygulamalar aşağıda belirtilen adımlar izlenerek gerçekleştirilmiştir. Balık kültürü için ultra saf akış sistemi ticari olarak elde edilmiştir (bkz. Malzeme Tablosu). Dengeli bir pH, tuz ve alkali ile korunan su, temiz koşulları sağlamak için döngü sırasında filtrasyona tabi tutulur.
- Yetişkin balıkları, karanlığın fotoperiyodu ile otomatik döngü sisteminde (Malzeme Tablosuna bakınız) aşağıdaki standart prosedürle koruyun: ışık = 10 saat: 28 °C'de 14 saat ± 0,5 °C'de ve taze kuluçkaya yatırılmış Artemia sp. ile beslenir. günde iki kez.
- Cinsel olarak olgun yetişkin zebra balığını (erkek: dişi = 2:1) bir gece önceden taze ve temiz su ile tanklara koyun.
- Balıkların ertesi sabah (yaklaşık 8:30) laboratuvarda düzenli ışık stimülasyonu altında yumurtlamasına izin verin. 1-2 saat sonra balığı başka bir tanka aktarın.
- Embriyoları, tek kullanımlık bir Pasteur pipeti kullanarak bir kültür kabında yetiştirme ortamı olarak otomatik döngü sisteminden suya toplayın.
2. Embriyolardan larvalara kadar GF zebra balığı üretimi
NOT: Mikropsuz (GF) balık üretme prosedürü Şekil 1'de özetlenirken, geleneksel (CR) ve GF modellerinin temel gelişim indeksleri Ek Şekil 1'de sunulmuştur. Lütfen temiz bir odada steril aseptik teknik kullanan bir tezgah üstü biyolojik güvenlik kabininde veya laminer akış başlığında aşağıda belirtilen adımları izleyin.
- Embriyoları balık kültürü suyunu kullanarak yıkayın ve dışkı, safsızlıkları ve ölü veya döllenmemiş yumurtaları çıkarın.
- Embriyoları 2 hpf'de antibiyotik mikropsuz zebra balığı besiyeri (AB-GZM, Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisi ile doldurulmuş sterilize plakalara (10 cm çapında steril tabak başına 480 embriyoya kadar) aktarın ve 28.5 ° C'de 6-8 saat kültürleyin.
NOT: AB-GZM, yüzey mikroorganizmalarını ortadan kaldırmak için embriyoları birkaç saat boyunca tedavi etmek için kullanılır ve antibiyotiksiz GZM, GF balıklarını alt sırayla kültürlemek için kullanılır. Genellikle, mükemmelleştirilmiş kültür süresi 6 saattir). - Beyaz lekeli veya beyazımsı bir görünüme sahip yumurtaları hariç tutun ve normal olarak geliştirilenleri seçin, daha sonraki işlemler için şeffaf ve sağlam zarflar görüntüleyin.
- Embriyoları AB-GZM kullanarak 10 dakika içinde üç kez durulayın.
- Embriyoları 0.2 g / L povidon-iyot çözeltisinde (PVP-I) 1 dakika bekletin (Malzeme Tablosuna bakınız).
NOT: Daha yüksek konsantrasyon ve 2 dakikadan uzun süre embriyoların ölüm ve kuluçka oranını etkileyecektir. - Embriyoları 10 dakika içinde üç kez mikropsuz zebra balığı ortamı (GZM) kullanarak yıkayın.
- Embriyoları sodyum hipoklorit (NaClO) çalışma çözeltisine ekleyin, 50 mL mikrosantrifüj tüplerini sıkıca kapatın ve 15 dakika ağartın. Bu süre zarfında embriyoları hafifçe çalkalayarak çamaşır suyu solüsyonunda bekletin.
- Embriyoları GZM kullanarak 10 dakika içinde üç kez yıkayın.
- Embriyoları, oyuk başına 5 embriyo ve 10 mL GZM içeren steril 6 oyuklu plakalara aktarın. Onları koyu bir fotoperiyoda sahip ultra temiz bir platformda veya inkübatörde kültürleyin: ışık = 10 saat: 28 ° C'de 14 saat ± 0,5 ° C. Kültür yoğunluğu steril oranı etkileyecektir.
- Harcanan GZM'yi çıkararak, steril durum tespiti için numuneler halinde toplayarak ve her bir kuyucuğu aynı hacimde steril GZM ile doldurarak kültür ortamını günlük olarak yenileyin.
- Hayatta kalma oranı, kuluçka oranı, kalp atışları, vücut uzunluğu ve ağırlığı vb. dahil olmak üzere GF embriyolarının/larvalarının temel gelişim indekslerini kaydedin19.
- GF balıklarını genişletilmiş hacimli uygun kaplara (tabaklar, hücre kültürü şişeleri veya kapaklı cam şişeler) aktarın ve büyüme süreci boyunca steril gıda sağlayın.
3. GF zebra balığının larvalardan yavrulara kadar bakımı
- 7 dpf'den önce beslemeden GZM'yi yenileyin ve steril durumları günlük olarak tespit edin (bkz. adım 5).
- GZM'yi değiştirmeden önce zebra balığı larvalarını 8 dpf'den gençlik aşamalarına kadar günde bir kez steril yumurta sarısı (oyuk başına 10 μL hazırlanmış stok çözeltisi) ile besleyin.
- GF yavrularını 14 dpf'den GF Artemia sp. ile karıştırılmış sterilize yumurta sarısı ile günde bir kez (1-3 Artemia/larva, bkz. adım 4), GF balıklarının büyümesi ve gelişmesiyle birlikte besin kütlesini kademeli olarak artırın.
- Tüm balıklar Artemia nauplii'yi tüketene kadar yumurta sarısı sağlayın.
NOT: GF Artemia kullanımdan önce sterilite testinden geçmelidir. Kalan Artemia nauplii sayısını değerlendirin, takip ve yakalama ilerlemesini gözlemleyin ve beslenme başarısını belirtmek için tüketilen yiyeceklerle balık gövdesini inceleyin. - 28 dpf'den erken yetişkinlik aşamalarına kadar, GF Artemia'yı günde bir kez (3-5 Artemia/larva) besleyin ve kullanılmayan veya ölü Artemia'yı ve ölü balıkları günlük örnekler olarak atık GZM'ye temizleyin.
- GF balık büyümesi sırasında, 7 dpf'den sonra 6 oyuklu plakaları 8 ila 21 dpf arasında steril plakalara veya hücre kültürü şişelerine ve ardından 21 dpf'den sonra steril şişelere değiştirin. Her kaptaki GF balığının sayısına ve ağırlığına göre kültür ortamını ve besin kütlesini artırın.
- GF modellerinin başarısını sağlamak için GZM'yi günlük olarak yenileyin ve numuneleri kontrol edin.
NOT: Mikropsuz (GF) balık modellerini erken yetişkinliğe ve cinsel olgunluğa kadar sürdürmek zordur, ortalama hayatta kalma oranı 30 dpf'de, tipik olarak %10'dan azdır. Bu öncelikle zayıf bağışıklığa, gecikmiş gelişime ve bozulmuş bağırsak fonksiyonuna atfedilir.
4. Kronik GF balık modelleri için steril yem olarak GF Artemia nauplii'nin hazırlanması
NOT: Mikropsuz (GF) Artemia'nın yetiştirilme ve hazırlama yöntemi Şekil 2'de özetlenmiştir. Aşağıdaki tüm adımların steril bir aseptik teknik kullanılarak bir tezgah üstü biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirildiğini unutmayın.
- 0.25 g Artemia kistini 2.4 g / L sodyum hipoklorit (NaClO, Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak 5 dakika durulayın.
- Durulanmış Artemia kistlerini sterilize edilmiş ultra yoğun bir filtreyle (açıklıkta yaklaşık 170 gözenek) süzün ve her seferinde 1-2 dakika boyunca üç kez sterilize edilmiş ultra saf su ile yıkayın.
- Yıkanmış Artemia kistlerini 100 mL %2,5 sterilize tuzlu suya aktarın, karıştırın ve aşağıda belirtilen adımlara göre aseptik kuluçka için paketleyin.
- 50 mL ile muamele edilmiş Artemia kist karışımı solüsyonunu 100 mL hacimli steril bir şişeye paketleyin, filmle kapatın ve 150 rpm'de, 30 °C'de 18 saat ila 24 saat boyunca çalkalanan bir inkübatörde inkübe edin.
- Tek kullanımlık bir Pasteur pipeti kullanarak orta ve alt katmanlardan yaklaşık 30 mL kuluçka Artemia nauplii çıkarın.
NOT: Yüzen yumurtaların ve boş kabukların üst tabakaya ulaşmasını önleyin. 24 saat inkübe edilen mikropsuz (GF) Artemia kistleri ve naupliusların indeksleri Şekil 3'te sunulmuştur. - Artemia'yı bir sterilizasyon filtresi ile süzün ve her seferinde yaklaşık 30 s ila 1 dakika olmak üzere üç kez sterilize edici ultra saf su ile sterilizasyon kabında yıkayın. Son olarak, Artemia karışık solüsyonunu hazırlamak için 4 mL sterilize ultra saf su ekleyin.
- Tek kullanımlık bir Pasteur pipeti kullanarak, üst katmandan aktif olarak yüzen Artemia'yı alın, yıkayın ve nauplii solüsyonunu besleme ve aseptik tanımlama için hazırlayın.
5. GF balık modellerinin tüm yaşam evrelerinde tanımlanması
NOT: Mikropsuz (GF) balıkların tüm yaşam aşamaları boyunca, modellerin başarısını sağlamak için temel indeksler ve günlük numune tespitleri çok önemlidir. Bu adım, numunelerin ortak sınıflandırmasını ve tanımlama için olağan yöntemleri özetlemektedir (Şekil 4).
- GF zebra balığı larvalarının hayatta kalma durumunu ve oranını günlük olarak gözlemleyin ve sayın. İlgili oranları hesaplayan deneylerde, GF balıkları, kuyu başına bir balık olacak şekilde 24 veya 48 oyuklu plakalarda kültürlenir.
- Hayatta kalma oranı = (gözlem sırasındaki canlı balık sayısı / toplam yumurta sayısı) × %100.
- Sterilite oranı = (steril balık sayısı/hayatta kalan balık sayısı) × %100.
NOT: Bu protokol, canlı balıkların steril oranına odaklanmaktadır. Steril balık sayısı, canlı balıklar arasında birden fazla kontrolden sonra başarılı GF balıklarının sayılmasıyla belirlenir. Bakteri varlığı nedeniyle başarısız olan ölü balık veya canlı balık GF modelleri, sonraki GF prosedürleri sırasında elimine edilir.
- Aşağıdaki GF zebra balığı larva örneklerini toplayın.
- Her bir kuyudan veya şişe kabından GF zebra balığı kültür ortamı.
- Steril yumurta sarısı ve GF Artemia gibi balık yemi.
- Yumurtadan çıktıktan sonra yumurta zarı parçaları ve larvalardan yavru balıklara kadar beslenme dönemlerinde yiyecek artıkları veya dışkı dahil olmak üzere atık ortam.
- Bakterilerin varlığını tanımlamak için ölü balık örnekleri.
- Balık besiyeri ve embriyo tedavisinde steril kontrol olarak kullanılan ajanlardır.
- Malzemelerden, işletim platformundan ve kuluçka makinesinden vb. numuneler.
- Birden fazla yöntem kullanarak günlük olarak toplanan örnekleri tespit edin.
- İlk olarak, yayılmış plaka yöntemini ve kültür plakalarını 30 °C'de bir inkübatörde kullanın.
- Aerobik koşullar altında Triptikaz Soya Agar (TSA) plakası üzerine 20-50 μL atık ortam numunesi ile kaplayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Anaerobik koşullar altında TSA plakası üzerine 20-50 μL atık ortam numunesi ile kaplayın.
- Aerobik koşullar altında kan TSA plakaları üzerine 20-50 μL atık ortam numunesi ile kaplayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Anaerobik koşullar altında kan TSA plakaları üzerine 20-50 μL atık ortam numunesi ile kaplayın.
- İkinci olarak, sıvı kültür yöntemini kullanın.
- 200 μL numuneyi Beyin Kalp İnfüzyon Suyu (BHI) ortamı ile aerobik tüplere alın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 30 ° C, 150-180 rpm'de çalkalama inkübatöründe kültürleyin.
- BHI besiyeri ile anaerobik tüplere 200 μL numune ekleyin ve inkübatörde 30 ° C'de kültür edin.
- Triptikaz Soya Suyu (TSB) ortamı ile aerobik tüplere 200 μL numune ekleyin, ardından 30 ° C, 150-180 rpm'de çalkalama inkübatörde kültürleyin.
- TSB besiyeri ile anaerobik tüplere 200 μL numune ekleyin ve inkübatörde 30 ° C'de kültür edin.
- Üçüncüsü, moleküler teknikler-16s polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tahlili kullanın.
- Atık su numunesini iki çift 27F ve 1492R'nin yanı sıra 63F ve 1387R ile analiz edin (Tablo 1).
NOT: PCR ana karışımı, ticari olarak temin edilebilen bir DNA polimeraz kiti (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak Tablo 2'ye göre hazırlandı ve PCR makinesi, Tablo 3'te belirtilen programla kuruldu. - PCR programı tamamlandıktan sonra, numunelerin sterilitesini anlamak için ürünleri 1465 bp (27F ve 1492R primerleri kullanılarak) veya 1324 bp (63F ve 1387R primerleri kullanılarak) hedef bantlarında %1 agaroz jel elektroforezi40 ile inceleyin.
- Atık su numunesini iki çift 27F ve 1492R'nin yanı sıra 63F ve 1387R ile analiz edin (Tablo 1).
- İlk olarak, yayılmış plaka yöntemini ve kültür plakalarını 30 °C'de bir inkübatörde kullanın.
- 24 saatten 3 güne ve 7 güne kadar plaka ve orta kültür dahil olmak üzere, plakalar üzerinde koloni ve sıvıda bulanıklık olmamasının GF modellerinin başarılı bir şekilde yapıldığını gösterdiği sterilite testlerini kaydedin ve gözlemleyin. Plakayı ve ortamı 24 saat, 48 saat, 72 saat, 96 saat, 120 saat, 144 saat ve 168 saat'te gözlemleyin ve kaydedin.
6. GF balıklarıyla beslenmeden önce GF Artemia örneklerinin tanımlanması
NOT: GF balıkları ile beslenmeden önce canlı yem olarak vazgeçilmez olan GF Artemia örneklerini tespit etmek için (Şekil 4) aşağıdaki adımları izleyin.
- GF Artemia modellerinin örneklerini toplayın.
- Tedavi edilmemiş Artemia kistleri.
- Tedavi edilen GF Artemia kistleri.
- Yumurtadan çıkmış GF Artemia nauplii.
- Kontrol olarak sterilize edilmiş ultra saf su.
- GF Artemia'yı aşağıdaki yöntemlerle tespit edin.
- Numuneleri aerobik ve anaerobik koşullar altında TSA plakaları ve kan TSA plakaları üzerine kaplayarak tespit etmek için yayılmış plaka yöntemini kullanın. Onları 30 ° C'de inkübe edin.
- Aerobik ve anaerobik TSB ve BHI tüplerindeki numuneleri tespit etmek için sıvı bir ortam kullanın. 150-180 rpm, 30 °C'de bir çalkalayıcıda kültür.
- 16s ribozomal RNA hedef genleri 27F ve 1492R, 63F ve 1387R kullanılarak toplanan örneklerde bakteri varlığını tespit etmek için PCR testini kullanın (Tablo 1). Cilt ve program Tablo 2 ve Tablo 3'te gösterilmiştir.
- Sonuçları kaydedin: PCR ürününü, 1465 bp (27F ve 1492R primerleri kullanılarak) veya 1324 bp (63F ve 1387R primerleri kullanılarak) ölçen hedef bantlar için %1 agaroz jel elektroforezi40 ile tespit edin. Plakaların ve sıvı ortamın sonuçları, GF Artemia'nın GF balık yemi olarak kullanılmadan önce steril durumunu sağlayabilir.
7. Zebra balıklarından bağırsak bakteri suşlarının izolasyonu ve tanımlanması
NOT: Bağırsak fonksiyonlarını in vitro ve in vivo olarak keşfetmek için, zebra balıklarından bakteri suşlarını izole etmek gerekir, bu da GF hayvanları kullanılarak enfeksiyonla taranan potansiyel probiyotikler için tür kaynağı sağlar (Şekil 5). Bu protokolde, bağırsak içeriğini elde etmek için geleneksel diseksiyon yöntemi tanımlanırken, örnekler doğrudan canlı anestezi uygulanmış balıklardan da toplanabilir (veriler gösterilmemiştir).
- Sağlıklı yetişkin zebra balığı seçin ve steril suyla yıkayın. Temiz tezgahta aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
- Balıkları 100 mg / L MS-222 ile 5-10 dakika uyuşturun.
- Balığın vücut yüzeyini tedavi etmek için% 75 alkol kullanın.
- Balık bağırsaklarını inceleyin ve bağırsak içeriğini TSB veya BHI ortamı ile ekstrüde edin.
- Aerobik ve anaerobik koşullarda TSA, kan plakası, TSB ve BHI ortamı uygulayarak bağırsak süpernatanı inkübe edin.
- Sinyal suşunu elde etmek için bakterileri çevirin ve farklı kolonilerin özelliklerini kaydedin.
- Bakterileri -80 °C'de% 30 gliserol içinde saklayın.
- Ardından, genomik DNA ekstraksiyonu ve PCR dizilimi ile bağırsak bakterilerini tanımlayın.
NOT: Bakteriyel genomik DNA ekstraksiyonunun ana adımları, sıvı santrifüjleme, RNase A ve Proteaz K ayrışması, etil alkol ekstraksiyonu, durulama ve üreticinin talimatlarına göre ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak çözündürmeyi içerir (bkz. Malzeme Tablosu). - Ulusal Biyoteknoloji Bilgi Merkezi (NCBI) ve Temel Yerel Hizalama Arama Aracını (BLAST) kullanarak 16S dizilerini Bakteri ve Arke veritabanı40,41 ile analiz edin (bkz.
- Cins düzeyinde izole edilmiş bağırsak suşlarını tanımlamak için en iyi eşleşen bakteri ve karakterleri seçin.
- Piyasada bulunan kitleri kullanarak bakteri suşlarının metabolik fonksiyonlarını tespit edin (bkz. Malzeme Tablosu).
8. GF zebra balığı bağırsaklarında grip etiketi, enfeksiyon ve bakteri kolonizasyonu
NOT: GF zebra balığını enfekte etmeden önce, izole edilen bakteriler boyalarla modifiye edildi ve sayıldı, bu da mikrobiyal kolonizasyonu ve göçü sürekli ve in vivo olarak görünür hale getirdi (Şekil 6).
- GF balık modellerini enfekte etmek için konakçıda bol miktarda bulunan potansiyel faydalı bakterileri veya baskın suşları seçin.
NOT: Bu çalışmada kullanılan bakteriler Aeromonas sp. ve Vibrio sp. (bkz . Malzeme Tablosu), laboratuvarda yetişkin vahşi tip zebra balıklarından izole edilen ve tanımlanan 8 cinsten seçilmiştir42. - Taze bakterileri CM-Dil boyaları ile etiketleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve bunları 10 6-108 Koloni Oluşturan Birimler (CFU'lar)/mL konsantrasyonda 5 dpf'de GF zebra balığına maruz bırakın.
- GF zebra balığı larvalarının bağırsaklarındaki bakterilerin kolonizasyonunu ve dağılımını 6 dpf ve 14 dpf'den göstermek için floresan mikroskobu altında 3× büyütmeli floresanı gözlemleyin.
- GF balığındaki bakteri sayısını her zaman noktasında plaka kültürüne göre manuel olarak sayın.
- Enfeksiyonun hedef bakteri suşları ile başarılı olduğundan emin olmak için kolonileri ve dizileri tespit edin.
- Nöro-davranış, gelişimsel indeksler, histopatolojik analiz ve hormon ölçümleri vb. dahil olmak üzere sonraki tahliller için bakteriyel enfeksiyonu olan GF balığı örneklerini toplayın 43,44,45.
NOT: Enfeksiyon deneyinde kullanılan bakteriler yeni elde edilmeli ve sıvı ortam tarafından taze olarak kültürlenmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
GF zebra balığı modelleri, zebra balığı çiftlerinin yumurtladığı bol yumurtalar kullanılarak verimli bir şekilde üretilebilir ve protokol önceki GF balık modellerine göre optimize edilmiştir35. Tek bir 6 oyuklu plaka, yaklaşık 30-48 embriyo / larvayı kültürleyebilir ve bu da bol miktarda veri toplama ve istatistiksel analize izin verir. Steril tedaviden sonra, GF embriyoları 48-72 saatte larvalara yumurtadan çıkana kadar temiz bir inkübatörde kültürlenir ve toplanan örneklerin tespiti ile GZM'yi günlük olarak değiştirir, bu da mikropsuz durumun korunması için çok önemlidir (Şekil 1). 7 dpf'den sonra, larvaların gençlik dönemlerine kadar yumurta sarısı ve canlı Artemia yiyecekleri hazırlanmalıdır. Balığın büyümesi ve gelişmesi sırasında, GZM'nin hacmi, kabı ve yoğunluğu, steril durumun ölümünü ve başarısızlığını önlemek için zaman içinde düzenlenmeli veya değiştirilmelidir. Tespit bakteriyel kirlilik göstermezse, başarılı GF modelleri çocukluktan erken yetişkinliğe kadar kronik modeller olarak korunabilir, ancak hayatta kalma oranı pratikte çok daha düşüktür. Son olarak, mikrobiyota ve ilaç tarama alanlarının etkisini keşfetmek için GF ve CR balık modellerinin steril oranı, sağkalım oranı, gelişim indeksi, davranışı, histopatolojik analizi ve transkripsiyon profili ölçülebilir. Bu çalışmada, temel gelişimsel indeksler karşılaştırıldı (Ek Şekil 1) ve GF balıklarının kuluçka oranı CR balıklarından %45.7 daha düşük, %60'ı 72 hpf'de bulundu. GF larvalarının 7 dpf'deki kalp atış hızları, 22.6 atım/10 sn olan CR balıklarına kıyasla 18.2 atım/10 s'de önemli ölçüde daha düşüktü, ancak 14 dpf'de 23.5-23.8 atım/10 sn oranlarında iki grup arasında fark yoktu. GF balıklarının 7 dpf'de hayatta kalma oranı %86,7 ile CR balıkları ile aynıydı, ancak CR balıkları için %80'e kıyasla 14 dpf'de %60'a düştü. Bununla birlikte, hem GF hem de CR balıklarının hayatta kalma oranları, beslenme yetenekleri veya alışkanlıkları edindikleri ağız açık dönemden sonra %25-10'a düşmüştür. Balıkların steril durumunun korunamaması, hayatta kalma oranının düşük olmasının nedenlerinden biriydi. Bu nedenle, gençlikten erken yetişkinlik aşamalarına kadar beslenme ve besin bakımı, balık yetiştiriciliğinde kritik zorluklardır.
Balıkların büyümesini ve gelişmesini etkileyen bir diğer önemli faktör de beslenmedir. Bu çalışmada, GF Artemia'yı uzun süreli GF zebra balığı larvaları için gençlere ve yetişkinlere canlı yem olarak elde etmek için birden fazla yöntemi araştırıyoruz ( Şekil 2'de gösterilen süreç). GF balıkları için günlük yem kullanımı nedeniyle, GF Artemia için optimize edilmiş protokol pratikte kolay, zaman kazandıran ve ekonomik olmalıdır. Mikroskop tarafından gözlemlenen nauplii'nin aktif hareketi ve ölümü/hareketsizliği, nauplii'nin özellikleri, yumurtadan çıkmamış yumurtalar ve kabuk karşılaştırıldıktan sonra yöntem mükemmelleştirilir. Günlük inkübasyondan sonra, şişelerden elde edilen taze GF Artemia'nın kuluçka, sağkalım ve deformite oranı ile nauplii'nin uzunluk ve ağırlığı dahil olmak üzere indeksleri mikroskop altında gözlendi ve ölçüldü (Şekil 3). Tedavi sonrası Artemia kistlerinin kuluçka oranı yüksek, ortalama %88.15, yüzme naupliilerinin sağkalımı %77.83 ve malformasyon oranı %1.87 idi. Nauplii'nin vücut uzunluğu 546.70 μm ve vücut ağırlığı indeksi 3.80 mg / 100 olup, larva ay açık döneminden gençlik ve yetişkin dönemlerine kadar balık yakalama ve besleme için uygundur.
GF balıklarının ve GF Artemia'nın tespiti de model bakımı için önemlidir. Numune toplama ve çoklu test yöntemlerine göre, sonuçlar, kültürlenmiş plaka ve sıvı ortamda tedavi edilen zebra balığı embriyolarının ve Artemia kistlerinin başarısını sağlayabilir (Şekil 4). Günlük olarak toplanan çeşitli numuneler, tüm test yöntemlerinde steril olarak tespit edilmelidir, bu da daha sonra toplama sırasında GF modellerini gösterebilir. GF Artemia, GF balıkları ile beslenmeden önce tespit edilmeli veya plaka ve orta kuluçka makinesi sonuçları, taze canlı nauplii'nin steril durumuna atıfta bulunmalıdır. Yani, GF Artemia'yı aynı anda hem de steril doğrulama oluşturmak için kullanılabilecek çalkalama inkübasyonunda TSA plakaları veya TSB veya BHI sıvı orta camdaki kistlerden yetiştirin. GF Artemia protokolü, beslenmek için sınırlı sayıda larvayı barındırabilir. Besleme işlemi sırasında, GF Artemia'nın GZM içinde yüzdüğü ve daha sonra GF balık larvaları tarafından yakalanıp tüketildiği açıktı.
GF balık modellerinin uygulamaları, biyoloji ve tıptaki çeşitli alanları içerir ve diğerlerinin yanı sıra mikrobiyal fonksiyonların, büyüme ve gelişmenin, hastalık mekanizmalarının ve probiyotik veya ilaç taramasının araştırılmasına olanak tanır46. Bu çalışmada, örneğin, iki ana bağırsak bakterisi, Aeromonas sp. ve Vibrio sp., zebra balığından izole edildi. Koloni özellikleri ve tanımlaması yapıldı ve ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak in vitro olarak çoklu metabolik fonksiyonlar ölçüldü (Şekil 5). Bu bakteriler izole edildi ve 16S dizilimi ile tanımlandı ve patlama sonuçları önceki bir rapordasunuldu 42. Tanımlanan bakteri suşları, GF balık modellerini enfekte ederek tek veya birleşik mikrobiyotanın konakçı sağlığı üzerindeki etkisi üzerine bilimsel araştırmalara olanak tanır. Balık larvalarının şeffaflığı, CM-Dil boyaları kullanılarak floresan etiketli bakteri hücrelerinin gözlemlenmesine izin vererek, GF balıklarının bağırsaklarındaki kolonizasyonu ve dağılımı ortaya çıkarır ( Şekil 6'da gösterilmiştir). 5 dpf'de bakteriyel enfeksiyondan sonra, GF zebra balığı larvaları bir floresan mikroskobu ile görüntülenebilir ve sürekli olarak 6 ila 14 dpf arasında gözlemlenebilir, bu da gelişimsel indeksler, histopatolojik değişiklikler ve moleküler değişiklikler ile birlikte mikrobiyal fonksiyonlar hakkında bilgi sağlar47.
Şekil 1: GF zebra balığının embriyolardan larvalara ve yavrulara kadar olan protokolü. GF zebra balığı üretimindeki temel adımlar şunları içerir: (1) Yabani tip zebra balığından embriyoların toplanması ve AB-GZM'ye yerleştirilmesi. (2) Tam steriliteyi sağlamak için PVP-I ve NaClO ajanları ile durulama işlemi. (3) GF embriyolarının / larvalarının GZM ile 6 oyuklu plakalarda kültürü, ortamın günlük olarak yenilenmesi. (4) Optimal büyüme ve gelişme için kültür koşullarının düzenlenmesi. (5) Çeşitli gelişim aşamalarında numune alma, ardından plaka ve sıvı ortam yöntemleri kullanılarak sterilite testi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: GF Artemia'nın GF balıkları için canlı yem olarak hazırlanması protokolü. Anahtar adımlar şunları içerir: (1) Tam sterilite için Artemia kistlerinin durulama tedavisi. (2) Ortamda GF kistlerinin hazırlanması. (3) Kuluçkayı teşvik etmek için 24 saat boyunca bir tuz çözeltisinde inkübasyon. (4) Aktif nauplii toplamak için başarısız kuluçka ve boş yumurtaların filtrelenmesi. (5) Kalıntıları temizlemek için toplanan nauplii'yi yıkamak, yüksek kaliteli ve kirletici içermeyen canlı yiyecekler sağlamak. (6) GF balık larvalarına beslenmeden önce GF Artemia'nın sterilite testi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: 24 saat inkübe edilen GF Artemia kistleri ve nauplii indeksleri. (A) Kirlilik filmi ile tedavi edilmemiş Artemia kistleri (ölçek çubuğu: 500 μm). (B) Su emiliminden sonra hafif dışbükey bir yüzeye ve daha temiz bir görünüme sahip tedavi edilmiş Artemia kistleri (ölçek çubuğu: 500 μm). (C) Taze inkübe edilmiş canlı GF Artemia nauplii'nin (ölçek çubuğu: 2000 μm) mikroskobik incelemesi ve (D) 1000 μm'lik bir ölçek çubuğu ile büyütme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: GF balıklarının her yaşam evresinde steril tespiti ve GF Artemia. (A) Aerobik ve anaerobik koşullar altında TSB ve BHI sıvı ortam, TSA ve kan plakaları kullanılarak CR ve GF balık örneklerinin steril testleri. (B) Aerobik ve anaerobik koşullar altında TSB ve BHI sıvı ortamı, TSA ve kan plakaları kullanılarak tedavi edilmemiş Artemia kistleri, GF Artemia kistleri ve nauplii'nin steril testleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Zebra balıklarında bağırsak bakterilerinin izolasyonu ve tanımlanması. (A) Bakteri suşları, kolonilerin özellikleri, 16S dizileme haritaları (örnekler: Aeromonas sp. ve Vibrio sp.). (B) Cins ve NCBI katılımları. (C) Zebra balığı bağırsağından izole edilen bakterilerin metabolik fonksiyonları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: GF zebra balığında bağırsak bakteri suşlarının enfeksiyonu ve kolonizasyonu. (A) Enfeksiyon deneyleri için izole edilmiş ve tanımlanmış bakteri suşlarının geri kazanımı. (B) Bakterilerin floresan boyalarla etiketlenmesi ve GF zebra balığı larvalarının 5 dpf'de enfeksiyonu. Büyütme: 1x. (C) Bağırsak dokularında bakterilerin (Vibrio sp.) dağılımı ve kolonizasyonunun in vivo olarak gözlenmesi. Büyütme: 3x. (D) Günlük örnekleme ile her balık larvasındaki bakteri CFU'larının (Aeromonas sp. ve Vibrio sp.) sayımı. Veriler ortalama ± SEM'i sunar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Astar | Diziler (5'-3') | Ürün uzunluğu |
| 27F (27F) | AGAGTTTGATCMTGGCTCAG | 1465 bp |
| 1492R | ACGGYTACCTTGTTACGACTT | |
| 63F (Türkçe) | CAGGCCTAACACATGCAAGTC | 1324 beygir |
| 1387R | GGGCGGWGTGTACAAGGC |
Tablo 1: Bakteri tespiti için kullanılan primerler.
| Bileşen | Birimler | Hacim (μL) |
| Taq DNA polimeraz | 2,5 U/μL | 0.1 |
| 10× Tampon (Mg2 +) | --- | 2.1 |
| dNTP Karışımı | 2,5 milyon | 1.6 |
| Astar 27F | 10 μM | 1 |
| Astar 1492R | 10 μM | 1 |
| DNA/RNA içermeyenH2O | --- | 13.2 |
| Şablon DNA | --- | 1 |
| Toplam hacim | --- | 20 |
Tablo 2: Reaksiyon başına bileşenlerin nihai konsantrasyonu ve hacmi.
| Adım | Sıcaklık | Saat | Döngü |
| İlk denatürasyon | 95 °C | 4 dk | -- |
| Denatürasyon | 94 °C | 1 dk | 35 |
| Tavlama | 55 °C | 1 dk | |
| Uzantı | 72 °C | 1 dk | |
| Son uzatma | 72 °C | 10 dk | -- |
| Tutmak | 4 °C | ∞ | -- |
Tablo 3: 16S rRNA geninin amplifikasyonu için PCR programı.
Ek Şekil 1: GF ve CR zebra balığı modellerinin kritik gelişim indeksleri. (A) CR ve GF zebra balıklarının 72 hpf'de kuluçka oranı ve (B) 7 dpf ve 14 dpf'de CR ve GF balıklarının kalp atışları/10 s. CR ve GF balıklarının hayatta kalma oranları (%) 7 gün ve 14 günden %86, %60-%80 ile 30 dpf'de %10-25'e düşmüştür. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
GF balık ve GF yem hazırlama protokolleri dahilindeki kritik adımlar
GF balık modellerinin oluşturulması sırasında, steril materyallerin hazırlanması, embriyoların sterilizasyonu, GZM'nin günlük olarak yenilenmesi, çeşitli numunelerin toplanması ve her numunenin birden fazla yöntem kullanılarak steril olarak incelenmesi dahil olmak üzere birkaç kritik adım dahil edildi. Bu adımlar arasında, embriyoların ilk tedavisi, GF modellerinin başarısı için temel ve belirleyicidir. Kontrol ajanları, konsantrasyonları ve tedavi süreleri, optimum sterilizasyon oranlarına ve kuluçka başarısına ulaşmak için çok önemlidir. GF balık embriyolarını larvalara dönüştürürken, günlük ortam değişikliklerini içerirken ve plakaları kuluçka makinesinden çıkarırken ultraviyole ışık veya otoklavlama kullanılarak malzemelerin ve platformların iyice sterilize edilmesini sağlarken dikkatli olunmalıdır. Temiz tezgahlarda düşük sıcaklıkların neden olduğu larva ölümlerini önlemek için kış aylarında sıcaklık koşullarının ve çalışma süresinin izlenmesi çok önemlidir.
Steril yumurta sarısı ve GF Artemia , uzun süreli GF modelleri için steril durumlarını sağlamak için 7 dpf'den sonra balıklara verilmeden önce tespit edilmelidir. Besleme süresi boyunca, atık ortam yenilenirken tespit için toplanan numunelerin bir parçası olarak gıda kalıntılarının temizlenmesi önemlidir. Sınırlı çevre ve su kalitesi sorunları nedeniyle GF balık kaybını önlemek için kap, GZM hacmi ve yiyecek kütlesi büyüme ve gelişme aşamaları ile birlikte ayarlanmalıdır. Bu parametrelerdeki düzenli izleme ve ayarlamalar, GF balık modellerinin başarılı bir şekilde korunmasına katkıda bulunur.
Bu protokollerin değişiklikleri ve önemi
AB-GZM, PVP-I ve NaClO çözeltilerinin optimize edilmiş ajanlarını, konsantrasyonlarını ve maruz kalma sürelerini içeren GF zebra balığı embriyoları oluşturmak için basitleştirilmiş üç aşamalı süreç, yüksek steril bir oran ve sağlıklı bir model gelişimi sağlar. Ek olarak, günlük numuneler için steril tespit yöntemleri, yaygın bakteri primerleri kullanan moleküler tekniklerin yanı sıra aerobik ve anaerobik koşullar altında plakaları ve sıvı ortam kültürlerini içerecek şekilde mükemmelleştirilmiştir. Bakteriyel ve fungal kontaminantlar için yapılan testlerdeki daha ileri deneyimler, GF hayvan teknikleri48 sırasında izolatör kontaminantlarını ve steril testleri optimize etmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmamızda, balık modelleri için canlı yem olarak GF Artemia nauplii için özel protokol araştırılmış ve Çin Ulusal Fikri Mülkiyet İdaresi tarafından PPJ ve DSP'ye bir patent verilmiştir (No. ZL202210482684.8). Uzun vadeli GF balık modelleri, yetersiz ve uygun olmayan beslenme ile sürekli olarak kısıtlanır, bu da sindirim ve emilim ile ilgili bağırsak işlevlerindeki zayıflıkları şiddetlendirir. Farklı yaşam evrelerindeki medaka ve zebra balığı modelleri için güvenilir bir besin kaynağı olan GF Artemia sp., basit bir prosedür, kısa kuluçka süresi ve günlük kullanım için gerçek zamanlı steril algılama ile hazırlanması kolay olmalıdır. Bu yöntemde, normal Artemia kistleri aseptik olmak için yeterli bir NaClO konsantrasyonunda durulanır ve daha sonra tespit için film kaplı bir şişede, ayrıca bir plaka üzerinde ve sıvı bir ortamda inkübe edilir. Bu, GF balık beslemesi için yumurtadan yeni çıkan nauplii'yi destekler. Artemia'nın steril oranı ve kuluçka oranının yanı sıra vücut uzunluğu, ağırlığı ve aktivitesi mükemmeldir ve bu da pratikte mevcut uygulamaları gösterir.
GF balıkları ve GF gıda protokollerindeki bu değişikliklerin önemi, araştırmacılara deniz ve tatlı su modlarında embriyolar, larvalar, gençlik aşamaları ve hatta erken yetişkin ve yetişkin aşamalarında modeller oluşturmada fayda sağlar. Uzun vadeli GF hayvanları, özellikle bağışıklığın ve ilgili bağırsak hücre hatlarının olgunluğunda, konak büyümesi ve gelişimi sırasında ilaç taraması ve mikrobiyal işlevler üzerine yapılan araştırmalarda in vivo modellerde olduğu gibi izin sağlayacaktır. Örneğin, zebra balığı larvaları sadece ilk haftada doğuştan gelen bağışıklığa sahiptir, daha sonra 7-21 dpf sırasında adaptif bağışıklık sistemini geliştirir ve timus olgunluğu31,49 ile birlikte. Ayrıca, GF balık modelleri, organizmalardaki dinamik kolonizasyon ve göç süreçlerinin canlı gözlemi ile bakteri-bakteri ve mikrobiyota-konak etkileşimlerini analiz etme imkanı sağlayabilir50,51.
Yöntemin sınırlamaları
GF balıklarının gençlerden erken yetişkinlere (28 dpf-2,5 mpf) ve cinsel olarak olgun yetişkinlere (>2,5 mpf) kadar yetiştirilmesi, artan ölüm oranı ve model bakımı sırasında bakteriyel kontaminasyon riski nedeniyle zorlu olmaya devam etmektedir. Bu sınırlamalar, öncelikle bir GF ortamında yaşayan balıklar için uygun otokültür sistemlerinin olmamasından kaynaklanmaktadır. Bu sistemler, hayvanları ve çevrelerini etkin bir şekilde korumak için temiz hava, su ve bir gıda sistemi içermeli ve dış mikroorganizmalardan tam izolasyon sağlamalıdır. Fareler ve tavuklar52 gibi diğer GF hayvan modellerinden farklı olarak, CR ebeveynlerinden anatomik işlemler yoluyla GF zebra balığı elde etmek, su alışkanlıkları ve doğal döllenme tarzları nedeniyle zordur.
Yetişkin hayvanları bağırsak mikrobiyotasından tamamen yoksun olarak tedavi etmek de zordur. Antibiyotik tedavisi, dışkı örneklerinde tespit edilen azalmış mikrobiyota ile karakterize edilen spesifik patojen içermeyen (SPF) hayvanlara benzer bir durumu indükleyebilse de, gerçek GF yetişkin balık modellerine ulaşmak hala zordur. GF modellerinin oluşturulması ve sürdürülmesiyle ilgili zorluklar, özellikle çocuk devletlerinden uzun vadeli devletlere geçiş sırasında önemlidir. Yetişkin GF balıklarından elde edilen GF F1 veya F2 yumurtaları gibi GF yavrularının mikrobiyal araştırmalardaki önemi kabul edilmektedir. Bununla birlikte, uzun vadeli yetişkin GF balık modellerinin oluşturulması ve sürdürülmesindeki zorlukların üstesinden gelmek önemli ölçüde zaman gerektirir.
GF modellerine dayalı kronik sağkalımı gösteren, spesifik bakteri kolonizasyonuna sahip gnotobiyotik zebra balığının geliştirildiğini belirtmekte fayda var. Bununla birlikte, bu modellerin bakteriyel enfeksiyon ve biyomedikal araştırmalarda GF modellerine uygun alternatifler olarak hizmet edip edemeyeceği belirsizliğini korumaktadır.
GF balık modellerinin gelecekteki uygulamaları
Bu çalışmada, embriyolardan gençlere ilerleyen GF zebra balığı modelleri oluşturmak için protokolü geliştirdik. Bu ilerleme, gelişimsel biyoloji, immünoloji, insan hastalıkları araştırmaları ve organogenezde önemli uygulamalara sahiptir. Çalışma, kütle izolasyonu ve tanımlanması yoluyla, tek bakteri suşlarının işlevlerini, mekanizmalarını ve bağırsak kaynaklı metabolitlerini araştırır. Soruşturma, havalandırma47,53 aşamasını açtıktan sonra GF zebra balığı modellerinin enfekte edilmesini içeriyor. Ek olarak, floresan ile etiketlenmiş bakteriler, diğer mikrobiyal etkilerden arınmış canlı GF larvalarında kolonizasyon ve dağılımın gözlemlenmesini kolaylaştırır54. Deniz veya tatlı su medaka gibi benzer GF balık modelleri, çeşitli ajanlar veya ortam değişiklikleri ile karşılaştırılabilir yöntemler kullanılarak oluşturulabilir.
İnsan hastalık mekanizmalarını araştırmak için, çalışma, hastalardan veya donörlerden alınan örnekleri sağlıklı hayvanlara veya GF modellerine aktaran FMT yöntemlerini kullanır55. Geleneksel olarak yetiştirilen (CR) hayvanlardan farklı olarak, GF modelleri, özellikle mikrobiyotadaki hedef bakterileri düzenlemek için bakteriyofajlarla birleştirildiğinde, konakçıdaki mikrobiyal işlevler, etkiler veya tepkiler hakkında sağlam kanıtlar sunar46.
Özetle, GF zebra balığı, hassas ve saf bağırsak ortamları sayesinde bakteri güvenliğini, ilaç etkinliğini, kirletici toksisitesini veya bileşik girişimini değerlendirmek için güçlü modeller olarak hizmet eder. GF balık uygulamalarının gelecekteki araştırmaları, farklı yaşam evrelerindeki mikrobiyal işlevlerin daha derin bir şekilde anlaşılması için yetişkin GF balık modelleri oluşturma ihtiyacı ile çeşitli alanları kapsamalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
GF Artemia'nın protokolü, Çin Ulusal Fikri Mülkiyet İdaresi tarafından patent olarak verildi ve bu, yazarların iznini aldıktan sonra yöntemin kısıtlı kullanımını ortadan kaldıracak. Yazarlar, başka hiçbir rakip veya finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Chongqing Tıp Üniversitesi Yetenek Projesi (No. R4014'ten DSP'ye ve R4020'den PPJ'ye), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'ndan (NSFC, No.32200386'dan PPJ'ye), Chongqing Doktora Sonrası İnovasyon Mentor Stüdyosu'ndan (X7928 DSP) ve Çin Bilimler Akademisi (CAS) / Çin-Sri Lanka Ortak CAS Eğitim ve Araştırma Merkezi tarafından Çin-Sri Lanka Ortak Su Teknolojisi Araştırma ve Gösteri Merkezi Programı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AB-GZM | Amphotericin:Solarbio; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio. | Amphotericin:CAS:1397-89-3; kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313. |
49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL). |
| 1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes | biosharp | BS-15-M | To collect samples, and hold agents |
| 2.4 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution. |
| 6-well plates, 24-, 48- well plates | LABSELECT | 11112 | To culture fish |
| Aeronomas | NCBI database | No.MK178499 | 2019-JPP-ESN |
| Anaerobic TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. |
The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system. |
| Anaerobic work station | GENE SCIENCE | E200G | Bacterial isolation, sterile testing |
| Analysis | GraphPad Prism 5 | v6.07 | To analysis the data |
| API 20 E kits | BioMerieux SA, France | No.1005915090 | Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism |
| Artemia (Brine shrimp) | Shangjia Aquarium Co., Ltd. | Aquamaster brand | Artemia cysts, and brine shrimp eggs |
| Auto cycle system for fish culture | Ningbo Hairui Technology Co., Ltd | No Cat | Maintain the fish |
| Autoclave | Zeal Way | G154DWS | Prepare the materials |
| BHI Aerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder. |
| BHI Anaerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system. |
| Biochemical incubator | LongYue Co., Ltd | SPX | For fish and plates |
| Biosafety cabinet | Haier | HR40-IIA2 | Sterile treatment and testing |
| Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water. |
| Blood plates | sheep blood:Solarbio | Cat. NO. TX0030 | Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates. |
| Cell culture flask | Corning | 430639 | To culture fish |
| CM-Dil dyes | Molecular Probes | Cat#C7000 | To label the bacteria |
| Constant temperature shaking incubator | Peiving Co., Ltd | HZQ-X100 | Bacterial culture |
| Database | NCBI | Bacteria and Archaea database | Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/ |
| Disposable Pasteur pipette | biosharp | bs-xh-03l | Used to change water, and transfer eggs |
| Disposable petri dish | biosharp | BS-90-D | To culture fish |
| DNA kits | Solaribio | Cat#D1600 | Bacterial genomic DNA extraction kits |
| Electric pipette | SCILOGEX | Levo me | Change water |
| Exiguobacterium | NCBI database | No.MK178504 | 2019-JPP-ESN |
| GZM | Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd. | No Cat | Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L. |
| Laboratory pure water system | Hitech Co., Ltd | Prima-S15 | Prepare the agents |
| Microscope | Nikon | SMZ18 | With fluorescent light to observe fish larvae |
| PCR kits | TIANGEN | Cat#ET101 | Taq DNA Polymerase kit |
| Pipette | LABSELECT | sp-013-10 | Change water |
| Povidone iodine (PVP-I) | Aladdin | Lot#H1217005 | Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water. |
| Timing converter | PinYi Co., Ltd | AL-06 | To regulate the light |
| TSA plates | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; agar powder:BioFroxx. |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; agar powder:9002-18-0. |
TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder. |
| TSB Aerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; |
TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl. |
| TSB Anaerobic | tryptone:Oxoid ; soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; |
tryptone:LP0042B; soy peptone:Cat#S9500; NaCl:BS112; |
TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system. |
| Ultra-clean workbench | Airtech | SW-CJ-2FD | Sterile treatment and testing |
| Ultra-pure flow system for fish culture | Marine Biological Equipment company | No Cat | Produce water for fish |
| Vibrio | NCBI database | No.MK178501 | 2019-JPP-ESN |
References
- Sieber, M., Traulsen, A., Schulenburg, H., Douglas, A. E. On the evolutionary origins of host-microbe associations. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (9), e2016487118 (2021).
- Sommer, F., Backhed, F. The gut microbiota--masters of host development and physiology. Nat Rev Microbiol. 11 (4), 227-238 (2013).
- Kim, S., Jazwinski, S. M. The gut microbiota and healthy aging: A mini-review. Gerontology. 64 (6), 513-520 (2018).
- Milani, C., et al. The first microbial colonizers of the human gut: Composition, activities, and health implications of the infant gut microbiota. Microbiol Mol Biol Rev. 81 (4), e00036 (2017).
- De Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: Mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
- Shi, N., Li, N., Duan, X., Niu, H. Interaction between the gut microbiome and mucosal immune system. Mil Med Res. 4 (1), 14 (2017).
- Liu, B. N., Liu, X. T., Liang, Z. H., Wang, J. H.
- Aron-Wisnewsky, J., Warmbrunn, M. V., Nieuwdorp, M., Clément, K. Metabolism and metabolic disorders and the microbiome: The intestinal microbiota associated with obesity, lipid metabolism, and metabolic health-pathophysiology and therapeutic strategies. Gastroenterology. 160 (2), 573-599 (2021).
- Chen, Y. W., Zhou, J. H., Wang, L. Role and mechanism of gut microbiota in human disease. Front Cell Infect Microbiol. 11, 625913 (2021).
- Hao, W. Z., Li, X. J., Zhang, P. W., Chen, J. X. A review of antibiotics, depression, and the gut microbiome. Psychiatry Res. 284, 112691 (2020).
- Nadal, A. L., et al. gut immunity: Using the zebrafish model to understand fish health. Front Immunol. 11, 114 (2020).
- Asadi, A., et al. Obesity and gut-microbiota-brain axis: A narrative review. J Clin Lab Anal. 36 (5), e24420 (2022).
- Mlynarska, E., et al. The role of the microbiome-brain-gut axis in the pathogenesis of depressive disorder. Nutrients. 14 (9), 1921 (2022).
- Yu, Y. J., Raka, F., Adeli, K. The role of the gut microbiota in lipid and lipoprotein metabolism. J Clin Med. 8 (12), 2227 (2019).
- Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. J Microbiol Biotechnol. 25 (10), 1583-1588 (2015).
- Melancon, E., et al. Best practices for germ-free derivation and gnotobiotic zebrafish husbandry. Methods Cell Biol. 138, 61-100 (2017).
- Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods Mol Biol. 1438, 123-135 (2016).
- Wang, X. N., Wu, C. W., Wei, H. Humanized germ-free mice for investigating the intervention effect of commensal microbiome on cancer immunotherapy. Antioxid Redox Signal. 37 (16), 1291-1302 (2022).
- Jia, P. P., et al. Role of germ-free animal models in understanding interactions of gut microbiota to host and environmental health: A special reference to zebrafish. Environ Pollut. 279, 116925 (2021).
- Gootenberg, D. B., Turnbaugh, P. J. Companion animals symposium: Humanized animal models of the microbiome. J Anim Sci. 89 (5), 1531-1537 (2011).
- Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
- Kamareddine, L., Najjar, H., Sohail, M. U., Abdulkader, H., Al-Asmakh, M. The microbiota and gut-related disorders: Insights from animal models. Cells. 9 (11), 2401 (2020).
- Rogala, A. R., Oka, A., Sartor, R. B. Strategies to dissect host-microbial immune interactions that determine mucosal homeostasis vs. Intestinal inflammation in gnotobiotic mice. Front Immunol. 11, 214 (2020).
- Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4596-4601 (2004).
- Bates, J. M., et al. Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation. Dev Biol. 297 (2), 374-386 (2006).
- Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
- Xia, H., et al. Zebrafish: An efficient vertebrate model for understanding role of gut microbiota. Mol Med. 28 (1), 161 (2022).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: Staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nat Protoc. 3 (12), 1862-1875 (2008).
- Shan, Y., et al. Immersion infection of germ-free zebrafish with listeria monocytogenes induces transient expression of innate immune response genes. Front Microbiol. 6, 373 (2015).
- Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. A. Zebrafish axenic larvae colonization with human intestinal microbiota. Zebrafish. 15 (2), 96-106 (2018).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, danio rerio: A staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
- Clift, D., Richendrfer, H., Thorn, R. J., Colwill, R. M., Creton, R. High-throughput analysis of behavior in zebrafish larvae: Effects of feeding. Zebrafish. 11 (5), 455-461 (2014).
- Nascimento, M. D., Schorer, M., Dos Santos, J. C. E., Rocha, M. S. A., Pedreira, M. M. Live and frozen Artemia nauplii for catfish (steindachner, 1876) larvae in different salinities. Trop Anim Health Prod. 52 (2), 653-659 (2020).
- Jia, P. P., et al. Breaking the mold: The first report on germ-free adult marine medaka (oryzias melastigma) models. bioRxiv. , (2023).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. JoVE. (69), e4196 (2012).
- Wilson, C.
- Aleström, P. a-O., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C.
- Nursyirwani, N., et al. Phenotype and genotype of lactic acid bacteria (lab) isolated from the tiger grouper Epinephelus fuscoguttatus alimentary tract. F1000Res. 6, 1984 (2017).
- Karolenko, C., Desilva, U., Muriana, P. M. Microbial profiling of biltong processing using culture-dependent and culture-independent microbiome analysis. Foods. 12 (4), 844 (2023).
- Jia, P. P., et al. Chronic exposure to graphene oxide (go) induced inflammation and differentially disturbed the intestinal microbiota in zebrafish. Environ Sci Nano. 6 (8), 2452-2469 (2019).
- Sun, B. L., et al. Probiotic supplementation mitigates the developmental toxicity of perfluorobutanesulfonate in zebrafish larvae. Sci Total Environ. 799, 149458 (2021).
- Qian, H. F., Liu, G. F., Lu, T., Sun, L. W. Developmental neurotoxicity of microcystis aeruginosa in the early life stages of zebrafish. Ecotoxicol Environ Saf. 151, 35-41 (2018).
- Bertotto, L. B., Catron, T. R., Tal, T. Exploring interactions between xenobiotics, microbiota, and neurotoxicity in zebrafish. Neurotoxicology. 76, 235-244 (2020).
- Jia, P. P., et al. Bacteriophage-based techniques for elucidating the function of zebrafish gut microbiota. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (7-8), 2039-2059 (2023).
- Xin, G. Y., et al. Gut bacteria vibrio sp. And aeromonas sp. Trigger the expression levels of proinflammatory cytokine: First evidence from the germ-free zebrafish. Fish Shellfish Immunol. 106, 518-525 (2020).
- Dremova, O., et al. Sterility testing of germ-free mouse colonies. Front Immunol. 14, 1275109 (2023).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, danio rerio: A gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Rolig, A. S., Parthasarathy, R., Burns, A. R., Bohannan, B. J. M., Guillemin, K. Individual members of the microbiota disproportionately modulate host innate immune responses. Cell Host Microbe. 18 (5), 613-620 (2015).
- Stressmann, F. A., et al. Mining zebrafish microbiota reveals key community-level resistance against fish pathogen infection. ISME J. 15 (3), 702-719 (2021).
- Guitton, E., et al. Production of germ-free fast-growing broilers from a commercial line for microbiota studies. JoVE. (160), e61148 (2020).
- Rea, V., Bell, I., Ball, T., Van Raay, T. Gut-derived metabolites influence neurodevelopmental gene expression and wnt signaling events in a germ-free zebrafish model. Microbiome. 10 (1), 132 (2022).
- Russo, P., et al. Zebrafish gut colonization by mcherry-labelled lactic acid bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 99 (8), 3479-3490 (2015).
- Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Ley, R. E., Gordon, J. I. Reciprocal gut microbiota transplants from zebrafish and mice to germ-free recipients reveal host habitat selection. Cell. 127 (2), 423-433 (2006).
