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Developmental Biology

लार्वा से किशोर चरणों तक रोगाणु मुक्त जेब्राफिश मॉडल की पीढ़ी, रखरखाव और पहचान

Published: April 12, 2024 doi: 10.3791/66512
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1School of Public Health, Chongqing Medical University

Summary

यह प्रोटोकॉल रोगाणु मुक्त (जीएफ) मछली भ्रूण प्राप्त करने और उन्हें किशोर चरण तक लार्वा से बनाए रखने के लिए प्राथमिक चरणों की रूपरेखा तैयार करता है, जिसमें नमूना लेना और उनकी बाँझ स्थिति का पता लगाना शामिल है। संक्रमण के साथ जीएफ मॉडल का उपयोग मेजबान स्वास्थ्य में रोगाणुओं की भूमिका को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।

Abstract

ज़ेब्राफिश स्तनधारियों के साथ उनकी जीनोमिक समानताओं, अपेक्षाकृत स्वच्छ कोरियोन वातावरण में विकसित पारदर्शी भ्रूण, और कृंतक मॉडल की तुलना में लार्वा के बेहद तेजी से विकास के कारण विकास, प्रतिरक्षा और आंत माइक्रोबायोटा पर शोध के लिए मूल्यवान मॉडल के रूप में काम करते हैं। रोगाणु मुक्त (जीएफ) जेब्राफिश (डैनियो रेरियो) प्रदूषक विषाक्तता का मूल्यांकन करने और माइक्रोबियल कार्यों से संबंधित मानव जैसी बीमारी मॉडल स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। पारंपरिक रूप से उठाए गए (सीआर) मॉडल (आम पति में मछली) की तुलना में, जीएफ जेब्राफिश मेजबान माइक्रोबायोटा के अधिक सटीक हेरफेर की अनुमति देता है, सूक्ष्मजीवों और मेजबानों के बीच कारण संबंध निर्धारित करने में सहायता करता है। नतीजतन, वे इन रिश्तों की हमारी समझ को आगे बढ़ाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। हालांकि, जीएफ जेब्राफिश मॉडल आमतौर पर प्रतिरक्षा समारोह और पोषक तत्वों के अवशोषण में सीमाओं के कारण प्रारंभिक जीवन चरणों (भ्रूण से लार्वा तक) के दौरान उत्पन्न और शोध किए जाते हैं। यह अध्ययन जीएफ भोजन (जैसे आर्टेमिया एसपी, ब्राइन झींगा) का उपयोग करके खिलाए बिना और लंबे समय तक खिलाने के साथ शुरुआती जीएफ जेब्राफिश मॉडल की पीढ़ी, रखरखाव और पहचान का अनुकूलन करता है। प्रक्रिया के दौरान, दैनिक नमूना और संस्कृति प्रदर्शन किया और प्लेटों और 16S rRNA अनुक्रमण सहित कई detections के माध्यम से की पहचान की गई. उत्पन्न मॉडल की गुणवत्ता और मात्रा सुनिश्चित करने के लिए जीएफ जेब्राफिश की सड़न रोकनेवाला दर, अस्तित्व और विकासात्मक सूचकांक दर्ज किए गए थे। महत्वपूर्ण बात, इस अध्ययन जीएफ मछली के लिए बैक्टीरियल अलगाव और संक्रमण तकनीक पर विवरण प्रदान करता है, GF खाद्य समर्थन के साथ किशोर चरणों के लिए लार्वा से GF मछली मॉडल के कुशल निर्माण को सक्षम. जैव चिकित्सा अनुसंधान में इन प्रक्रियाओं को लागू करके, वैज्ञानिक आंतों के जीवाणु कार्यों और मेजबान स्वास्थ्य के बीच संबंधों को बेहतर ढंग से समझ सकते हैं।

Introduction

माइक्रोबायोटा (यानी, आर्किया, बैक्टीरिया, यूकेरिया, और वायरस) मेजबान स्वास्थ्य को बनाए रखने और आंतों की बाधा, उपकला सतह के भीतर सहजीवी बातचीत के माध्यम से शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं को प्रभावित करके विभिन्न रोगों के विकास में योगदान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और व्यक्तियोंमें श्लेष्म कार्य 1,2,3. विभिन्न जीवन चरणों में माइक्रोबायोटा की संरचना, शैशवावस्था से लेकर युवावस्था, वयस्कता और उम्र बढ़ने तक, साथ ही साथ नरेस, मौखिक, त्वचा और आंत साइटों जैसे विभिन्न स्थानों में इसकी उपस्थिति, गतिशील रूप से विविध आवासों और वातावरण द्वारा आकार दी जातीहै। जीवों में आंतों माइक्रोबायोटा पोषक तत्व अवशोषण, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, रोगज़नक़ आक्रमण, चयापचय विनियमन, आदि 5,6 में शामिल है। रोगियों पर अध्ययन से पता चला है कि आंत माइक्रोबायोटा में व्यवधान मानव मोटापा, नींद संबंधी विकार, अवसाद, सूजन आंत्र रोग (आईबीडी), न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग (पार्किंसंस, अल्जाइमर), उम्र बढ़ने और विभिन्न कैंसर 7,8,9से संबंधित हैं। इसके अलावा, आंत माइक्रोबायोटा और मेजबानों के बीच इंटरैक्टिव रास्ते भड़काऊ कारकों, न्यूरोट्रांसमीटर, चयापचयों, आंतों बाधा, और oxidative तनाव शामिल, चूहों और मछली मॉडल10,11 का उपयोग पिछले अनुसंधान में मनाया के रूप में.

हाल ही में, नैदानिक और पशु मॉडल में इन विकारों के लिए संभावित प्रोबायोटिक्स और फेकल माइक्रोबायोटा प्रत्यारोपण (एफएमटी) सहित कई बैक्टीरिया से संबंधित दृष्टिकोण या उपचार का पता लगाया गया है। ये अन्वेषण माइक्रोबायोटा-आंत-मस्तिष्क/यकृत/गुर्दे की धुरी, माइक्रोबायोटा-व्युत्पन्न उत्पादों, और परिवर्तित रिसेप्टर गतिविधि 12,13से संबंधित खोजों पर आधारित हैं। हालांकि, माइक्रोबायोटा-होस्ट सिस्टम के विकास, विभिन्न कार्यों और तंत्र को अभी भी माइक्रोबियल समुदाय की जटिलता और शक्तिशाली मानव जैसी बीमारी मॉडल पैदा करने की चुनौती के कारण अपूर्ण रूप से समझा और पहचाना जाता है।

इन मुद्दों को हल करने के लिए, रोगाणु मुक्त (GF) पशु मॉडल 19वीं शताब्दी के मध्य में तत्काल प्रस्तावित किए गए थे और मुख्य रूप से 20वीं शताब्दी के दौरान विकसित किए गए थे। बाद में शोधन, एंटीबायोटिक इलाज और gnotobiotic मॉडल सहित, माइक्रोबियल का पता लगाने और अवलोकन प्रौद्योगिकियों में प्रगति के साथ, आगे इन मॉडलों 14,15,16 परिपूर्ण है. जीएफ जानवरों, अपनी पृष्ठभूमि को मिटाने और पर्यावरण रोगाणुओं से परहेज करके बनाई गई, सूक्ष्मजीवों और उनके मेजबानों17 के बीच बातचीत की खोज के लिए एक उत्कृष्ट रणनीति प्रदान करते हैं। पशु मॉडल और परिष्कृत प्रोटोकॉल के आवेदन के माध्यम से, शोधकर्ताओं ने जीएफ चूहों और मछली में रोगियों में पाए जाने वाले समान माइक्रोबियल रचनाओं को सफलतापूर्वक दोहराया है। इसके अतिरिक्त, इस तरह के कुत्तों, मुर्गियों, और सूअरों के रूप में अन्य GF पशु मॉडल, अनुसंधान विषयों18,19,20,21के रूप में विविध विकल्प प्रदान करते हैं. इस दृष्टिकोण ने मनुष्यों16,18 में कैंसर इम्यूनोथेरेपी सहित विभिन्न रोगों पर कॉमेंसल माइक्रोबायोम के संभावित चिकित्सीय प्रभावों की जांच को सक्षम किया है। जीएफ मॉडल मेजबानों के भीतर विशिष्ट जीवाणु उपनिवेशीकरण, प्रवासन, गुणन और बातचीत की विशेषताओं और तंत्र में अधिक सटीक अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं। यह घटना और माइक्रोबायोटा से संबंधित रोगों22,23 के विकास में महत्वपूर्ण उपन्यास अंतर्दृष्टि प्रदान करता है. माइक्रोबियल अनुसंधान में GF जेब्राफिश को स्थापित करने और लागू करने का इतिहास 2004 में रॉल्स एट अल और 2006 में बेट्स एट अल की रिपोर्ट से 2017 में मेलानकॉन एट अल के प्रोटोकॉल 16,24,25 तक विकसित हुआ है। हालांकि, वयस्क या प्रजनन जीएफ मॉडल की व्यवहार्यता अभी भी एक लंबी प्रक्रिया है, जिसमें चर दीर्घायु, सफलता दर और स्वास्थ्य चुनौतियां हैं।

विभिन्न पशु मॉडल के बीच, जेब्राफिश (डैनियो रेरियो) मानव अंगों और जीनोमिक्स, लघु विकास चक्र, उच्च उर्वरता, और पारदर्शी भ्रूण19,26 के लिए अपनी लाभप्रद समानता के कारण बुनियादी और जैव चिकित्सा अनुसंधान दोनों के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में बाहर खड़ा है। ज़ेब्राफिश, विश्वसनीय मानव रोग मॉडल के रूप में सेवारत, विवो में शारीरिक और रोग प्रक्रियाओं का एक दृश्य प्रतिनिधित्व प्रदान करता है, जो मेजबान-माइक्रोब इंटरैक्शन की आकर्षक विशेषताओं में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। विशेष रूप से, जेब्राफिश आंतों के शरीर विज्ञान, माइक्रोबियल गतिशीलता, गोनाड और प्रजनन विकास, मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली, व्यवहार और चयापचय27 की परिपक्वता की इमेजिंग की अनुमति देते हुए अलग-अलग सेल वंशावली प्रदर्शित करती है। ज़ेब्राफिश भ्रूण हैचिंग तक सुरक्षात्मक कोरियन के भीतर विकसित होते हैं, 3 दिनों के बाद निषेचन (डीपीएफ) में लार्वा बन जाते हैं। वे सक्रिय रूप से 5 डीपीएफ पर भोजन के लिए शिकार करते हैं और निषेचन (एमपीएफ)28के 3 महीने बाद यौन परिपक्वता तक पहुंचते हैं। रॉल्स एट अल.24 द्वारा रिपोर्ट की गई पहली सफल रोगाणु-मुक्त (जीएफ) जेब्राफिश ने दिखाया कि जर्दी अवशोषण के बाद ऑटोक्लेव्ड फ़ीड के साथ खिलाए गए लार्वा ने 8 डीपीएफ से ऊतक परिगलन और 20 डीपीएफ पर कुल मृत्यु का प्रदर्शन किया। यह आहार के प्रभाव या लंबी अवधि (>7 डीपीएफ) जीएफ मछली29 से जुड़े प्रयोगों में बहिर्जात पोषक तत्वों की आपूर्ति पर विचार करने के महत्व का संकेत दिया. बाद के अध्ययनों जीएफ मछली की पीढ़ी प्रोटोकॉल में सुधार, बाँझ भोजन और विभिन्न मछली मॉडल16 में सिद्ध तरीकों को रोजगार.

हालांकि, जीएफ जेब्राफिश मॉडल पर अधिकांश शोध प्रारंभिक जीवन चरणों पर ध्यान केंद्रित किया गया है, जिसमें 24 घंटे से 48 घंटे के लिए 5 डीपीएफ पर जीवाणु संक्रमण शामिल है, प्रयोगों 25,30,31के समापन पर 7 डीपीएफ से पहले एकत्र किए गए नमूनों के साथ। यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि मनुष्यों और ज़ेब्राफिश सहित जीवों में माइक्रोबायोटा, जीवन की शुरुआत में उपनिवेशित होता है और विकास और विकास के दौरान आकार लेता है। रचना वयस्क चरणों में स्थिर रहती है, मेजबान में माइक्रोबायोटा की भूमिकाएं जीवन भर महत्वपूर्ण होती हैं, विशेष रूप से उम्र बढ़ने, न्यूरोडीजेनेरेटिव, चयापचय से संबंधित मोटापा और आंतों की बीमारीके पहलुओं में 3. इस प्रकार, लंबे समय तक जीवित रहने वाले जीएफ जानवरों के दृष्टिकोण प्रारंभिक जीवन में मछली लार्वा की अपरिपक्व प्रतिरक्षा और प्रजनन प्रणाली पर विचार करते हुए, मेजबान अंग विकास और कार्यों में माइक्रोबियल भूमिकाओं के तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं। जबकि जेब्राफिश आंतों में जीवाणु उपभेदों को अलग किया गया है और पिछले अध्ययनों में पहचाना गया है, मेजबान19,25 में प्रोबायोटिक्स या अनुसंधान जीवाणु कार्यों का चयन करने के लिए जीएफ पशु मॉडल को संक्रमित करने की क्षमता की पेशकश करते हुए, जीएफ मछली मॉडल की पीढ़ी और आवेदन मुख्य रूप से प्रारंभिक जीवन चरणों तक ही सीमित है। जटिल उत्पादन प्रक्रिया, उच्च रखरखाव लागत और भोजन और प्रतिरक्षा के साथ जुड़े मुद्दों के लिए जिम्मेदार यह सीमा, मेजबान में माइक्रोबायोटा के विकासात्मक और पुराने प्रभावों की जांच के उद्देश्य से अनुसंधान प्रयासों में बाधा डालती है।

जीवित रहने की दर, व्यवहार, विकास, परिपक्वता, और मछली के समग्र स्वास्थ्य, विशेष रूप से रोगाणु मुक्त (जीएफ) मॉडल में, काफी खिला प्रथाओं से प्रभावित होते हैं, पोषण का सेवन और प्रारंभिक लार्वा से किशोर32,33 के लिए मुंह खुली अवधि के दौरान अवशोषण को शामिल करते हैं. हालांकि, जीएफ मछली पालन में चुनौतियों में से एक उपयुक्त बाँझ आहार की कमी है, जो लार्वा के विकास और अस्तित्व को बनाए रखने के लिए पोषण संबंधी सहायता की प्रभावशीलता को सीमित करता है। इस मुद्दे को हल करना जीएफ मछली के जीवन को बहाल करने के लिए महत्वपूर्ण है, आंतों के माइक्रोबायोम की अनुपस्थिति के कारण उनके विकासात्मक रक्षा तंत्र और कमजोर पाचन क्षमताओं पर विचार करना। भोजन के संदर्भ में, जीवित नमकीन झींगा (आर्टेमिया एसपी) किशोर मछली के लिए मुंह खोलने वाले लार्वा के लिए सबसे उपयुक्त आहार के रूप में उभरता है। यह देखा गया है कि जीवित नमकीन झींगा के साथ खिलाया मछली पके हुए अंडे की जर्दी या अन्य प्राकृतिक और सिंथेटिक चारा34 के साथ खिलाया उन लोगों की तुलना में उच्च विकास और जीवित रहने की दर का प्रदर्शन. जबकि जीएफ मछली के शुरुआती जीवन मॉडल जर्दी समर्थन के साथ जीवित रह सकते हैं और जीएफ लार्वा मॉडल को बाँझ खिला के साथ बनाए रखा जा सकता है, लार्वा से किशोरों तक दीर्घकालिक मॉडल पैदा करना और यौन परिपक्वता तक पहुंचना चुनौतीपूर्ण बना हुआ है। इसके अतिरिक्त, परत या पाउडर भोजन असमान पोषण संरचना द्वारा सीमित है और पानी की गुणवत्ता को प्रभावित कर सकता है। इसके विपरीत, जीवित आर्टेमिया के फायदे हैं जैसे नमक और मीठे पानी दोनों में जीवित रहना, वयस्कों के लिए लार्वा के लिए उपयुक्त छोटे आकार, बैचिंग में आसानी, और उच्च हैचिंग गुणवत्ता35. पिछले तरीकों 16,24,30 पर बिल्डिंग, हम जटिल उपचार प्रक्रिया को सरल बना दिया है और आसानी से ऊष्मायन GF लाइव Artemia सपा स्थापित करके आहार चुनौती को संबोधित प्रारंभिक जीवन GF मछली की तुलना में लंबी अवधि के लिए बाँझ भोजन के रूप में.

यह अध्ययन एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जिसमें (1) पीढ़ी, (2) रखरखाव, (3) बाँझ दर की पहचान, और (4) भ्रूण से लार्वा और किशोर चरणों तक रोगाणु मुक्त (जीएफ) जेब्राफिश के विकास को सुनिश्चित करने के लिए रखरखाव और खिला है। परिणाम जीएफ जेब्राफिश की हैचिंग, अस्तित्व, विकास और बाँझपन पर प्रारंभिक साक्ष्य प्रदान करते हैं, साथ ही जीएफ आर्टेमिया एसपी के लिए आवश्यक सूचकांक बाँझ भोजन के रूप में। मॉडल पीढ़ी और बाँझ जीवित खाद्य पदार्थों की तैयारी में विस्तृत कदम निर्माण और लंबी अवधि GF मछली मॉडल लागू करने के लिए महत्वपूर्ण तकनीकी सहायता प्रदान करते हैं, साथ ही माइक्रोबायोटा-होस्ट इंटरैक्शन रिसर्च में GF Artemia sp. प्रोटोकॉल जीएफ मछली मॉडल पर बैक्टीरियल अलगाव, पहचान और संक्रमण को संबोधित करता है, बैक्टीरियल प्रतिदीप्ति लेबलिंग के लिए तरीकों की रूपरेखा तैयार करता है और माइक्रोस्कोप के तहत मछली आंतों में उनके उपनिवेशण का अवलोकन करता है। जीएफ मछली, जीवाणु संक्रमण के साथ ग्नोटोबायोटिक मछली, या स्थानांतरित मानव माइक्रोबायोटा मॉडल मेजबान प्रतिरक्षा, पाचन, व्यवहार, ट्रांसक्रिप्टोमिक विनियमन और चयापचय पहलुओं पर उनके कार्यों और प्रभावों को स्पष्ट करने के लिए विभिन्न पहचानों से गुजरेंगे। लंबी अवधि में, इस प्रोटोकॉल को विभिन्न जंगली प्रकार की मछली प्रजातियों, जैसे समुद्री मेडका, और संभावित रूप से विशिष्ट ऊतकों या बीमारियों से संबंधित अन्य चयनित ट्रांसजेनिक जेब्राफिश लाइनों तक बढ़ाया जा सकता है।

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Protocol

मछली के प्रयोग चूंगचींग की पशु देखभाल और उपयोग समिति और चोंगकिंग मेडिकल यूनिवर्सिटी, चीन की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के दिशानिर्देशों के साथ-साथ गुणवत्ता और तकनीकी पर्यवेक्षण राज्य ब्यूरो द्वारा जारी प्रयोगात्मक जानवरों के मानकों के अनुसार आयोजित किए गए थे (अनुमोदन आईडी: GB14922-2001 से GBT14927-2001)। ज़ेब्राफिश (डैनियो रेरियो, जंगली प्रकार, एबी तनाव) हाइड्रोबायोलॉजी संस्थान, चीनी विज्ञान अकादमी से प्राप्त किए गए थे, और पहले से रिपोर्ट की गई प्रक्रियाओं36 के बाद प्रयोगशाला में बनाए रखा गया था।

1. वयस्क जेब्राफिश रखरखाव और भ्रूण संग्रह

नोट: पिछले अध्ययनों और रिपोर्ट 16,37,38,39 से संशोधनों पर आकर्षित, वयस्क जेब्राफिश, लार्वा पालन, और हमारी प्रयोगशाला में रोगाणु मुक्त (जीएफ) मॉडल के लिए प्रथाओं के रखरखाव नीचे उल्लिखित चरणों के बाद किया गया. मछली पालन के लिए अल्ट्रा-शुद्ध प्रवाह प्रणाली व्यावसायिक रूप से प्राप्त की गई थी (सामग्री की तालिकादेखें)। संतुलित पीएच, नमक और क्षार के साथ बनाए रखा गया पानी, स्वच्छ परिस्थितियों को सुनिश्चित करने के लिए साइकिल चलाने के दौरान निस्पंदन से गुजरता है।

  1. अंधेरे के एक photoperiod के साथ ऑटो चक्र प्रणाली ( सामग्री की तालिकादेखें) में निम्नलिखित मानक प्रक्रिया के साथ वयस्क मछली बनाए रखें: प्रकाश = 10 घंटे: 14 घंटे 28 डिग्री सेल्सियस ± 0.5 डिग्री सेल्सियस पर और ताजा ऊष्मायन आर्टेमिया सपा के साथ खिलाया. दिन में दो बार।
  2. यौन परिपक्व वयस्क ज़ेब्राफिश (नर: मादा = 2: 1) को रात पहले ताजे और साफ पानी के साथ टैंकों में डालें।
  3. मछली को अगली सुबह (लगभग 8:30 बजे) प्रयोगशाला में नियमित प्रकाश उत्तेजना के तहत घूमने दें। 1-2 घंटे के बाद, मछली को दूसरे टैंक में स्थानांतरित करें।
  4. एक डिस्पोजेबल पाश्चर विंदुक का उपयोग कर एक संस्कृति पकवान में पालन माध्यम के रूप में ऑटो साइक्लिंग प्रणाली से पानी में भ्रूण इकट्ठा.

2. भ्रूण से लार्वा तक GF जेब्राफिश का निर्माण

नोट: रोगाणु मुक्त (जीएफ) मछली पैदा करने की प्रक्रिया चित्रा 1 में उल्लिखित है, जबकि पारंपरिक (सीआर) और जीएफ मॉडल के बुनियादी विकास सूचकांक पूरक चित्रा 1में प्रस्तुत किए गए हैं। कृपया एक बेंचटॉप जैविक सुरक्षा कैबिनेट या लामिना का प्रवाह हुड में एक साफ कमरे में एक बाँझ सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर नीचे उल्लिखित चरणों का पालन करें.

  1. मछली संस्कृति पानी का उपयोग भ्रूण धो लें और मल, अशुद्धियों और मृत या unfertilized अंडे को हटा दें.
  2. भ्रूण को निष्फल प्लेटों (10 सेमी व्यास के साथ बाँझ पकवान प्रति 480 भ्रूण तक) में स्थानांतरित करें, एंटीबायोटिक रोगाणु मुक्त जेब्राफिश माध्यम (एबी-जीजेडएम, सामग्री की तालिकादेखें) समाधान और संस्कृति से भरा 6-8 घंटे के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस।
    नोट: एबी-GZM सतह सूक्ष्मजीवों को खत्म करने के लिए कई घंटे के लिए भ्रूण के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है, और एंटीबायोटिक दवाओं के बिना GZM उपक्रम में GF मछली संस्कृति के लिए प्रयोग किया जाता है. आमतौर पर, सिद्ध संस्कृति का समय 6 घंटे है)।
  3. सफेद धब्बे या एक सफेद उपस्थिति के साथ अंडे को बाहर करें, और उन है कि सामान्य रूप से विकसित कर रहे हैं का चयन करें, आगे की प्रक्रिया के लिए पारदर्शी और बरकरार लिफाफे प्रदर्शित.
  4. 10 मिनट के भीतर तीन बार एबी-जीजेडएम का उपयोग करके भ्रूण को कुल्ला।
  5. भ्रूण को 1 मिनट के लिए 0.2 ग्राम/एल पोविडोन-आयोडीन समाधान (पीवीपी-आई) में भिगोएँ ( सामग्री की तालिकादेखें)।
    नोट: उच्च एकाग्रता और 2 मिनट से अधिक समय तक भ्रूण की मृत्यु और हैचिंग दर को प्रभावित करेगा।
  6. 10 मिनट के भीतर तीन बार रोगाणु मुक्त जेब्राफिश मध्यम (GZM) का उपयोग कर भ्रूण धो लें.
  7. सोडियम हाइपोक्लोराइट (NaClO) काम कर समाधान में भ्रूण जोड़ें, कसकर 50 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को कवर करें, और 15 मिनट के लिए ब्लीच। इस अवधि के दौरान, धीरे उन्हें मिलाते हुए ब्लीच समाधान में भ्रूण निलंबित.
  8. 10 मिनट के भीतर तीन बार GZM का उपयोग भ्रूण धो लें.
  9. भ्रूण को 5 भ्रूण और प्रति GZM के 10 एमएल के साथ बाँझ 6-अच्छी प्लेटों में स्थानांतरित करें। उन्हें अंधेरे के फोटोपेरियोड के साथ अल्ट्रा-क्लीन प्लेटफॉर्म या इनक्यूबेटर में संस्कृति: प्रकाश = 10 घंटे: 14 घंटे 28 डिग्री सेल्सियस ± 0.5 डिग्री सेल्सियस संस्कृति घनत्व बाँझ दर को प्रभावित करेगा।
  10. खर्च GZM को हटाने, बाँझ स्थिति का पता लगाने के लिए नमूने के रूप में इसे इकट्ठा करके, और बाँझ GZM की समान मात्रा के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से फिर से भरने से संस्कृति माध्यम को नवीनीकृत करें।
  11. जीवित रहने की दर, अंडे सेने की दर, दिल की धड़कन, शरीर की लंबाई और वजन, आदि सहित जीएफ भ्रूण/लार्वा के बुनियादी विकास सूचकांकों को रिकॉर्डकरें।
  12. जीएफ मछली को विस्तारित मात्रा के साथ उपयुक्त कंटेनरों (व्यंजन, सेल कल्चर फ्लास्क, या कवर के साथ कांच की बोतलें) में स्थानांतरित करें, विकास प्रक्रिया के दौरान बाँझ भोजन प्रदान करें।

3. लार्वा से किशोर तक GF जेब्राफिश का रखरखाव

  1. 7 डीपीएफ से पहले खिलाए बिना जीजेडएम को नवीनीकृत करें और दैनिक बाँझ राज्यों का पता लगाएं (चरण 5 देखें)।
  2. जीजेडएम बदलने से पहले एक बार दैनिक रूप से बाँझ अंडे की जर्दी (अच्छी तरह से प्रति 10 माइक्रोन तैयार स्टॉक समाधान) के साथ 8 डीपीएफ से किशोर चरणों तक जेब्राफिश लार्वा फ़ीड करें।
  3. जीएफ आर्टेमिया एसपी के साथ मिश्रित निष्फल अंडे की जर्दी के साथ 14 डीपीएफ से जीएफ किशोरों को खिलाएं (1-3 आर्टेमिया / लार्वा, चरण 4 देखें), धीरे-धीरे जीएफ मछली के विकास और विकास के साथ खाद्य द्रव्यमान में वृद्धि।
  4. अंडे की जर्दी प्रदान करें जब तक कि सभी मछली आर्टेमिया नुपली का उपभोग न कर सकें।
    नोट: GF Artemia उपयोग करने से पहले बाँझपन परीक्षण से गुजरना चाहिए। बचे हुए आर्टेमिया नुपली की संख्या का आकलन करें, पीछा करने और प्रगति पर कब्जा करने का निरीक्षण करें, और खिला सफलता को इंगित करने के लिए खाए गए भोजन के साथ मछली के शरीर की जांच करें।
  5. 28 डीपीएफ से प्रारंभिक वयस्क चरणों तक, जीएफ आर्टेमिया को एक बार दैनिक (3-5 आर्टेमिया/लार्वा) खिलाएं और अप्रयुक्त या मृत आर्टेमिया, और मृत मछलियों को दैनिक नमूने के रूप में अपशिष्ट जीजेडएम में साफ करें।
  6. जीएफ मछली के विकास के दौरान, 7 डीपीएफ के बाद 6-अच्छी प्लेटों को बाँझ प्लेटों या सेल कल्चर फ्लास्क को 8 से 21 डीपीएफ में बदलें, और फिर 21 डीपीएफ के बाद बाँझ बोतलों में बदलें। प्रत्येक कंटेनर में GF मछली की संख्या और वजन के अनुसार संस्कृति, मध्यम और खाद्य द्रव्यमान बढ़ाएं।
  7. GZM को प्रतिदिन नवीनीकृत करें और GF मॉडल की सफलता सुनिश्चित करने के लिए नमूनों की जांच करें।
    नोट: प्रारंभिक वयस्कता और यौन परिपक्वता तक रोगाणु मुक्त (जीएफ) मछली मॉडल बनाए रखना चुनौतीपूर्ण है, 30 डीपीएफ पर कम औसत जीवित रहने की दर के साथ, आमतौर पर 10% से कम। यह मुख्य रूप से कमजोर प्रतिरक्षा, विलंबित विकास और बिगड़ा हुआ आंतों के कार्य के लिए जिम्मेदार है।

4. पुरानी GF मछली मॉडल के लिए बाँझ भोजन के रूप में GF Artemia nauplii की तैयारी

नोट: रोगाणु मुक्त (जीएफ) आर्टेमिया की खेती और तैयारी विधि चित्रा 2 में उल्लिखित है। ध्यान दें कि निम्नलिखित सभी चरणों को एक बेंचटॉप जैविक सुरक्षा कैबिनेट में आयोजित किया जाता है, एक बाँझ सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग करके।

  1. 5 मिनट के लिए 2.4 ग्राम/एल सोडियम हाइपोक्लोराइट (NaClO, सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके आर्टेमिया सिस्ट के 0.25 ग्राम कुल्ला।
  2. एक निष्फल अल्ट्रा घने फिल्टर (एपर्चर में लगभग 170 जाल) के साथ rinsed Artemia अल्सर फ़िल्टर और निष्फल ultrapure पानी के साथ तीन बार धो लें, 1-2 मिनट के लिए हर बार.
  3. धोया Artemia अल्सर 2.5% निष्फल खारा पानी, मिश्रण, और नीचे उल्लेख चरणों के अनुसार सड़न रोकनेवाला hatching के लिए पैकेज के 100 एमएल में स्थानांतरण.
  4. 50 एमएल इलाज आर्टेमिया अल्सर मिश्रण समाधान को 100 एमएल की मात्रा के साथ एक बाँझ बोतल में पैक करें, इसे फिल्म के साथ सील करें, और 150 आरपीएम पर एक हिलते हुए इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें, प्रकाश के साथ 18 घंटे से 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस।
  5. एक डिस्पोजेबल पाश्चर विंदुक का उपयोग कर मध्य और निचली परतों से हैचिंग Artemia nauplii के लगभग 30 एमएल निकालें.
    नोट: फ्लोटिंग अंडे और खाली गोले को ऊपरी परत तक पहुंचने से रोकें। रोगाणु मुक्त (जीएफ) आर्टेमिया सिस्ट और 24 घंटे के लिए ऊष्मायन नुपली के सूचकांक चित्रा 3में प्रस्तुत किए गए हैं।
  6. एक स्टरलाइज़िंग फिल्टर के साथ आर्टेमिया को फ़िल्टर करें और उन्हें स्टरलाइज़िंग बीकर में अल्ट्राप्योर पानी को स्टरलाइज़ करने के साथ तीन बार, प्रत्येक समय के लिए लगभग 30 एस से 1 मिनट तक धो लें। अंत में, आर्टेमिया मिश्रित समाधान तैयार करने के लिए निष्फल अल्ट्राप्योर पानी के 4 एमएल जोड़ें।
  7. एक डिस्पोजेबल पाश्चर विंदुक का उपयोग करके, ऊपरी परत से सक्रिय रूप से तैरने वाले आर्टेमिया को पुनः प्राप्त करें, धोएं, और खिला और सड़न रोकनेवाला पहचान के लिए नुपली समाधान तैयार करें।

5. पूरे जीवन चरणों में GF मछली मॉडल की पहचान

नोट: रोगाणु मुक्त (जीएफ) मछली के पूरे जीवन चरणों के दौरान, मॉडल की सफलता सुनिश्चित करने के लिए प्रमुख सूचकांक और दैनिक नमूना पहचान महत्वपूर्ण हैं। यह कदम नमूनों के सामान्य वर्गीकरण और पहचान के लिए सामान्य तरीकों (चित्रा 4) को सारांशित करता है।

  1. जीएफ जेब्राफिश लार्वा की उत्तरजीविता स्थिति और दर का निरीक्षण करें और गणना करें। संबंधित दरों की गणना प्रयोगों में, GF मछली अच्छी तरह से प्रति एक मछली के साथ 24- या 48 अच्छी तरह से प्लेटों में सुसंस्कृत हैं.
    1. जीवित रहने की दर = (अवलोकन के समय जीवित मछली की संख्या / अंडे की कुल संख्या) × 100%।
    2. बाँझपन दर = (बाँझ मछली की संख्या/जीवित मछली की संख्या) × 100%।
      नोट: यह प्रोटोकॉल जीवित मछली की बाँझ दर पर केंद्रित है। बाँझ मछली की संख्या जीवित मछली के बीच कई जांच के बाद सफल GF मछली की गिनती के द्वारा निर्धारित किया जाता है. किसी भी मृत मछली या जीवित मछली जीएफ मॉडल जो बैक्टीरिया की उपस्थिति के कारण विफल हो गए हैं, बाद की जीएफ प्रक्रियाओं के दौरान समाप्त हो जाते हैं।
  2. GF जेब्राफिश लार्वा के निम्नलिखित नमूने एकत्र करें।
    1. प्रत्येक अच्छी तरह से या बोतल कंटेनर से GF zebrafish की संस्कृति माध्यम।
    2. मछली का भोजन, जैसे बाँझ अंडे की जर्दी और GF आर्टेमिया।
    3. अपशिष्ट माध्यम, अंडे सेने के बाद अंडे की झिल्ली के टुकड़े और लार्वा से किशोर मछली तक खिला अवधि के दौरान खाद्य अवशेष या मल सहित।
    4. बैक्टीरिया की उपस्थिति की पहचान करने के लिए मृत मछली के नमूने।
    5. मछली मध्यम और एजेंट जो भ्रूण के उपचार में बाँझ नियंत्रण के रूप में उपयोग किए जाते हैं।
    6. सामग्री, ऑपरेटिंग प्लेटफॉर्म, और इनक्यूबेटर, आदि से नमूने।
  3. कई तरीकों का उपयोग करके दैनिक एकत्र किए गए नमूनों का पता लगाएं।
    1. सबसे पहले, 30 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में प्रसार प्लेट विधि और संस्कृति प्लेटों का उपयोग करें।
      1. एरोबिक परिस्थितियों में ट्रिप्टिकेस सोया अगर (टीएसए) प्लेट ( सामग्री की तालिकादेखें) पर अपशिष्ट मध्यम नमूने के 20-50 माइक्रोन के साथ कोट।
      2. एनारोबिक परिस्थितियों में टीएसए प्लेट पर अपशिष्ट मध्यम नमूने के 20-50 माइक्रोन के साथ कोट।
      3. एरोबिक परिस्थितियों में रक्त टीएसए प्लेटों ( सामग्री की तालिकादेखें) पर अपशिष्ट मध्यम नमूने के 20-50 माइक्रोन के साथ कोट।
      4. एनारोबिक परिस्थितियों में रक्त टीएसए प्लेटों पर अपशिष्ट मध्यम नमूने के 20-50 माइक्रोन के साथ कोट।
    2. दूसरा, तरल संस्कृति विधि का उपयोग करें।
      1. 30 डिग्री सेल्सियस, 150-180 आरपीएम पर मिलाते हुए इनक्यूबेटर में मस्तिष्क हार्ट आसव शोरबा (बीएचआई) माध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें) और संस्कृति के साथ एरोबिक ट्यूबों में नमूना के 200 माइक्रोन लें।
      2. 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में बीएचआई माध्यम और संस्कृति के साथ एनारोबिक ट्यूबों में नमूना के 200 माइक्रोन जोड़ें।
      3. Trypticase सोया शोरबा (टीएसबी) माध्यम के साथ एरोबिक ट्यूबों में नमूना के 200 माइक्रोन जोड़ें, तो 30 डिग्री सेल्सियस, 150-180 आरपीएम पर मिलाते हुए इनक्यूबेटर में संस्कृति।
      4. 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में टीएसबी माध्यम और संस्कृति के साथ एनारोबिक ट्यूबों में नमूना के 200 माइक्रोन जोड़ें।
    3. तीसरा, आणविक तकनीक-16s पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) परख का उपयोग करें।
      1. प्राइमर 27F और 1492R, साथ ही 63F और 1387R(तालिका 1)के दो जोड़े के साथ अपशिष्ट जल के नमूने का विश्लेषण करें।
        नोट: पीसीआर मास्टर मिश्रण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए पोलीमरेज़ किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके तालिका 2 के अनुसार तैयार किया गया था, और पीसीआर मशीन तालिका 3में निर्दिष्ट कार्यक्रम के साथ स्थापित की गई थी।
      2. पीसीआर कार्यक्रम पूरा होने के बाद, नमूनों की बाँझपन का अनुमान लगाने के लिए 1465 बीपी (प्राइमर 27F और 1492R का उपयोग करके) या 1324 बीपी (प्राइमर 63F और 1387R का उपयोग करके) के लक्ष्य बैंड पर 1% अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन40 द्वारा उत्पादों की जांच करें।
  4. रिकॉर्ड और 24 घंटे से 3 दिनों और 7 दिनों तक प्लेट और मध्यम संस्कृति सहित बाँझपन परीक्षणों का निरीक्षण करें, जिसके दौरान प्लेटों पर कोई कॉलोनी नहीं है और तरल में कोई मैलापन नहीं है, जीएफ मॉडल के सफल निर्माण का संकेत देता है। प्लेट और माध्यम को 24 घंटे, 48 घंटे, 72 घंटे, 96 घंटे, 120 घंटे, 144 घंटे और 168 घंटे पर देखें और रिकॉर्ड करें।

6. GF मछली पर खिलाने से पहले GF Artemia नमूनों की पहचान

नोट: जीएफ आर्टेमिया नमूनों का पता लगाने के लिए, जो जीएफ मछली(चित्रा 4)पर खिलाने से पहले जीवित भोजन के रूप में अपरिहार्य हैं, नीचे दिए गए चरणों का पालन करें।

  1. GF Artemia मॉडल के नमूने ले लीजिए.
    1. अनुपचारित आर्टेमिया अल्सर।
    2. इलाज जीएफ आर्टेमिया सिस्ट।
    3. रची GF Artemia nauplii.
    4. एक नियंत्रण के रूप में निष्फल अल्ट्राप्योर पानी।
  2. निम्नलिखित विधियों के साथ GF Artemia का पता लगाएं।
    1. एरोबिक और एनारोबिक स्थितियों के तहत टीएसए प्लेटों और रक्त टीएसए प्लेटों पर कोटिंग करके नमूनों का पता लगाने के लिए स्प्रेड प्लेट विधि का उपयोग करें। उन्हें 30 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    2. एरोबिक और एनारोबिक टीएसबी और बीएचआई ट्यूबों में नमूनों का पता लगाने के लिए एक तरल माध्यम का उपयोग करें। 150-180 आरपीएम, 30 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रकार के बरतन में संस्कृति।
    3. 16 एस राइबोसोमल आरएनए लक्ष्य जीन प्राइमरों 27 एफ और 1492 आर, 63 एफ और 1387 आर (तालिका 1) का उपयोग करके एकत्र किए गए नमूनों में बैक्टीरिया की उपस्थिति का पता लगाने के लिए पीसीआर परख का उपयोग करें। वॉल्यूम और प्रोग्राम तालिका 2 और तालिका 3 में दिखाए गए हैं।
  3. परिणाम रिकॉर्ड करें: 1465 बीपी (प्राइमर 27F और 1492R का उपयोग करके) या 1324 बीपी (प्राइमरों 63F और 1387R का उपयोग करके) को मापने वाले लक्ष्य बैंड के लिए 1% अगारोज जेल वैद्युतकणसंचलन40 % द्वारा पीसीआर उत्पाद का पता लगाएं। प्लेटों और तरल माध्यम के परिणाम जीएफ मछली भोजन के रूप में उपयोग किए जाने से पहले जीएफ आर्टेमिया की बाँझ स्थिति सुनिश्चित कर सकते हैं।

7. ज़ेब्राफिश से आंतों के जीवाणु उपभेदों का अलगाव और पहचान

नोट: इन विट्रो और विवो में आंतों के कार्यों का पता लगाने के लिए, जेब्राफिश से बैक्टीरिया के उपभेदों को अलग करना आवश्यक है, जो जीएफ जानवरों (चित्रा 5) का उपयोग करके संक्रमण द्वारा जांच किए गए संभावित प्रोबायोटिक्स के लिए प्रजातियों का स्रोत भी प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम आंतों की सामग्री प्राप्त करने के लिए पारंपरिक विच्छेदन विधि का वर्णन करते हैं, जबकि नमूने भी सीधे लाइव एनेस्थेटाइज्ड मछली (डेटा नहीं दिखाया गया है) से एकत्र किए जा सकते हैं।

  1. स्वस्थ वयस्क ज़ेब्राफिश चुनें और उन्हें बाँझ पानी से धो लें। क्लीन बेंच में निम्न चरणों का पालन करें।
  2. 5-10 मिनट के लिए 100 mg/L MS-222 के साथ मछली को एनेस्थेटाइज करें।
  3. मछली के शरीर की सतह का इलाज करने के लिए 75% अल्कोहल का उपयोग करें।
  4. मछली आंतों काटना और TSB या BHI माध्यम के साथ आंतों सामग्री बाहर निकालना.
  5. एरोबिक और एनारोबिक स्थितियों में टीएसए, रक्त प्लेट, टीएसबी, और बीएचआई माध्यम को लागू करके आंतों के सतह पर तैरनेवाला को इनक्यूबेट करें।
  6. संकेत तनाव हासिल करने और विभिन्न कालोनियों की विशेषताओं को रिकॉर्ड करने के लिए बैक्टीरिया का अनुवाद करें।
  7. बैक्टीरिया को 30% ग्लिसरॉल के भीतर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. फिर, जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण और पीसीआर अनुक्रमण द्वारा आंतों के बैक्टीरिया की पहचान करें।
    नोट: बैक्टीरियल जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के मुख्य चरणों में तरल सेंट्रीफ्यूजेशन, आरएनएसई ए और प्रोटीज के पृथक्करण, एथिल अल्कोहल निष्कर्षण, रिंसिंग, और निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके विघटन शामिल हैं ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  9. बैक्टीरिया और आर्किया डेटाबेस40,41 (सामग्री की तालिकादेखें) के साथ नेशनल सेंटर फॉर बायोटेक्नोलॉजी इंफॉर्मेशन (एनसीबीआई) और बेसिक लोकल एलाइनमेंट सर्च टूल (ब्लास्ट) का उपयोग करके 16 एस अनुक्रमों का विश्लेषण करें।
  10. जीनस स्तर पर पृथक आंतों के उपभेदों की पहचान करने के लिए सबसे अच्छा मिलान बैक्टीरिया और वर्ण चुनें।
  11. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके बैक्टीरियल उपभेदों के चयापचय कार्यों का पता लगाएं ( सामग्री की तालिकादेखें)।

8. फ्लू-लेबल, संक्रमण, और GF zebrafish आंतों में बैक्टीरिया का उपनिवेशण

नोट: जीएफ जेब्राफिश को संक्रमित करने से पहले, पृथक बैक्टीरिया को रंगों के साथ संशोधित किया गया था और गिना गया था, जिससे माइक्रोबियल उपनिवेशण और प्रवास लगातार और विवो (चित्रा 6) में दिखाई दे रहा था।

  1. GF मछली मॉडल को संक्रमित करने के लिए मेजबान में उच्च बहुतायत के साथ संभावित लाभकारी बैक्टीरिया या प्रमुख उपभेदों का चयन करें।
    नोट: इस अध्ययन में इस्तेमाल बैक्टीरिया एरोमोनास सपा और विब्रियो सपा ( सामग्री की तालिकादेखें), 8 पीढ़ी है कि अलग कर रहे थे और प्रयोगशाला42 में वयस्क जंगली प्रकार zebrafish से की पहचान की से चुना गया था.
  2. सीएम-दिल रंजक के साथ ताजा बैक्टीरिया लेबल (सामग्री की तालिकादेखें) और उन्हें 10 6-108 कॉलोनी बनाने इकाइयों (सीएफयू) / एमएल की एकाग्रता के साथ 5 डीपीएफ पर जीएफ जेब्राफिश को बेनकाब करें।
  3. 6 डीपीएफ और 14 डीपीएफ से जीएफ जेब्राफिश लार्वा की आंत में बैक्टीरिया के उपनिवेशण और वितरण को इंगित करने के लिए 3× आवर्धन के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत प्रतिदीप्ति का निरीक्षण करें।
  4. मैन्युअल रूप से प्रत्येक समय बिंदु पर प्लेट संस्कृति द्वारा GF मछली में बैक्टीरिया की संख्या की गणना.
  5. यह सुनिश्चित करने के लिए कालोनियों और अनुक्रमों का पता लगाएं कि संक्रमण लक्ष्य जीवाणु उपभेदों के साथ सफल रहा।
  6. बाद के assays के लिए जीवाणु संक्रमण के साथ जीएफ मछली के नमूने लीजिए, न्यूरो व्यवहार, विकास सूचकांक, हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण, और हार्मोन माप, आदि43,44,45 सहित.
    नोट: संक्रमण प्रयोग में इस्तेमाल बैक्टीरिया नव बरामद और ताजा तरल माध्यम द्वारा सुसंस्कृत होना चाहिए.

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Representative Results

GF zebrafish मॉडल कुशलता से पिछले GF मछली मॉडल35 के आधार पर अनुकूलित प्रोटोकॉल के साथ, zebrafish के जोड़े द्वारा पैदा प्रचुर मात्रा में अंडे का उपयोग करके उत्पादित किया जा सकता है. एक एकल 6 अच्छी तरह से थाली पर्याप्त डेटा संग्रह और सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, लगभग 30-48 भ्रूण/लार्वा संस्कृति कर सकते हैं. बाँझ उपचार के बाद, जीएफ भ्रूण 48-72 घंटे में लार्वा को हैचिंग तक एक साफ इनक्यूबेटर में सुसंस्कृत कर रहे हैं, और रोगाणु मुक्त राज्य (चित्रा 1) को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है जो एकत्रित नमूने, का पता लगाने के साथ दैनिक GZM बदल गया. 7 डीपीएफ के बाद, अंडे की जर्दी और जीवित आर्टेमिया का भोजन लार्वा से किशोर चरणों के लिए तैयार किया जाना चाहिए। मछली की वृद्धि और विकास के दौरान, जीजेडएम की मात्रा, कंटेनर और घनत्व को मृत्यु और बाँझ स्थिति की विफलता से बचने के लिए समय पर विनियमित या परिवर्तित किया जाना चाहिए। यदि पता लगाने से कोई जीवाणु प्रदूषण नहीं दिखता है, तो सफल जीएफ मॉडल को किशोर से शुरुआती वयस्कता तक पुराने लोगों के रूप में बनाए रखा जा सकता है, लेकिन अभ्यास में जीवित रहने की दर बहुत कम है। अंत में, बाँझ दर, जीवित रहने की दर, विकास सूचकांक, व्यवहार, हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण, और जीएफ और सीआर मछली मॉडल के प्रतिलेखन प्रोफाइल को माइक्रोबायोटा और ड्रग स्क्रीन क्षेत्रों के प्रभाव का पता लगाने के लिए मापा जा सकता है। इस अध्ययन में, प्रमुख विकासात्मक सूचकांकों की तुलना की गई (अनुपूरक चित्र 1), और जीएफ मछली की हैचिंग दर सीआर मछली की तुलना में 45.7% कम थी, जिसमें 72 एचपीएफ पर 60% थी। 7 डीपीएफ पर जीएफ लार्वा की हृदय गति 22.6 बीट्स / 10 एस के साथ सीआर मछली की तुलना में 18.2 बीट्स / 10 एस पर काफी कम थी, लेकिन 23.5-23.8 बीट्स / 10 एस की दर के साथ 14 डीपीएफ पर दो समूहों के बीच कोई अंतर नहीं था। 7 डीपीएफ पर जीएफ मछली की उत्तरजीविता दर सीआर मछली के लिए 86.7% के समान थी, लेकिन सीआर मछली के लिए 80% की तुलना में 14 डीपीएफ पर 60% तक कम हो गई। हालांकि, जीएफ और सीआर मछली दोनों की जीवित रहने की दर मुंह खोलने की अवधि के बाद 25% -10% तक कम हो गई जब उन्होंने खिलाने की क्षमता या आदतों का अधिग्रहण किया। मछली की बाँझ स्थिति को बनाए रखने में विफलता कम जीवित रहने की दर के कारणों में से एक थी। इसलिए, किशोर से प्रारंभिक वयस्कता चरणों तक भोजन और पोषक तत्वों का रखरखाव मछली संस्कृति में महत्वपूर्ण चुनौतियां हैं।

एक अन्य महत्वपूर्ण कारक जो मछली की वृद्धि और विकास को प्रभावित करता है वह है खिलाना। इस अध्ययन में, हम किशोरों और वयस्कों (चित्रा 2 में दिखाया गया प्रक्रिया) के लिए लंबी अवधि के जीएफ जेब्राफिश लार्वा के लिए जीवित भोजन के रूप में जीएफ आर्टेमिया प्राप्त करने के लिए कई तरीकों का पता लगाते हैं। जीएफ मछली के लिए भोजन के दैनिक उपयोग के कारण, जीएफ आर्टेमिया के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल व्यवहार में आसान, समय बचाने वाला और किफायती होना चाहिए। माइक्रोस्कोप द्वारा देखे गए नौपली की सक्रिय गति और मृत्यु/गतिहीनता की तुलना करने के बाद, नुपली की विशेषताएं, बिना अंडे वाले अंडे और खोल की विशेषताओं, विधि को सिद्ध किया जाता है। दैनिक इनक्यूबेशन के बाद, हैचिंग, उत्तरजीविता और विकृति दर, और नुपली की लंबाई और वजन सहित बोतलों से प्राप्त ताजा जीएफ आर्टेमिया के सूचकांक को माइक्रोस्कोप(चित्रा 3)के तहत देखा और मापा गया। उपचार के बाद, आर्टेमिया सिस्ट की हैचिंग दर अधिक थी, औसतन 88.15%, तैराकी नौपली का अस्तित्व 77.83% था, और विकृति दर 1.87% थी। नौपली की शरीर की लंबाई 546.70 माइक्रोन थी, और शरीर का वजन सूचकांक 3.80 मिलीग्राम / 100 था, जो लार्वा महीने-खुली अवधि से किशोर और वयस्क चरणों तक मछली पकड़ने और खिलाने के लिए उपयुक्त हैं।

मॉडल रखरखाव के लिए GF मछली और GF Artemia का पता लगाना भी महत्वपूर्ण है। नमूना संग्रह और कई परीक्षण विधियों के अनुसार, परिणाम सुसंस्कृत प्लेट और तरल माध्यम(चित्रा 4)में उपचारित जेब्राफिश भ्रूण और आर्टेमिया सिस्ट की सफलता प्रदान कर सकते हैं। दैनिक एकत्र किए गए विभिन्न नमूनों को सभी परीक्षण विधियों में बाँझ के रूप में पाया जाना चाहिए, जो तब एकत्र करने के समय जीएफ मॉडल को इंगित कर सकते हैं। GF मछली पर खिलाने से पहले GF Artemia का पता लगाया जाना चाहिए, या प्लेट और मध्यम इनक्यूबेटर परिणाम ताजा रहते nauplii के बाँझ राज्य का उल्लेख करना चाहिए. यही है, शेक इनक्यूबेशन में टीएसए प्लेटों या टीएसबी या बीएचआई तरल मध्यम ग्लास पर अल्सर से जीएफ आर्टेमिया की खेती करें, जिसका उपयोग एक ही समय में जीएफ आर्टेमिया और बाँझ सत्यापन उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है। GF Artemia प्रोटोकॉल खिलाने के लिए लार्वा की एक सीमित संख्या को समायोजित कर सकते हैं. खिला प्रक्रिया के दौरान, यह स्पष्ट था कि जीएफ आर्टेमिया जीजेडएम के भीतर तैर गया और फिर जीएफ मछली लार्वा द्वारा कब्जा कर लिया गया और भस्म हो गया।

जीएफ मछली मॉडल के अनुप्रयोगों में जीव विज्ञान और चिकित्सा में विभिन्न क्षेत्रों को शामिल किया गया है, जिससे माइक्रोबियल कार्यों, विकास और विकास, रोग तंत्र, और प्रोबायोटिक या ड्रग स्क्रीनिंग की जांच की अनुमति मिलतीहै। इस अध्ययन में, उदाहरण के लिए, दो प्रमुख आंतों के बैक्टीरिया, एरोमोनास एसपी और विब्रियो एसपी, को ज़ेब्राफिश से अलग किया गया था। कॉलोनी विशेषताओं और पहचान का प्रदर्शन किया गया, और कई चयापचय कार्यों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (चित्रा 5) का उपयोग कर इन विट्रो में मापा गया. इन जीवाणुओं को अलग किया गया और 16S अनुक्रमण के साथ पहचाना गया, और विस्फोट के परिणाम पिछली रिपोर्ट42 में प्रस्तुत किए गए थे। पहचाने गए जीवाणु उपभेद जीएफ मछली मॉडल को संक्रमित करके मेजबान स्वास्थ्य पर एकल या संयुक्त माइक्रोबायोटा के प्रभाव पर वैज्ञानिक अनुसंधान को सक्षम करते हैं। मछली लार्वा की पारदर्शिता मुख्यमंत्री-दिल रंजक का उपयोग प्रतिदीप्ति लेबल जीवाणु कोशिकाओं के अवलोकन की अनुमति देता है, उपनिवेशण और GF मछली (चित्रा 6 में दिखाया गया है) की आंतों में वितरण का खुलासा. 5 डीपीएफ पर जीवाणु संक्रमण के बाद, जीएफ जेब्राफिश लार्वा को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ चित्रित किया जा सकता है और लगातार 6 से 14 डीपीएफ तक मनाया जा सकता है, जो विकासात्मक सूचकांक, हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों और आणविकपरिवर्तनों47के साथ संयुक्त माइक्रोबियल कार्यों में अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।

Figure 1
चित्रा 1: लार्वा और किशोर के लिए भ्रूण से जीएफ जेब्राफिश का प्रोटोकॉल। जीएफ जेब्राफिश की पीढ़ी में महत्वपूर्ण कदमों में शामिल हैं: (1) जंगली प्रकार के जेब्राफिश से भ्रूण का संग्रह और एबी-जीजेडएम में प्लेसमेंट। (2) पूर्ण बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए पीवीपी-I और NaClO एजेंटों के साथ उपचार कुल्ला। (3) जीजेडएम के साथ 6-कूप प्लेटों में जीएफ भ्रूण/लार्वा की संस्कृति, दैनिक माध्यम का नवीनीकरण। (4) इष्टतम वृद्धि और विकास के लिए संस्कृति की स्थिति का विनियमन। (5) विभिन्न विकासात्मक चरणों में नमूनाकरण, प्लेट और तरल माध्यम विधियों का उपयोग करके बाँझपन परीक्षण के बाद। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: जीएफ मछली के लिए लाइव भोजन के रूप में जीएफ आर्टेमिया तैयारी का प्रोटोकॉल। मुख्य चरणों में शामिल हैं: (1) पूर्ण बाँझपन के लिए आर्टेमिया अल्सर का कुल्ला। (2) माध्यम में GF सिस्ट की तैयारी। (3) हैचिंग को बढ़ावा देने के लिए 24 घंटे के लिए नमक के घोल में इनक्यूबेशन। (4) सक्रिय नौपली एकत्र करने के लिए असफल हैचिंग और खाली अंडों का निस्पंदन। (5) मलबे को हटाने के लिए एकत्रित नौपली को धोना, उच्च गुणवत्ता और दूषित मुक्त जीवित भोजन सुनिश्चित करना। (6) जीएफ मछली लार्वा को खिलाने से पहले जीएफ आर्टेमिया की बाँझपन जांच। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: जीएफ आर्टेमिया सिस्ट और नुपली के सूचकांक 24 घंटे के लिए ऊष्मायन (ए) अशुद्धता फिल्म (स्केल बार: 500 माइक्रोन) के साथ अनुपचारित आर्टेमिया अल्सर। (बी) पानी अवशोषण और एक क्लीनर उपस्थिति (स्केल बार: 500 माइक्रोन) के बाद थोड़ा उत्तल सतह के साथ आर्टेमिया अल्सर का इलाज किया। (सी)ताजा ऊष्मायन लाइव जीएफ आर्टेमिया नुपली (स्केल बार: 2000 माइक्रोन) और (डी) 1000 माइक्रोन के स्केल बार के साथ आवर्धन की सूक्ष्म परीक्षा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: प्रत्येक जीवन स्तर और जीएफ आर्टेमिया में जीएफ मछली का बाँझ पता लगाना। (ए) एरोबिक और एनारोबिक स्थितियों के तहत टीएसबी और बीएचआई तरल माध्यम, टीएसए, और रक्त प्लेटों का उपयोग करके सीआर और जीएफ मछली के नमूनों के बाँझ परीक्षण। (बी) अनुपचारित आर्टेमिया सिस्ट, जीएफ आर्टेमिया सिस्ट, और एरोबिक और एनारोबिक स्थितियों के तहत टीएसबी और बीएचआई तरल माध्यम, टीएसए, और रक्त प्लेटों का उपयोग करके नुपली के बाँझ परीक्षण। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: अलगाव और ज़ेब्राफिश में आंतों के बैक्टीरिया की पहचान। (ए) बैक्टीरियल उपभेदों, कालोनियों की विशेषताओं, 16 एस अनुक्रमण नक्शे (उदाहरण: एरोमोनास एसपी और विब्रियो एसपी)। (बी) जीनस और एनसीबीआई परिग्रहण। (सी) जेब्राफिश आंत से अलग बैक्टीरिया के चयापचय कार्य। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्रा 6: जीएफ जेब्राफिश में आंत बैक्टीरिया उपभेदों का संक्रमण और उपनिवेश। (ए) संक्रमण प्रयोगों के लिए पृथक और पहचाने गए जीवाणु उपभेदों की वसूली। (बी) फ्लोरोसेंट रंगों के साथ बैक्टीरिया की लेबलिंग और 5 डीपीएफ पर जीएफ जेब्राफिश लार्वा का संक्रमण। आवर्धन: 1x। (सी) विवो में आंत के ऊतकों में बैक्टीरिया (विब्रियो एसपी) के वितरण और उपनिवेशण का अवलोकन। आवर्धन: 3x. (डी) दैनिक नमूने द्वारा प्रत्येक मछली लार्वा में बैक्टीरिया (एरोमोनास एसपी और विब्रियो एसपी) के सीएफयू की गिनती। डेटा प्रस्तुत करता है माध्य ± SEM. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्राइमरों अनुक्रम (5'-3') उत्पाद की लंबाई
27च AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 1465 बीपी
1492आर ACGGYTACCTTGTTACGACTT
63च CAGGCCTAACACATGCAAGTC 1324 बीपी
1387आर GGGCGGWGTGTACAAGGC

तालिका 1: प्राइमरों बैक्टीरिया का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया.

घटक इकाइयों वॉल्यूम (μL)
टाक डीएनए पोलीमरेज़ 2.5 यू/माइक्रोन 0.1
10× बफर (एमजी2+) --- 2.1
dNTP मिश्रण 2.5 मिमी 1.6
प्राइमर 27F 10 माइक्रोन 1
प्राइमर 1492R 10 माइक्रोन 1
डीएनए/आरएनए मुक्त एच2ओ --- 13.2
टेम्पलेट डीएनए --- 1
कुल मात्रा --- 20

तालिका 2: प्रतिक्रिया प्रति घटकों की अंतिम एकाग्रता और मात्रा।

कहीं जाना तापमान समय चक्र
प्रारंभिक विकृतीकरण 95 डिग्री सेल्सियस 4 मिन --
विकृतीकरण 94 डिग्री सेल्सियस 1 मिन 35
एनीलिंग 55 डिग्री सेल्सियस 1 मिन
विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिन
अंतिम विस्तार 72 डिग्री सेल्सियस 10 मिन --
पकड 4 डिग्री सेल्सियस ∞ --

तालिका 3: 16S आरआरएनए जीन के प्रवर्धन के लिए पीसीआर कार्यक्रम।

अनुपूरक चित्रा 1: जीएफ और सीआर जेब्राफिश मॉडल के महत्वपूर्ण विकास सूचकांक। (ए) 72 एचपीएफ पर सीआर और जीएफ जेब्राफिश की हैचिंग दर, और (बी) 7 डीपीएफ और 14 डीपीएफ पर सीआर और जीएफ मछली के दिल की धड़कन/10 एस। सीआर और जीएफ मछली की उत्तरजीविता दर (%) 7 दिनों और 14 दिनों से 86%, 60% -80% से 30 डीपीएफ पर 10% -25% तक घट गई। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

GF मछली और GF भोजन तैयार करने के प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम
जीएफ मछली मॉडल की पीढ़ी के दौरान, बाँझ सामग्री की तैयारी, भ्रूण की नसबंदी, GZM के दैनिक नवीकरण, विभिन्न नमूनों के संग्रह, और कई तरीकों का उपयोग कर प्रत्येक नमूने की बाँझ परीक्षा सहित कई महत्वपूर्ण कदम शामिल थे. इन चरणों के बीच, भ्रूण का प्रारंभिक उपचार जीएफ मॉडल की सफलता के लिए मौलिक और निर्णायक है। नियंत्रण एजेंट, उनकी सांद्रता और उपचार के समय इष्टतम नसबंदी दर और हैचिंग सफलता प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। सावधानीपूर्वक ध्यान आवश्यक है जब लार्वा के लिए जीएफ मछली भ्रूण को संभालने, दैनिक मध्यम परिवर्तन शामिल है और यह सुनिश्चित करना है कि सामग्री और प्लेटफार्मों को अच्छी तरह से पराबैंगनी प्रकाश या autoclaving का उपयोग कर निष्फल कर रहे हैं जब इनक्यूबेटर से प्लेटों को हटाने. सर्दियों के दौरान तापमान की स्थिति और परिचालन समय की निगरानी करना स्वच्छ बेंचों में कम तापमान के कारण लार्वा की मौत को रोकने के लिए आवश्यक है।

बाँझ अंडे की जर्दी और GF Artemia लंबी अवधि के GF मॉडल के लिए उनके बाँझ राज्य सुनिश्चित करने के लिए 7 dpf के बाद मछली को खिलाया जा रहा से पहले पता लगाने से गुजरना चाहिए. खिला अवधि के दौरान, अपशिष्ट माध्यम को नवीनीकृत करते समय पता लगाने के लिए एकत्र किए गए नमूनों के हिस्से के रूप में खाद्य अवशेषों की सफाई महत्वपूर्ण है। कंटेनर, जीजेडएम की मात्रा, और खाद्य द्रव्यमान को सीमित परिवेश और पानी की गुणवत्ता के मुद्दों के कारण जीएफ मछली के नुकसान को रोकने के लिए विकास और विकास चरणों के साथ समायोजित किया जाना चाहिए। इन मापदंडों में नियमित निगरानी और समायोजन GF मछली मॉडल के सफल रखरखाव में योगदान करते हैं।

इन प्रोटोकॉल के संशोधन और महत्व
जीएफ जेब्राफिश भ्रूण उत्पन्न करने के लिए सरलीकृत तीन-चरण प्रक्रिया, जिसमें अनुकूलित एजेंट, सांद्रता और एबी-जीजेडएम, पीवीपी-आई और एनएसीएलओ समाधान के जोखिम समय शामिल हैं, एक उच्च बाँझ दर और मॉडल के स्वस्थ विकास को सुनिश्चित करता है। इसके अतिरिक्त, दैनिक नमूनों के लिए बाँझ पता लगाने के तरीकों को एरोबिक और एनारोबिक स्थितियों के तहत प्लेटों और तरल मध्यम संस्कृतियों को शामिल करने के लिए सिद्ध किया गया है, साथ ही सामान्य जीवाणु प्राइमरों का उपयोग करके आणविक तकनीकों के साथ। बैक्टीरियल और फंगल दूषित पदार्थों के परीक्षण में आगे के अनुभवों का उद्देश्य जीएफ पशु तकनीकों48 के दौरान आइसोलेटर संदूषकों और बाँझ परीक्षण का अनुकूलन करना है।

मछली मॉडल के लिए जीवित भोजन के रूप में जीएफ आर्टेमिया नुपली के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल की जांच हमारे अध्ययन में की गई है, और चीन के राष्ट्रीय बौद्धिक संपदा प्रशासन (सं। ZL202210482684.8). दीर्घकालिक जीएफ मछली मॉडल लगातार अपर्याप्त और अनुपयुक्त पोषण से विवश होते हैं, पाचन और अवशोषण से संबंधित आंत कार्यों में कमजोरियों को बढ़ाते हैं। विभिन्न जीवन चरणों में मेडका और जेब्राफिश मॉडल के लिए एक विश्वसनीय खाद्य स्रोत के रूप में, जीएफ आर्टेमिया एसपी को एक सरल प्रक्रिया, लघु इनक्यूबेशन समय और दैनिक उपयोग के लिए वास्तविक समय बाँझ पहचान के साथ तैयार करना आसान होना चाहिए। इस विधि में, सामान्य आर्टेमिया सिस्ट को सड़न रोकनेवाला होने के लिए NaClO की पर्याप्त सांद्रता में धोया जाता है और फिर एक फिल्म-लेपित बोतल में, साथ ही एक प्लेट पर और पता लगाने के लिए एक तरल माध्यम में इनक्यूबेट किया जाता है। यह GF मछली खिलाने के लिए हौसले से सेने वाली नौपली का समर्थन करता है। आर्टेमिया की बाँझ दर और हैचिंग दर, साथ ही शरीर की लंबाई, वजन और गतिविधि उत्कृष्ट हैं, जो व्यवहार में उपलब्ध अनुप्रयोगों का संकेत देते हैं।

जीएफ मछली और जीएफ खाद्य प्रोटोकॉल में इन संशोधनों का महत्व भ्रूण, लार्वा, किशोर चरणों और यहां तक कि समुद्री और मीठे पानी के मोड में शुरुआती वयस्क और वयस्क चरणों में मॉडल बनाने में शोधकर्ताओं को लाभान्वित करता है। दीर्घकालिक जीएफ जानवर मेजबान विकास और विकास के दौरान दवा स्क्रीनिंग और माइक्रोबियल कार्यों पर शोध में विवो मॉडल के रूप में अनुमति प्रदान करेंगे, विशेष रूप से प्रतिरक्षा और संबंधित आंतों की कोशिका लाइनों की परिपक्वता में। उदाहरण के लिए, जेब्राफिश लार्वा केवल पहले सप्ताह में जन्मजात प्रतिरक्षा के अधिकारी, तो थाइमस परिपक्वता31,49 के साथ, 7-21 डीपीएफ के दौरान अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली विकसित. इसके अलावा, जीएफ मछली मॉडल जीवों50,51 में गतिशील उपनिवेशण और प्रवास प्रक्रियाओं के लाइव अवलोकन के साथ बैक्टीरिया-बैक्टीरिया और माइक्रोबायोटा-होस्ट इंटरैक्शन का विश्लेषण करने की संभावना प्रदान कर सकते हैं।

विधि की सीमाएं
किशोरों से शुरुआती वयस्कों (28 डीपीएफ-2.5 एमपीएफ) और यौन परिपक्व वयस्कों (>2.5 एमपीएफ) से जीएफ मछली की खेती मृत्यु दर में वृद्धि और मॉडल रखरखाव के दौरान जीवाणु संदूषण के जोखिम के कारण चुनौतीपूर्ण बनी हुई है। ये सीमाएं मुख्य रूप से जीएफ वातावरण में रहने वाली मछलियों के लिए उपयुक्त ऑटोकल्चर सिस्टम की अनुपस्थिति से उत्पन्न होती हैं। इन प्रणालियों में जानवरों और उनके वातावरण को प्रभावी ढंग से बनाए रखने के लिए स्वच्छ हवा, पानी और एक खाद्य प्रणाली शामिल होनी चाहिए, जिससे बाहरी सूक्ष्मजीवों से पूर्ण अलगाव सुनिश्चित हो सके। चूहों और मुर्गियों52 जैसे अन्य जीएफ पशु मॉडल के विपरीत, सीआर माता-पिता से शारीरिक संचालन के माध्यम से जीएफ जेब्राफिश प्राप्त करना उनकी जलीय आदतों और प्राकृतिक निषेचन शैली के कारण चुनौतीपूर्ण है।

वयस्क जानवरों को आंतों के माइक्रोबायोटा से पूरी तरह से रहित मानना भी चुनौतीपूर्ण है। जबकि एंटीबायोटिक उपचार विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (एसपीएफ) जानवरों के समान एक राज्य को प्रेरित कर सकता है, जो फेकल नमूनों में पाए गए कम माइक्रोबायोटा की विशेषता है, सच्चे जीएफ वयस्क मछली मॉडल को प्राप्त करना मुश्किल है। जीएफ मॉडल को स्थापित करने और बनाए रखने में शामिल चुनौतियां, विशेष रूप से किशोर से दीर्घकालिक राज्यों में संक्रमण के दौरान, महत्वपूर्ण हैं। माइक्रोबियल अनुसंधान में वयस्क जीएफ मछली से जीएफ एफ 1 या एफ 2 अंडे जैसे जीएफ संतानों का महत्व स्वीकार किया जाता है। हालांकि, दीर्घकालिक वयस्क जीएफ मछली मॉडल को स्थापित करने और बनाए रखने में चुनौतियों पर काबू पाने के लिए पर्याप्त समय की आवश्यकता होती है।

यह ध्यान देने योग्य है कि विशिष्ट जीवाणु उपनिवेशण के साथ ग्नोटोबायोटिक जेब्राफिश विकसित की गई है, जो जीएफ मॉडल के आधार पर पुरानी अस्तित्व दिखाती है। फिर भी, यह अनिश्चित बना हुआ है कि क्या ये मॉडल जीवाणु संक्रमण और जैव चिकित्सा अनुसंधान में जीएफ मॉडल के व्यवहार्य विकल्प के रूप में काम कर सकते हैं।

GF मछली मॉडल के भविष्य के अनुप्रयोग
इस अध्ययन में, हमने जीएफ जेब्राफिश मॉडल उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल को परिष्कृत किया है, जो भ्रूण से किशोर तक प्रगति कर रहा है। यह प्रगति विकासात्मक जीव विज्ञान, इम्यूनोलॉजी, मानव रोग अनुसंधान और ऑर्गेनोजेनेसिस में महत्वपूर्ण अनुप्रयोग रखती है। बड़े पैमाने पर अलगाव और पहचान के माध्यम से, अध्ययन एकल जीवाणु उपभेदों के कार्यों, तंत्र और आंत-व्युत्पन्न चयापचयों की पड़ताल करता है। जांच में वेंट चरण47,53 खुलने के बाद GF जेब्राफिश मॉडल को संक्रमित करना शामिल है। इसके अतिरिक्त, प्रतिदीप्ति के साथ लेबल बैक्टीरिया अन्य माइक्रोबियल प्रभावों54 से मुक्त, लाइव जीएफ लार्वा में उपनिवेशण और वितरण के अवलोकन की सुविधा प्रदान करता है। इसी तरह के जीएफ मछली मॉडल, जैसे समुद्री या मीठे पानी के मेडका, विभिन्न एजेंटों या मध्यम परिवर्तनों के साथ तुलनीय तरीकों का उपयोग करके बनाए जा सकते हैं।

मानव रोग तंत्र की जांच करने के लिए, अध्ययन एफएमटी विधियों को नियोजित करता है, रोगियों या दाताओं से स्वस्थ जानवरों या जीएफ मॉडल55 के लिए नमूने स्थानांतरित करता है। पारंपरिक पाला (सीआर) जानवरों के विपरीत, जीएफ मॉडल माइक्रोबायोटा46 में लक्ष्य बैक्टीरिया को विनियमित करने के लिए बैक्टीरियोफेज के साथ संयुक्त होने पर, मेजबान में माइक्रोबियल कार्यों, प्रभावों या प्रतिक्रियाओं के मजबूत सबूत प्रदान करते हैं।

सारांश में, जीएफ जेब्राफिश बैक्टीरिया की सुरक्षा, दवा प्रभावशीलता, प्रदूषक विषाक्तता, या यौगिक हस्तक्षेप का आकलन करने के लिए शक्तिशाली मॉडल के रूप में काम करते हैं, उनके संवेदनशील और शुद्ध आंतों के वातावरण के कारण। जीएफ मछली अनुप्रयोगों के भविष्य की खोज में विभिन्न क्षेत्रों को शामिल करना चाहिए, जिसमें विभिन्न जीवन चरणों में माइक्रोबियल कार्यों की गहरी समझ के लिए वयस्क जीएफ मछली मॉडल बनाने की आवश्यकता है।

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Disclosures

जीएफ आर्टेमिया के प्रोटोकॉल को चीन के राष्ट्रीय बौद्धिक संपदा प्रशासन द्वारा पेटेंट के रूप में प्रदान किया गया है, जो लेखकों की अनुमति प्राप्त करने के बाद विधि के प्रतिबंधित उपयोग से राहत देगा। लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई अन्य प्रतिस्पर्धी या वित्तीय हित नहीं है।

Acknowledgments

हम ईमानदारी से चोंगकिंग मेडिकल यूनिवर्सिटी टैलेंट प्रोजेक्ट (नंबर R4014 से DSP और R4020 से PPJ), नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (NSFC, नंबर 32200386 से PPJ), चोंगकिंग पोस्टडॉक्टोरल इनोवेशन मेंटर स्टूडियो (X7928 DSP), और चाइनीज एकेडमी ऑफ साइंसेज (CAS)/चीन-श्रीलंका ज्वाइंट सेंटर फॉर एजुकेशन एंड रिसर्च द्वारा चाइनीज एकेडमी ऑफ साइंसेज (CAS)/चीन-श्रीलंका ज्वाइंट सेंटर फॉर एजुकेशन एंड रिसर्च के कार्यक्रम के समर्थन का धन्यवाद करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AB-GZM Amphotericin:Solarbio;  kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio. Amphotericin:CAS:1397-89-3;
kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.		 49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL).
1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes biosharp BS-15-M To collect samples, and hold agents
2.4 g/L NaClO XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. CAS: 7681-52-9 Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.
6-well plates, 24-, 48- well plates LABSELECT  11112 To culture fish
Aeronomas NCBI database No.MK178499 2019-JPP-ESN
Anaerobic TSA plates tryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
agar powder:BioFroxx.		 tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
agar powder:9002-18-0.		 The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.
Anaerobic work station GENE SCIENCE E200G Bacterial isolation, sterile testing
Analysis GraphPad Prism 5 v6.07 To analysis the data
API 20 E kits  BioMerieux SA, France No.1005915090 Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism
Artemia (Brine shrimp) Shangjia Aquarium Co., Ltd. Aquamaster brand Artemia cysts, and brine shrimp eggs 
Auto cycle system for fish culture Ningbo Hairui Technology Co., Ltd No Cat Maintain the fish
Autoclave Zeal Way G154DWS Prepare the materials
BHI Aerobic Coolaber Cat#PM0640 BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.
BHI Anaerobic Coolaber Cat#PM0640 BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.
Biochemical incubator LongYue Co., Ltd SPX For fish and plates
Biosafety cabinet Haier HR40-IIA2 Sterile treatment and testing
Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. CAS: 7681-52-9 Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.
Blood plates sheep blood:Solarbio Cat. NO. TX0030 Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.
Cell culture flask Corning 430639 To culture fish
CM-Dil dyes Molecular Probes Cat#C7000   To label the bacteria
Constant temperature shaking incubator Peiving Co., Ltd HZQ-X100 Bacterial culture
Database NCBI Bacteria and Archaea database Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/
Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
Disposable Pasteur pipette biosharp bs-xh-03l Used to change water, and transfer eggs
Disposable petri dish biosharp BS-90-D To culture fish
DNA kits Solaribio Cat#D1600 Bacterial genomic DNA extraction kits 
Electric pipette SCILOGEX Levo me Change water
Exiguobacterium NCBI database No.MK178504 2019-JPP-ESN
GZM Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd. No Cat Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.
Laboratory pure water system Hitech Co., Ltd Prima-S15 Prepare the agents
Microscope Nikon SMZ18 With fluorescent light to observe fish larvae
PCR kits TIANGEN Cat#ET101 Taq DNA Polymerase kit
Pipette LABSELECT  sp-013-10 Change water
Povidone iodine (PVP-I) Aladdin Lot#H1217005 Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.
Timing converter PinYi Co., Ltd AL-06 To regulate the light
TSA plates tryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
agar powder:BioFroxx.		 tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
agar powder:9002-18-0.		 TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.
TSB Aerobic tryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;		 tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;		 TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.
TSB Anaerobic tryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;		 tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;		 TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.
Ultra-clean workbench Airtech SW-CJ-2FD Sterile treatment and testing
Ultra-pure flow system for fish culture Marine Biological Equipment company No Cat Produce water for fish
Vibrio NCBI database No.MK178501 2019-JPP-ESN

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JoVE में इस महीने अंक 206 रोगाणु मुक्त (GF) zebrafish Artemia भोजन भ्रूण-लार्वा-किशोर मॉडल आंत बैक्टीरिया अनुकूलित प्रोटोकॉल
लार्वा से किशोर चरणों तक रोगाणु मुक्त जेब्राफिश मॉडल की पीढ़ी, रखरखाव और पहचान
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Jia, P. P., Liu, X. R., Wu, M. F.,… More

Jia, P. P., Liu, X. R., Wu, M. F., Li, Y., Zhang, L. C., Pei, D. S. Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages. J. Vis. Exp. (206), e66512, doi:10.3791/66512 (2024).

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