Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Generering, underhåll och identifiering av bakteriefria zebrafiskmodeller från larver till juvenila stadier

Published: April 12, 2024 doi: 10.3791/66512
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1School of Public Health, Chongqing Medical University

Summary

Detta protokoll beskriver de primära stegen för att erhålla bakteriefria (GF) fiskembryon och bevara dem från larver till juvenilstadiet, inklusive provtagning och detektion av deras sterila status. Användningen av GF-modeller med infektion är viktig för att förstå mikrobernas roll i värdens hälsa.

Abstract

Zebrafiskar fungerar som värdefulla modeller för forskning om tillväxt, immunitet och tarmmikrobiota på grund av deras genomiska likheter med däggdjur, genomskinliga embryon utvecklade i en relativt ren korionmiljö och extremt snabb utveckling av larver jämfört med gnagarmodeller. Bakteriefria zebrafiskar (Danio rerio) är avgörande för att utvärdera toxicitet för föroreningar och etablera människoliknande sjukdomsmodeller relaterade till mikrobiella funktioner. I jämförelse med konventionellt uppfödda (CR) modeller (fiskar i vanlig uppfödning) möjliggör GF-zebrafisk mer exakt manipulation av värdmikrobiotan, vilket hjälper till att bestämma orsakssambandet mellan mikroorganismer och värdar. Följaktligen spelar de en avgörande roll för att främja vår förståelse av dessa relationer. GF-zebrafiskmodeller genereras och undersöks dock vanligtvis under de tidiga livsstadierna (från embryon till larver) på grund av begränsningar i immunfunktion och näringsupptag. Denna studie optimerar genereringen, underhållet och identifieringen av tidiga GF-zebrafiskmodeller utan utfodring och med långvarig utfodring med hjälp av GF-foder (t.ex. Artemia sp., saltvattenräkor). Under hela processen utfördes och identifierades daglig provtagning och odling genom flera detektioner, inklusive plattor och 16S rRNA-sekvensering. Den aseptiska hastigheten, överlevnaden och utvecklingsindexen för GF-zebrafiskar registrerades för att säkerställa kvaliteten och kvantiteten på de genererade modellerna. Det är viktigt att denna studie ger detaljer om bakteriell isolering och infektionstekniker för GF-fiskar, vilket gör det möjligt att effektivt skapa GF-fiskmodeller från larver till unga stadier med GF-foderstöd. Genom att tillämpa dessa procedurer i biomedicinsk forskning kan forskare bättre förstå sambanden mellan tarmbakteriernas funktioner och värdens hälsa.

Introduction

Mikrobiotan (dvs. arkéer, bakterier, eukarya och virus) spelar avgörande roller för att upprätthålla värdens hälsa och bidra till utvecklingen av olika sjukdomar genom att påverka fysiologiska och patologiska processer genom symbiotiska interaktioner inom tarmbarriären, epitelytan och mucinfunktioner hos individer 1,2,3. Sammansättningen av mikrobiotan i olika livsstadier, från spädbarn till ungdom, vuxen ålder och åldrande, såväl som dess närvaro på olika platser som näsa, orala, hud- och tarmplatser, formas dynamiskt av olika livsmiljöer och miljöer4. Tarmmikrobiotan i organismer är involverad i näringsupptag, immunsvar, patogeninvasion, metabolisk reglering, etc 5,6. Studier på patienter har visat att störningar i tarmmikrobiotan är relaterade till mänsklig fetma, sömnstörningar, depression, inflammatorisk tarmsjukdom (IBD), neurodegenerativa sjukdomar (Parkinsons, Alzheimers), åldrande och olika cancerformer 7,8,9. Dessutom involverar interaktiva vägar mellan tarmmikrobiota och värdar inflammatoriska faktorer, neurotransmittorer, metaboliter, tarmbarriär och oxidativ stress, som observerats i tidigare forskning med hjälp av möss- och fiskmodeller 10,11.

Nyligen har flera bakterierelaterade tillvägagångssätt eller terapier, inklusive potentiell probiotika och transplantation av fekal mikrobiota (FMT), utforskats för dessa störningar i kliniska modeller och djurmodeller. Dessa utforskningar är baserade på upptäckter relaterade till mikrobiota-tarm-hjärna/lever/njur-axeln, mikrobiota-härledda produkter och förändrad receptoraktivitet12,13. Utvecklingen, de olika funktionerna och mekanismerna för mikrobiota-värdsystemet är dock fortfarande ofullständigt förstådda och identifierade på grund av komplexiteten i det mikrobiella samhället och utmaningen att generera kraftfulla människoliknande sjukdomsmodeller.

För att ta itu med dessa problem föreslogs bakteriefria (GF) djurmodeller i mitten av 1800-talet och utvecklades främst under1900-talet. Efterföljande förbättringar, inklusive antibiotikabehandlade och gnotobiotiska modeller, tillsammans med framsteg inom mikrobiell detektion och observationsteknik, fulländade dessa modeller ytterligare 14,15,16. GF-djur, som skapats genom att radera sin egen bakgrund och undvika miljömikrober, erbjuder en utmärkt strategi för att utforska interaktionerna mellan mikroorganismer och deras värdar17. Genom tillämpning av djurmodeller och förfinade protokoll har forskare framgångsrikt replikerat liknande mikrobiella sammansättningar som finns hos patienter hos GF-möss och fiskar. Dessutom ger andra GF-djurmodeller, såsom hundar, kycklingar och grisar, olika alternativ som försökspersoner 18,19,20,21. Detta tillvägagångssätt har möjliggjort undersökningar av de potentiella terapeutiska effekterna av kommensala mikrobiom på olika sjukdomar, inklusive cancerimmunterapi hos människor16,18. GF-modeller ger mer exakta insikter om egenskaperna och mekanismerna för specifik bakteriell kolonisering, migration, multiplikation och interaktion inom värdar. Detta ger viktiga nya insikter om förekomst och utveckling av mikrobiotarelaterade sjukdomar22,23. Historien om att etablera och tillämpa GF-zebrafisk i mikrobiell forskning har utvecklats från rapporterna från Rawls et al. 2004 och Bates et al. 2006 till Melancon et al.:s protokoll 2017 16,24,25. Genomförbarheten av GF-modeller för vuxna eller avel är dock fortfarande en långvarig process, åtföljd av varierande livslängd, framgångsfrekvenser och hälsoutmaningar.

Bland olika djurmodeller sticker zebrafisk (Danio rerio) ut som ett kritiskt verktyg för både grundforskning och biomedicinsk forskning på grund av dess fördelaktiga likhet med mänskliga organ och genomik, kort utvecklingscykel, hög fruktsamhet och transparenta embryon19,26. Zebrafiskar, som fungerar som tillförlitliga mänskliga sjukdomsmodeller, erbjuder en visuell representation av fysiologiska och patologiska processer in vivo, vilket ger insikter om de attraktiva egenskaperna hos värd-mikrobinteraktioner. Noterbart är att zebrafiskar uppvisar distinkta cellinjer, vilket möjliggör avbildning av tarmfysiologi, mikrobiell dynamik, könskörtlar och reproduktiv utveckling, mognad av värdens immunsystem, beteende och ämnesomsättning27. Zebrafiskembryon utvecklas inom skyddande korioner tills de kläcks och blir larver 3 dagar efter befruktning (dpf). De jagar aktivt efter mat vid 5 dpf och blir könsmogna cirka 3 månader efter befruktning (mpf)28. Den första framgångsrika bakteriefria zebrafisken, rapporterad av Rawls et al.24, visade att larver som matades med autoklaverat foder efter att gulan absorberats uppvisade vävnadsnekros från 8 dpf och total död vid 20 dpf. Detta indikerade effekterna av kosten eller vikten av att ta hänsyn till exogen näringstillförsel i experiment med långtidsbehandling (>7 dpf) GF-fisk29. Efterföljande studier förbättrade genereringsprotokollet för GF-fisk genom att använda steril mat och metoder som fulländats i olika fiskmodeller16.

Den mesta forskningen på GF-zebrafiskmodeller har dock fokuserat på tidiga livsstadier, som involverar bakteriell infektion vid 5 dpf i 24 timmar till 48 timmar, med prover tagna före 7 dpf i slutet av experimenten 25,30,31. Det är allmänt erkänt att mikrobiotan i organismer, inklusive människor och zebrafiskar, koloniseras i början av livet och formas under tillväxt och utveckling. Sammansättningen förblir stabil i vuxenstadier, där mikrobiotans roll i värden är avgörande under hela livet, särskilt vid åldrande, neurodegenerativ, metaboliskt relaterad fetma och tarmsjukdomsaspekter3. Således kan perspektiv från GF-djur med längre överlevnad ge insikter i mekanismerna för mikrobiella roller i värdorganens utveckling och funktioner, med tanke på de omogna immun- och reproduktionssystemen hos fisklarver tidigt i livet. Medan bakteriestammar i zebrafisktarmar har isolerats och identifierats i tidigare studier, vilket ger möjlighet att infektera GF-djurmodeller för att välja probiotika eller forska om bakteriella funktioner i värden19,25, har generering och tillämpning av GF-fiskmodeller främst begränsats till tidiga livsstadier. Denna begränsning, som tillskrivs den komplexa produktionsprocessen, höga underhållskostnader och tillhörande problem med mat och immunitet, hindrar forskningsinsatser som syftar till att undersöka de utvecklingsmässiga och kroniska effekterna av mikrobiota i värden.

Överlevnadsgraden, beteendet, tillväxten, mognaden och den allmänna hälsan hos fiskar, särskilt i bakteriefria (GF) modeller, påverkas i hög grad av utfodringsmetoder, vilket omfattar näringsintag och absorption under den öppna munnen från tidiga larver till unga exemplar32,33. En av utmaningarna inom GF:s fiskodling är dock bristen på lämpliga sterila dieter, vilket begränsar effektiviteten av näringsstöd för att upprätthålla tillväxt och överlevnad av larver. Att lösa detta problem är avgörande för att återställa livet på GF-fiskar, med tanke på deras utvecklingsförsvarsmekanismer och svaga matsmältningsförmåga på grund av frånvaron av ett tarmmikrobiom. När det gäller föda framstår levande artemiaräkor (Artemia sp.) som den lämpligaste födan för larver som är öppna i munnen till unga fiskar. Det har observerats att fiskar som utfodras med levande artemiaräkor uppvisar högre tillväxt och överlevnad jämfört med de som utfodras med kokt äggula eller andra naturliga och syntetiska beten34. Även om tidiga livsmodeller av GF-fiskar kan överleva med stöd av gulor och GF-larvmodeller kan upprätthållas med steril utfodring, är det fortfarande en utmaning att generera långsiktiga modeller från larver till yngel och nå könsmognad. Dessutom begränsas fling- eller pulverfoder av ojämn näringssammansättning och kan påverka vattenkvaliteten. Däremot har levande Artemia fördelar som överlevnad i både salt- och sötvatten, liten storlek som lämpar sig för larver till vuxna, enkel batchning och högre kläckningskvalitet35. Genom att bygga vidare på tidigare metoder 16,24,30 har vi förenklat den komplexa behandlingsprocessen och tagit itu med kostutmaningen genom att etablera lätt inkuberad GF levande Artemia sp. som steril mat under längre tid än GF-fisk tidigt i livet.

Denna studie presenterar ett optimerat protokoll som täcker (1) generering, (2) underhåll, (3) identifiering av steril hastighet och (4) underhåll och utfodring för att säkerställa tillväxten av bakteriefria (GF) zebrafiskar från embryon till larver och juvenila stadier. Resultaten ger preliminära bevis på kläckning, överlevnad, tillväxt och sterilitet hos GF-zebrafisk, tillsammans med viktiga index för GF Artemia sp. som steril mat. De detaljerade stegen i modellgenerering och beredning av sterila levande livsmedel ger avgörande tekniskt stöd för att konstruera och tillämpa långsiktiga GF-fiskmodeller, såväl som GF Artemia sp. i forskning om mikrobiota-värdinteraktion. Protokollet behandlar bakteriell isolering, identifiering och infektion på GF-fiskmodeller, och beskriver metoder för märkning av bakteriell fluorescens och observation av deras kolonisering i fisktarmar under ett mikroskop. GF-fisk, gnotobiotisk fisk med bakteriell infektion eller överförda mänskliga mikrobiotamodeller kommer att genomgå olika detektioner för att belysa deras funktioner och effekter på värdens immunitet, matsmältning, beteende, transkriptomisk reglering och metaboliska aspekter. På lång sikt kan detta protokoll utvidgas till olika arter av vildtyp, såsom marin medaka, och eventuellt till andra utvalda transgena zebrafisklinjer som är korrelerade till specifika vävnader eller sjukdomar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Fiskexperimenten utfördes i enlighet med riktlinjerna från Animal Care and Use Committee of Chongqing och Institutional Animal Care and Use Committee of Chongqing Medical University, Kina, samt de standarder för försöksdjur som utfärdats av State Bureau of Quality and Technical Supervision (Approval ID: GB14922-2001 to GBT14927-2001). Zebrafiskar (Danio rerio, vildtyp, AB-stam) hämtades från Institutet för hydrobiologi, Chinese Academy of Sciences, och hölls i laboratoriet enligt tidigare rapporterade procedurer36.

1. Underhåll av vuxna zebrafiskar och insamling av embryon

OBS: Med hjälp av modifieringar från tidigare studier och rapporter 16,37,38,39 utfördes underhållet av vuxna zebrafiskar, larvuppfödning och metoder för bakteriefria (GF) modeller i vårt laboratorium enligt stegen som beskrivs nedan. Det ultrarena flödessystemet för fiskodling erhölls kommersiellt (se materialtabell). Vattnet, som hålls med ett balanserat pH, salt och alkali, genomgår filtrering under cyklingen för att säkerställa rena förhållanden.

  1. Underhåll vuxna fiskar med följande standardprocedur i autocykelsystemet (se materialtabell) med en fotoperiod av mörker: ljus = 10 timmar: 14 timmar vid 28 °C ± 0,5 °C och utfodras med färsk inkuberad Artemia sp. två gånger dagligen.
  2. Sätt den könsmogna vuxna zebrafisken (hane: hona = 2:1) i tankar med färskt och rent vatten kvällen innan.
  3. Låt fisken leka nästa morgon (cirka 8:30) under regelbunden ljusstimulering i laboratoriet. Efter 1-2 timmar flyttar du fisken till ett annat akvarium.
  4. Samla embryon i vatten från det autocykliska systemet som uppfödningsmedium i en odlingsskål med hjälp av en Pasteur-pipett för engångsbruk.

2. Generering av GF-zebrafisk från embryon till larver

OBS: Proceduren för att generera bakteriefri (GF) fisk beskrivs i figur 1, medan de grundläggande utvecklingsindexen för konventionella (CR) och GF-modeller presenteras i kompletterande figur 1. Följ stegen nedan i ett biologiskt säkerhetsskåp eller en huv med laminärt flöde med hjälp av en steril aseptisk teknik i ett renrum.

  1. Tvätta embryona med fiskodlingsvatten och ta bort avföring, orenheter och döda eller obefruktade ägg.
  2. Överför embryona vid 2 hpf till steriliserade plattor (upp till 480 embryon per steril skål med en diameter på 10 cm) fyllda med antibiotikabakteriefritt zebrafiskmedium (AB-GZM, se Materialtabell) lösning och odling vid 28,5 °C i 6-8 timmar.
    OBS: AB-GZM används för att behandla embryon i flera timmar för att eliminera ytmikroorganismerna, och GZM utan antibiotika används för att odla GF-fisk i följd. Vanligtvis är den perfekta kulturtiden 6 timmar).
  3. Uteslut ägg med vita fläckar eller vitaktigt utseende och välj de som är normalt utvecklade och som har genomskinliga och intakta kuvert för vidare bearbetning.
  4. Skölj embryona med AB-GZM tre gånger inom 10 minuter.
  5. Blötlägg embryona i 0,2 g/L povidon-jodlösning (PVP-I) i 1 minut (se Materialtabell).
    OBS: Högre koncentration och längre än 2 minuter kommer att påverka embryonas död och kläckningshastighet.
  6. Tvätta embryona med bakteriefritt zebrafiskmedium (GZM) tre gånger inom 10 minuter.
  7. Tillsätt embryon i natriumhypoklorit (NaClO) arbetslösning, täck tätt över 50 ml mikrocentrifugrören och blek i 15 minuter. Under denna period, suspendera embryona i blekmedelslösning genom att försiktigt skaka dem.
  8. Tvätta embryona med GZM tre gånger inom 10 minuter.
  9. Överför embryona till sterila plattor med 6 brunnar med 5 embryon och 10 ml GZM per brunn. Odla dem i en ultraren plattform eller inkubator med en fotoperiod av mörker: ljus = 10 timmar: 14 timmar vid 28 °C ± 0,5 °C. Odlingsdensiteten kommer att påverka steriliseringshastigheten.
  10. Förnya odlingsmediet dagligen genom att ta bort den förbrukade GZM, samla in den som prover för steril statusdetektering och fylla på varje brunn med samma volym steril GZM.
  11. Anteckna de grundläggande utvecklingsindexen för GF-embryon/-larver, inklusive överlevnadsgrad, kläckningshastighet, hjärtslag, kroppslängd och vikt, etc19.
  12. Överför GF-fisken till lämpliga behållare (skålar, cellodlingskolvar eller glasflaskor med lock) med utökad volym, vilket ger steril mat under hela tillväxtprocessen.

3. Underhåll av GF-zebrafisk från larv till juvenil

  1. Förnya GZM utan utfodring före 7 dpf och upptäck de sterila tillstånden dagligen (se steg 5).
  2. Mata zebrafisklarver från 8 dpf till juvenila stadier med steril äggula (10 μL beredd stamlösning per brunn) en gång dagligen innan du byter GZM.
  3. Mata GF-yngel från 14 dpf med steriliserad äggula blandad med GF Artemia sp. en gång dagligen (1-3 Artemia/larver, se steg 4), och öka gradvis födomassan med tillväxt och utveckling av GF-fisk.
  4. Ge äggula tills alla fiskar kan äta Artemia nauplii.
    OBS: GF Artemia bör genomgå sterilitetstestning före användning. Bedöm antalet Artemia nauplii som finns kvar, observera förföljande och fånga framsteg och undersök fiskkroppen med konsumerad mat för att indikera utfodringsframgång.
  5. Från 28 dpf till tidiga vuxenstadier, mata GF Artemia en gång dagligen (3-5 Artemia/larver) och rengör outnyttjad eller död Artemia och död fisk i avfalls-GZM som dagliga prover.
  6. Under GF-fisktillväxt, byt ut 6-brunnsplattorna efter 7 dpf till sterila plattor eller cellodlingskolvar från 8 till 21 dpf, och sedan till sterila flaskor efter 21 dpf. Öka odlingsmediet och matmassan enligt antalet och vikten av GF-fisk i varje behållare.
  7. Förnya GZM dagligen och kontrollera prover för att säkerställa framgången för GF-modeller.
    OBS: Att upprätthålla bakteriefria (GF) fiskmodeller fram till tidig vuxen ålder och könsmognad är utmanande, med en låg genomsnittlig överlevnadsgrad vid 30 dpf, vanligtvis mindre än 10 %. Detta beror främst på svag immunitet, försenad utveckling och försämrad tarmfunktion.

4. Beredning av GF Artemia nauplii som steril mat för kroniska GF-fiskmodeller

OBS: Odlings- och beredningsmetoden för bakteriefri (GF) Artemia beskrivs i figur 2. Observera att alla följande steg utförs i ett biologiskt säkerhetsskåp med hjälp av en steril aseptisk teknik.

  1. Skölj 0,25 g Artemia-cystor med 2,4 g/L natriumhypoklorit (NaClO, se Materialtabell) i 5 minuter.
  2. Filtrera de sköljda Artemia-cystorna med ett steriliserat ultratätt filter (cirka 170 maskor i öppning) och tvätta med steriliserat ultrarent vatten tre gånger, varje gång i 1-2 minuter.
  3. Överför de tvättade Artemia-cystorna till 100 ml 2,5 % steriliserat koksaltvatten, blanda och förpacka för aseptisk kläckning enligt stegen nedan.
  4. Packa den 50 ml behandlade blandningslösningen av Artemiacystor i en steril flaska med en volym på 100 ml, förslut den med film och inkubera i en skakinkubator vid 150 rpm, 30 °C i 18 timmar till 24 timmar med ljus.
  5. Extrahera cirka 30 ml kläckning av Artemia nauplii från de mellersta och nedre lagren med hjälp av en engångspipett av Pasteur.
    OBS: Förhindra att flytande ägg och tomma skal når det övre lagret. Indexen för bakteriefria (GF) Artemia-cystor och nauplii inkuberade i 24 timmar presenteras i figur 3.
  6. Filtrera Artemia med ett steriliseringsfilter och tvätta dem i en steriliseringsbägare med steriliserande ultrarent vatten tre gånger, cirka 30 s till 1 minut för varje gång. Tillsätt slutligen 4 ml steriliserat ultrarent vatten för att bereda den blandade lösningen av Artemia .
  7. Använd en engångspipett av Pasteur för att hämta aktivt simmande Artemia från det övre lagret, tvätta och förbereda nauplii-lösningen för utfodring och aseptisk identifiering.

5. Identifiering av GF-fiskmodeller i alla livsstadier

OBS: Under hela livscykelstadiet för bakteriefri fisk (GF) är nyckelindex och dagliga provdetektioner avgörande för att säkerställa att modellerna blir framgångsrika. I detta steg sammanfattas den gemensamma klassificeringen av prover och de vanliga metoderna för identifiering (figur 4).

  1. Observera och räkna överlevnadsstatus och hastighet för GF-zebrafisklarver dagligen. I experiment som beräknar relaterade hastigheter odlas GF-fisk i plattor med 24 eller 48 brunnar med en fisk per brunn.
    1. Överlevnadsgrad = (antal levande fiskar vid observationstidpunkten / totalt antal ägg) × 100 %.
    2. Sterilitetsgrad = (antal sterila fiskar/antal överlevande fiskar) × 100 %.
      OBS: Detta protokoll fokuserar på steriliseringshastigheten för levande fisk. Antalet sterila fiskar bestäms genom att räkna framgångsrika GF-fiskar efter flera kontroller bland de levande fiskarna. Alla döda fiskar eller levande fiskar GF-modeller som har misslyckats på grund av bakteriell närvaro elimineras under efterföljande GF-procedurer.
  2. Samla in följande prover av GF zebrafisklarver.
    1. Odlingsmedium av GF-zebrafisk från varje brunn eller flaskbehållare.
    2. Fiskmat, till exempel steril äggula och GF Artemia.
    3. Avfallsmedium, inklusive fragment av ägghinnan efter kläckning och matrester eller avföring under födosöksperioderna från larver till unga fiskar.
    4. Döda fiskprover för att identifiera förekomst av bakterier.
    5. Fiskmedium och medel som används vid embryobehandling som steril kontroll.
    6. Prover från material, driftplattform och inkubator m.m.
  3. Detektera prover som samlas in dagligen med hjälp av flera metoder.
    1. Använd först metoden med spridningsplattor och odlingsplattor i en inkubator vid 30 °C.
      1. Täck med 20–50 μl avfallsprov på trypticase-sojaagar (TSA) plattan (se materialtabellen) under aeroba förhållanden.
      2. Bestryk med 20–50 μl avfallsprov på TSA-plattan under anaeroba förhållanden.
      3. Bestryk med 20-50 μL avfallsmediumprov på TSA-blodplattorna (se materialtabellen) under aeroba förhållanden.
      4. Täck med 20-50 μL avfallsmediumprov på TSA-blodplattorna under anaeroba förhållanden.
    2. För det andra, använd den flytande odlingsmetoden.
      1. Ta 200 μl av provet i aeroba rör med ett medium för Brain Heart Infusion Broth (BHI) (se materialtabell) och odla i skakinkubatorn vid 30 °C, 150–180 rpm.
      2. Tillsätt 200 μl av provet i anaeroba rör med BHI-medium och odla i inkubatorn vid 30 °C.
      3. Tillsätt 200 μl prov i aeroba rör med trypticase sojabuljong (TSB) medium och odla sedan i skakinkubatorn vid 30 °C, 150–180 rpm.
      4. Tillsätt 200 μl av provet i anaeroba rör med TSB-medium och odla i inkubatorn vid 30 °C.
    3. För det tredje, använd molekylära tekniker-16s polymeraskedjereaktion (PCR) analys.
      1. Analysera avloppsvattenprovet med två par primers 27F och 1492R, samt 63F och 1387R (tabell 1).
        OBS: PCR-masterblandningen bereddes enligt tabell 2 med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt DNA-polymeraskit (se materialtabell), och PCR-maskinen ställdes in med det program som anges i tabell 3.
      2. Efter att PCR-programmet är klart, undersök produkterna med 1 % agarosgelelektrofores40 vid målband på 1465 bp (med primers 27F och 1492R) eller 1324 bp (med primers 63F och 1387R) för att härleda steriliteten hos proverna.
  4. Registrera och observera sterilitetstester, inklusive platt- och mediumodling från 24 timmar till 3 dagar och 7 dagar, under vilka ingen koloni på plattorna och ingen grumlighet i vätskan indikerar en framgångsrik konstruktion av GF-modeller. Observera och registrera plattan och mediet vid 24 timmar, 48 timmar, 72 timmar, 96 timmar, 120 timmar, 144 timmar och 168 timmar.

6. Identifiering av GF Artemia-prover innan de utfodras med GF-fisk

OBS: För att upptäcka GF Artemia samples, som är oumbärliga som levande föda innan de matas på GF-fisk (Figur 4), följ stegen nedan.

  1. Samla in prover av GF Artemia-modeller .
    1. Obehandlade artemia-cystor .
    2. Behandlade GF Artemia cystor.
    3. Kläckt GF Artemia nauplii.
    4. Steriliserat ultrarent vatten som kontroll.
  2. Detektera GF Artemia med följande metoder.
    1. Använd spridningsplattmetoden för att detektera proverna genom att belägga dem på TSA-plattor och TSA-blodplattor under aeroba och anaeroba förhållanden. Inkubera dem vid 30 °C.
    2. Använd ett flytande medium för att detektera proverna i aeroba och anaeroba TSB- och BHI-rör. Odling i shaker vid 150-180 rpm, 30 °C.
    3. Använd PCR-analys för att detektera förekomsten av bakterier i proverna som samlats in med hjälp av 16s ribosomala RNA-målgener primrar 27F och 1492R, 63F och 1387R (tabell 1). Volymen och programmet visas i Tabell 2 och Tabell 3.
  3. Registrera resultaten: Detektera PCR-produkten med 1 % agarosgelelektrofores40 för målband som mäter 1465 bp (med primers 27F och 1492R) eller 1324 bp (med primers 63F och 1387R). Resultaten av plattor och flytande medium kan säkerställa steril status för GF Artemia innan den används som GF fiskfoder.

7. Isolering och identifiering av bakteriestammar i tarmkanalen från zebrafisk

OBS: För att utforska tarmens funktioner in vitro och in vivo är det nödvändigt att isolera bakteriestammar från zebrafiskar, som också utgör artkällan för potentiella probiotika som screenas genom infektion med GF-djur (Figur 5). I detta protokoll beskriver vi den traditionella dissektionsmetoden för att få fram tarminnehåll, samtidigt som proverna också kan samlas in direkt från levande sövda fiskar (data visas inte).

  1. Välj friska vuxna zebrafiskar och tvätta dem med sterilt vatten. Utför följande steg i den rena bänken.
  2. Bedöva fisken med 100 mg/L MS-222 i 5-10 min.
  3. Använd 75 % alkohol för att behandla fiskens kroppsyta.
  4. Dissekera fiskens tarmar och extrudera tarminnehållet med TSB- eller BHI-medium.
  5. Inkubera tarmsupernatanten genom att applicera TSA, blodplatta, TSB och BHI-medium under aeroba och anaeroba förhållanden.
  6. Översätta bakterierna för att få signalstammen och registrera egenskaperna hos olika kolonier.
  7. Förvara bakterierna inom 30 % glycerol vid -80 °C.
  8. Identifiera sedan tarmbakterierna genom genomisk DNA-extraktion och PCR-sekvensering.
    OBS: De viktigaste stegen för bakteriell genomisk DNA-extraktion inkluderar vätskecentrifugering, RNas A och Protease K-dissociation, extraktion av etylalkohol, sköljning och upplösning med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit enligt tillverkarens instruktioner (se materialtabell).
  9. Analysera 16S-sekvenserna med hjälp av National Center for Biotechnology Information (NCBI) och Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) med Bacteria and Archaea databasen40,41 (se Materialtabell).
  10. Välj de bäst matchade bakterierna och karaktärerna för att identifiera de isolerade tarmstammarna på genusnivå.
  11. Detektera de metaboliska funktionerna hos bakteriestammar med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit (se Materialförteckning).

8. Influensamärkning, infektion och kolonisering av bakterier i GF zebrafisktarmar

OBS: Innan GF-zebrafisken infekterades modifierades de isolerade bakterierna med färgämnen och räknades, vilket gjorde mikrobiell kolonisering och migration synlig kontinuerligt och in vivo (Figur 6).

  1. Välj potentiellt nyttiga bakterier eller dominanta stammar med hög förekomst i värden för att infektera GF-fiskmodellerna.
    OBS: Bakterierna som användes i denna studie var Aeromonas sp. och Vibrio sp. (se Materialtabell), utvalda från de 8 släkten som isolerades och identifierades från vuxna vilda zebrafiskar i laboratoriet42.
  2. Märk de färska bakterierna med CM-Dil-färgämnen (se materialförteckning) och exponera dem för GF-zebrafisk vid 5 dpf med en koncentration av 106-10 8 kolonibildande enheter (CFU)/ml.
  3. Observera fluorescensen under det fluorescerande mikroskopet med 3× förstoring för att indikera kolonisering och distribution av bakterier i tarmen hos GF-zebrafisklarver från 6 dpf och 14 dpf.
  4. Räkna manuellt antalet bakterier i GF-fisk genom plattkultur vid varje tidpunkt.
  5. Detektera kolonierna och sekvenserna för att säkerställa att infektionen lyckades med de bakteriestammar som är mål.
  6. Samla in prover av GF-fisk med bakteriell infektion för efterföljande analyser, inklusive neurobeteende, utvecklingsindex, histopatologisk analys och hormonmätningar, etc 43,44,45.
    OBS: Bakterierna som används i infektionsexperimentet bör nyligen återfinnas och nyligen odlas av det flytande mediet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

GF-zebrafiskmodellerna kan produceras effektivt genom att använda de rikliga ägg som leks av par av zebrafiskar, med protokollet optimerat baserat på tidigare GF-fiskmodeller35. En enda platta med 6 brunnar kan odla cirka 30-48 embryon/larver, vilket möjliggör omfattande datainsamling och statistisk analys. Efter steril behandling odlas GF-embryona i en ren inkubator tills de kläcks till larver vid 48-72 timmar, och ändrar GZM dagligen med detektion av insamlade prover, vilket är avgörande för att upprätthålla det bakteriefria tillståndet (Figur 1). Efter 7 dpf bör maten av äggula och levande Artemia förberedas för larver till juvenila stadier. Under fiskens tillväxt och utveckling bör volymen, behållaren och densiteten av GZM regleras eller ändras i tid för att undvika död och misslyckande med steril status. Om detektionen inte visar någon bakteriell förorening kan de framgångsrika GF-modellerna bibehållas som kroniska från juvenil till tidig vuxen ålder, men överlevnadsgraden är mycket lägre i praktiken. Slutligen kan sterilfrekvensen, överlevnadsgraden, utvecklingsindexet, beteendet, histopatologisk analys och transkriptionsprofilen för GF- och CR-fiskmodeller mätas för att utforska påverkan av mikrobiota och läkemedelsskärmfält. I denna studie jämfördes de viktigaste utvecklingsindexen (kompletterande figur 1), och kläckningshastigheten för GF-fisk var 45,7 % lägre än för CR-fisk, med 60 % vid 72 hpf. Hjärtfrekvensen hos GF-larver vid 7 dpf var signifikant lägre vid 18,2 slag/10 s jämfört med CR-fisk med 22,6 slag/10 s, men det fanns ingen skillnad mellan de två grupperna vid 14 dpf med frekvenser på 23,5-23,8 slag/10 s. Överlevnadsgraden för GF-fisk vid 7 dpf var densamma som för CR-fisk med 86,7 %, men minskade till 60 % vid 14 dpf jämfört med 80 % för CR-fisk. Överlevnadsgraden för både GF- och CR-fiskar minskade dock till 25-10 % efter den öppna munnen när de förvärvade ätförmåga eller vanor. Misslyckandet med att upprätthålla fiskens sterila status var en av orsakerna till den lägre överlevnadsgraden. Därför är utfodring och näringsförsörjning från juvenil till tidig vuxen ålder kritiska utmaningar inom fiskodling.

En annan viktig faktor som påverkar fiskens tillväxt och utveckling är utfodring. I denna studie utforskar vi flera metoder för att erhålla GF Artemia som levande föda för långsiktiga GF-zebrafisklarver till unga och vuxna (processen visas i figur 2). På grund av den dagliga konsumtionen av foder för GF-fisk bör det optimerade protokollet för GF Artemia vara enkelt, tidsbesparande och ekonomiskt i praktiken. Efter att ha jämfört den aktiva rörelsen och döden/orörligheten hos nauplii som observerats av mikroskopet, egenskaperna hos nauplii, okläckta ägg och skal, är metoden fulländad. Efter daglig inkubation observerades och mättes index för färsk GF Artemia erhållen från flaskor, inklusive kläcknings-, överlevnads- och deformitetshastighet, samt längd och vikt av nauplii, under mikroskopet (Figur 3). Efter behandling var kläckningsfrekvensen av Artemia-cystor hög, med ett genomsnitt på 88,15 %, överlevnaden för simmande nauplii var 77,83 % och missbildningsfrekvensen var 1,87 %. Kroppslängden för nauplii var 546,70 μm och kroppsviktsindexet var 3,80 mg/100, som är lämpliga för fiskfångst och utfodring från larvernas månadsöppna period till juvenila och vuxna stadier.

Detektionen av GF-fisk och GF Artemia är också viktig för modellunderhåll. Enligt provtagning och flera testmetoder kan resultaten ge framgång för behandlade zebrafiskembryon och Artemia-cystor i den odlade plattan och det flytande mediet (Figur 4). De olika proverna som samlas in dagligen bör detekteras som sterila i alla testmetoder, som sedan kan indikera GF-modellerna vid insamlingstillfället. GF Artemia bör påvisas innan GF-fisk äts, eller så bör resultaten från plattan och mediuminkubatorn hänvisa till det sterila tillståndet hos färska levande nauplii. Det vill säga, odla GF Artemia från cystor på TSA-plattor eller TSB eller BHI flytande mediumglas i skakinkubation, som kan användas för att generera GF Artemia och steril verifiering samtidigt. GF Artemia-protokollet kan rymma ett begränsat antal larver för utfodring. Under utfodringsprocessen var det uppenbart att GF Artemia simmade inom GZM och sedan fångades in och konsumerades av GF-fisklarverna.

Tillämpningarna av GF-fiskmodeller involverar olika områden inom biologi och medicin, vilket gör det möjligt att undersöka bland annat mikrobiella funktioner, tillväxt och utveckling, sjukdomsmekanismer och probiotika- eller läkemedelsscreening46. I den här studien isolerades till exempel två stora tarmbakterier, Aeromonas sp. och Vibrio sp., från zebrafiskar. Kolonins egenskaper och identifiering utfördes, och flera metabola funktioner mättes in vitro med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit (Figur 5). Dessa bakterier isolerades och identifierades med 16S-sekvensering, och blastresultaten presenterades i en tidigare rapport42. De identifierade bakteriestammarna möjliggör vetenskaplig forskning om effekten av enkel eller kombinerad mikrobiota på värdhälsan genom att infektera GF-fiskmodellerna. Transparensen hos fisklarver gör det möjligt att observera fluorescensmärkta bakterieceller med hjälp av CM-Dil-färgämnen, vilket avslöjar kolonisering och distribution i tarmarna hos GF-fisk (visas i figur 6). Efter bakteriell infektion vid 5 dpf kan GF-zebrafisklarver avbildas med ett fluorescensmikroskop och kontinuerligt observeras från 6 till 14 dpf, vilket ger insikter i mikrobiella funktioner i kombination med utvecklingsindex, histopatologiska förändringar och molekylära förändringar47.

Figure 1
Figur 1: Protokoll för GF-zebrafisk från embryon till larver och yngel. Viktiga steg i genereringen av GF-zebrafiskar inkluderar: (1) Insamling av embryon från zebrafiskar av vildtyp och placering i AB-GZM. (2) Skölj behandlingen med PVP-I- och NaClO-medel för att säkerställa fullständig sterilitet. (3) Odling av GF-embryon/-larver i 6-hålsplattor med GZM, där mediet förnyas dagligen. (4) Reglering av kulturella betingelser för optimal tillväxt och utveckling. (5) Provtagning i olika utvecklingsstadier, följt av sterilitetstestning med hjälp av platt- och vätskemedium. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Protokoll för beredning av GF Artemia som levande föda för GF-fisk. Viktiga steg inkluderar: (1) Skölj behandlingen av Artemia-cystor för fullständig sterilitet. (2) Beredning av GF-cystor i mediet. (3) Inkubation i en saltlösning i 24 timmar för att främja kläckning. (4) Filtrering av misslyckad kläckning och tomma ägg för att samla upp aktiva nauplii. (5) Tvättning av insamlade nauplii för att avlägsna skräp, vilket säkerställer levande livsmedel av hög kvalitet och utan föroreningar. (6) Sterilitetstestning av GF Artemia innan den utfodras med GF-fisklarver. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Index för GF Artemia-cystor och nauplii inkuberade i 24 timmar. (A) Obehandlade Artemia-cystor med föroreningsfilm (skalstapel: 500 μm). (B) Behandlade Artemia-cystor med en något konvex yta efter vattenabsorption och ett renare utseende (skalstreck: 500 μm). (C) Mikroskopisk undersökning av färskt inkuberad levande GF Artemia nauplii (skalstapel: 2000 μm) och (D) förstoring med en skalstapel på 1000 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Steril detektion av GF-fisk i varje livsstadium och GF Artemia. A) Sterila tester av CR- och GF-fiskprover med TSB och BHI flytande medium, TSA, och blodplattor under aeroba och anaeroba förhållanden. (B) Sterila tester av obehandlade Artemia-cystor , GF Artemia-cystor och nauplii med användning av TSB och BHI flytande medium, TSA, och blodplattor under aeroba och anaeroba förhållanden. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Isolering och identifiering av tarmbakterier hos zebrafiskar. (A) Bakteriestammar, koloniernas egenskaper, 16S-sekvenseringskartor (exempel: Aeromonas sp. och Vibrio sp.). (B) Släkte och NCBI-anslutningar. (C) Metaboliska funktioner hos bakterier som isolerats från zebrafiskens tarm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Infektion och kolonisering av tarmbakteriestammar hos GF-zebrafisk. (A) Återhämtning av isolerade och identifierade bakteriestammar för infektionsexperiment. (B) Märkning av bakterier med fluorescerande färgämnen och infektion av GF-zebrafisklarver vid 5 dpf. Förstoring: 1x. (C) Observation av distribution och kolonisering av bakterier (Vibrio sp.) i tarmvävnader in vivo. Förstoring: 3x. (D) Räkning av CFU av bakterier (Aeromonas sp. och Vibrio sp.) i varje fisklarv genom daglig provtagning. Data presenterar medelvärdet ± SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Grundfärger Sekvenser(5'-3') Produktens längd
27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 1465 bp
1492R ACGGYTACCTTGTTACGACTT
63F CAGGCCTAACACATGCAAGTC 1324 bp
1387R GGGCGGWGTGTACAAGGC

Tabell 1: Primers som används för bakteriedetektion.

Komponenter Enheter Volym (μL)
Taq DNA-polymeras 2,5 U/μL 0.1
10× buffert (mg2+) --- 2.1
dNTP-blandning 2,5 m² 1.6
Primer 27F 10 μM 1
Primer 1492R 10 μM 1
DNA/RNA-fri H2O --- 13.2
Mall DNA --- 1
Total volym --- 20

Tabell 2: Slutlig koncentration och volym av komponenter per reaktion.

Steg Temperatur Tid Cykler
Initial denaturering 95 °C 4 minuter --
Denaturering 94 °C 1 minut 35
Glödgning 55 °C 1 minut
Förlängning 72 °C 1 minut
Slutlig förlängning 72 °C 10 minuter --
Hålla 4 °C ∞ --

Tabell 3: PCR-program för amplifiering av 16S rRNA-genen.

Kompletterande figur 1: De kritiska utvecklingsindexen för GF- och CR-zebrafiskmodeller. (A) Kläckhastigheten för CR- och GF-zebrafiskar vid 72 hpf, och (B) hjärtslag/10 s för CR- och GF-fiskar vid 7 dpf och 14 dpf. Överlevnaden (%) för CR- och GF-fisk minskade från 7 dagar och 14 dagar med 86 %, 60-80 % till 10-25 % vid 30 dpf. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kritiska steg inom protokollen för GF-fisk och GF-matlagning
Under genereringen av GF-fiskmodeller var flera kritiska steg inblandade, inklusive beredning av sterila material, sterilisering av embryon, daglig förnyelse av GZM, insamling av olika prover och steril undersökning av varje prov med flera metoder. Bland dessa steg är den initiala behandlingen av embryon grundläggande och avgörande för framgången för GF-modeller. Kontrollmedel, deras koncentrationer och behandlingstider är avgörande för att uppnå optimala steriliseringshastigheter och kläckningsframgång. Noggrann uppmärksamhet är nödvändig vid hantering av GF-fiskembryon till larver, vilket innebär dagliga förändringar av mediet och att säkerställa att material och plattformar steriliseras noggrant med hjälp av ultraviolett ljus eller autoklavering när plattorna tas bort från inkubatorn. Övervakning av temperaturförhållanden och drifttid under vintern är viktigt för att förhindra att larver dör på grund av lägre temperaturer i rena bänkar.

Steril äggula och GF Artemia bör detekteras innan de matas till fisk efter 7 dpf för att säkerställa deras sterila tillstånd för långsiktiga GF-modeller. Under utfodringsperioden är det viktigt att rengöra matrester som en del av de prover som samlas in för att upptäckas vid förnyelse av avfallsmediet. Behållaren, volymen av GZM och matmassan bör justeras tillsammans med tillväxt- och utvecklingsstadierna för att förhindra förlust av GF-fisk på grund av begränsade omgivningar och problem med vattenkvaliteten. Regelbunden övervakning och justering av dessa parametrar bidrar till ett framgångsrikt underhåll av GF-fiskmodeller.

Ändringar och betydelse av dessa protokoll
Den förenklade trestegsprocessen för att generera GF-zebrafiskembryon, som involverar optimerade medel, koncentrationer och exponeringstider för AB-GZM-, PVP-I- och NaClO-lösningar, säkerställer en hög steriliseringshastighet och hälsosam utveckling av modeller. Dessutom har de sterila detektionsmetoderna för dagliga prover fulländats för att inkludera plattor och flytande mediumkulturer under aeroba och anaeroba förhållanden, tillsammans med molekylära tekniker med vanliga bakteriella primrar. Ytterligare erfarenheter av testning för bakteriella och svampföroreningar syftar till att optimera isolatorföroreningar och steril testning under GF-djurtekniker48.

Det specifika protokollet för GF Artemia nauplii som levande föda för fiskmodeller har undersökts i vår studie, och ett patent beviljades till PPJ och DSP av China National Intellectual Property Administration (No. ZL202210482684.8). Långsiktiga GF-fiskmodeller begränsas konsekvent av otillräcklig och olämplig näring, vilket förvärrar svagheter i tarmfunktioner relaterade till matsmältning och absorption. Som en trovärdig födokälla för medaka- och zebrafiskmodeller i olika livsstadier bör GF Artemia sp. vara lätt att tillaga med en enkel procedur, kort inkubationstid och steril detektion i realtid för daglig användning. I denna metod sköljs normala Artemia-cystor i en tillräcklig koncentration av NaClO för att vara aseptiska och inkuberas sedan i en filmbelagd flaska, samt på en platta och i ett flytande medium för detektion. Detta stöder nykläckta nauplii för GF-fiskmatning. Sterilhastigheten och kläckningshastigheten för Artemia, liksom kroppslängden, vikten och aktiviteten hos Artemia, är utmärkta, vilket indikerar tillgängliga tillämpningar i praktiken.

Betydelsen av dessa modifieringar i GF-fisk och GF-livsmedelsprotokoll gynnar forskare när det gäller att generera modeller vid embryon, larver, juvenila stadier och till och med tidiga vuxna och vuxna stadier hos marina och sötvattensarter. Långsiktiga GF-djur kommer att ge tillstånd som in vivo-modeller i forskning om läkemedelsscreening och mikrobiella funktioner under värdtillväxt och utveckling, särskilt i mognaden av immunitet och relaterade tarmcellinjer. Till exempel har zebrafisklarver endast medfödd immunitet under den första veckan, för att sedan utveckla det adaptiva immunitetssystemet under 7-21 dpf, tillsammans med thymusmognad31,49. Dessutom kan GF-fiskmodeller ge möjlighet att analysera interaktioner mellan bakterier och bakterier och mikrobiota-värdar med levande observation av dynamiska koloniserings- och migrationsprocesser i organismer50,51.

Metodens begränsningar
Att odla GF-fisk från unga fiskar till tidiga vuxna (28 dpf-2,5 mpf) och könsmogna vuxna (>2,5 mpf) är fortfarande en utmaning på grund av ökad dödlighet och risken för bakteriell kontaminering under modellunderhåll. Dessa begränsningar uppstår främst på grund av frånvaron av lämpliga autokultursystem för fiskar som lever i en GF-miljö. Dessa system bör omfatta ren luft, rent vatten och ett livsmedelssystem för att effektivt underhålla djuren och deras miljöer, vilket säkerställer fullständig isolering från externa mikroorganismer. Till skillnad från andra GF-djurmodeller som möss och kycklingar52 är det svårt att få GF-zebrafisk genom anatomiska operationer från CR-föräldrarna på grund av deras vattenvanor och naturliga befruktningsstil.

Att behandla vuxna djur som helt utan tarmmikrobiota är också utmanande. Även om antibiotikabehandling kan inducera ett tillstånd som liknar det hos specifika patogenfria (SPF) djur, kännetecknat av en minskad mikrobiota som detekteras i fekala prover, är det fortfarande svårt att uppnå äkta GF-modeller för vuxna fiskar. Utmaningarna med att etablera och underhålla GF-modeller, särskilt under övergången från juvenila till långsiktiga tillstånd, är betydande. Betydelsen av GF-avkomma, såsom GF F1- eller F2-ägg från vuxna GF-fiskar, i mikrobiell forskning erkänns. Det tar dock mycket tid att övervinna utmaningarna med att etablera och underhålla långsiktiga modeller för GF-fiskar hos vuxna.

Det är värt att notera att gnotobiotiska zebrafiskar med specifik bakteriekolonisering har utvecklats, vilket visar kronisk överlevnad baserat på GF-modeller. Det är dock fortfarande osäkert om dessa modeller kan fungera som genomförbara alternativ till GF-modeller inom bakteriell infektion och biomedicinsk forskning.

Framtida tillämpningar av GF fiskmodeller
I den här studien har vi förfinat protokollet för att generera GF-zebrafiskmodeller som går från embryon till unga fiskar. Detta framsteg har betydande tillämpningar inom utvecklingsbiologi, immunologi, forskning om mänskliga sjukdomar och organogenes. Genom massisolering och identifiering utforskar studien funktioner, mekanismer och tarmhärledda metaboliter hos enskilda bakteriestammar. Undersökningen går ut på att infektera GF zebrafiskmodeller efter att ventilen öppnat steg47,53. Dessutom underlättar märkta bakterier med fluorescens observationen av kolonisering och distribution i levande GF-larver, fria från andra mikrobiella influenser54. Liknande GF-fiskmodeller, såsom marin eller sötvattensmedaka, kan skapas med hjälp av jämförbara metoder med olika medel eller mediumförändringar.

För att undersöka mekanismer för mänskliga sjukdomar använder studien FMT-metoder, där prover från patienter eller donatorer överförs till friska djur eller GF-modeller55. Till skillnad från konventionellt uppfödda (CR) djur erbjuder GF-modeller robusta bevis för mikrobiella funktioner, effekter eller svar i värden, särskilt i kombination med bakteriofager för att reglera målbakterier i mikrobiotan46.

Sammanfattningsvis fungerar GF-zebrafiskar som kraftfulla modeller för att bedöma bakteriell säkerhet, läkemedelseffektivitet, föroreningstoxicitet eller sammansatt interferens, på grund av deras känsliga och rena tarmmiljö. Framtida utforskning av GF-fisktillämpningar bör omfatta olika områden, med ett behov av att skapa vuxna GF-fiskmodeller för en djupare förståelse av mikrobiella funktioner i olika livsstadier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Protokollet för GF Artemia har beviljats som ett patent av China National Intellectual Property Administration, vilket kommer att lindra den begränsade användningen av metoden efter att ha fått tillstånd från författarna. Författarna förklarar att de inte har några andra konkurrerande eller ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi tackar uppriktigt stödet från Chongqing Medical University Talent Project (nr R4014 till DSP och R4020 till PPJ), National Natural Science Foundation of China (NSFC, nr 32200386 till PPJ), Chongqing Postdoctoral Innovation Mentor Studio (X7928 DSP) och programmet för Kina-Sri Lanka Joint Center for Water Technology Research and Demonstration av Chinese Academy of Sciences (CAS)/China-Sri Lanka Joint Center for Education and Research by CAS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AB-GZM Amphotericin:Solarbio;  kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio. Amphotericin:CAS:1397-89-3;
kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.		 49.6 mL GZM, 50 µL amphotericin stock solution (250 µg/mL), 25 µL kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 µL ampicillin stock solution (20 mg/mL).
1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes biosharp BS-15-M To collect samples, and hold agents
2.4 g/L NaClO XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. CAS: 7681-52-9 Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.
6-well plates, 24-, 48- well plates LABSELECT  11112 To culture fish
Aeronomas NCBI database No.MK178499 2019-JPP-ESN
Anaerobic TSA plates tryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
agar powder:BioFroxx.		 tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
agar powder:9002-18-0.		 The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.
Anaerobic work station GENE SCIENCE E200G Bacterial isolation, sterile testing
Analysis GraphPad Prism 5 v6.07 To analysis the data
API 20 E kits  BioMerieux SA, France No.1005915090 Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism
Artemia (Brine shrimp) Shangjia Aquarium Co., Ltd. Aquamaster brand Artemia cysts, and brine shrimp eggs 
Auto cycle system for fish culture Ningbo Hairui Technology Co., Ltd No Cat Maintain the fish
Autoclave Zeal Way G154DWS Prepare the materials
BHI Aerobic Coolaber Cat#PM0640 BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.
BHI Anaerobic Coolaber Cat#PM0640 BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.
Biochemical incubator LongYue Co., Ltd SPX For fish and plates
Biosafety cabinet Haier HR40-IIA2 Sterile treatment and testing
Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. CAS: 7681-52-9 Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.
Blood plates sheep blood:Solarbio Cat. NO. TX0030 Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.
Cell culture flask Corning 430639 To culture fish
CM-Dil dyes Molecular Probes Cat#C7000   To label the bacteria
Constant temperature shaking incubator Peiving Co., Ltd HZQ-X100 Bacterial culture
Database NCBI Bacteria and Archaea database Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/
Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/
Disposable Pasteur pipette biosharp bs-xh-03l Used to change water, and transfer eggs
Disposable petri dish biosharp BS-90-D To culture fish
DNA kits Solaribio Cat#D1600 Bacterial genomic DNA extraction kits 
Electric pipette SCILOGEX Levo me Change water
Exiguobacterium NCBI database No.MK178504 2019-JPP-ESN
GZM Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd. No Cat Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.
Laboratory pure water system Hitech Co., Ltd Prima-S15 Prepare the agents
Microscope Nikon SMZ18 With fluorescent light to observe fish larvae
PCR kits TIANGEN Cat#ET101 Taq DNA Polymerase kit
Pipette LABSELECT  sp-013-10 Change water
Povidone iodine (PVP-I) Aladdin Lot#H1217005 Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.
Timing converter PinYi Co., Ltd AL-06 To regulate the light
TSA plates tryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;
agar powder:BioFroxx.		 tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;
agar powder:9002-18-0.		 TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.
TSB Aerobic tryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;		 tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;		 TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.
TSB Anaerobic tryptone:Oxoid ;
soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;		 tryptone:LP0042B;
soy peptone:Cat#S9500;
NaCl:BS112;		 TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.
Ultra-clean workbench Airtech SW-CJ-2FD Sterile treatment and testing
Ultra-pure flow system for fish culture Marine Biological Equipment company No Cat Produce water for fish
Vibrio NCBI database No.MK178501 2019-JPP-ESN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sieber, M., Traulsen, A., Schulenburg, H., Douglas, A. E. On the evolutionary origins of host-microbe associations. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (9), e2016487118 (2021).
  2. Sommer, F., Backhed, F. The gut microbiota--masters of host development and physiology. Nat Rev Microbiol. 11 (4), 227-238 (2013).
  3. Kim, S., Jazwinski, S. M. The gut microbiota and healthy aging: A mini-review. Gerontology. 64 (6), 513-520 (2018).
  4. Milani, C., et al. The first microbial colonizers of the human gut: Composition, activities, and health implications of the infant gut microbiota. Microbiol Mol Biol Rev. 81 (4), e00036 (2017).
  5. De Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: Mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
  6. Shi, N., Li, N., Duan, X., Niu, H. Interaction between the gut microbiome and mucosal immune system. Mil Med Res. 4 (1), 14 (2017).
  7. Liu, B. N., Liu, X. T., Liang, Z. H., Wang, J. H. Gut microbiota in obesity. World J Gastroenterol. 27 (25), 3837-3850 (2021).
  8. Aron-Wisnewsky, J., Warmbrunn, M. V., Nieuwdorp, M., Clément, K. Metabolism and metabolic disorders and the microbiome: The intestinal microbiota associated with obesity, lipid metabolism, and metabolic health-pathophysiology and therapeutic strategies. Gastroenterology. 160 (2), 573-599 (2021).
  9. Chen, Y. W., Zhou, J. H., Wang, L. Role and mechanism of gut microbiota in human disease. Front Cell Infect Microbiol. 11, 625913 (2021).
  10. Hao, W. Z., Li, X. J., Zhang, P. W., Chen, J. X. A review of antibiotics, depression, and the gut microbiome. Psychiatry Res. 284, 112691 (2020).
  11. Nadal, A. L., et al. gut immunity: Using the zebrafish model to understand fish health. Front Immunol. 11, 114 (2020).
  12. Asadi, A., et al. Obesity and gut-microbiota-brain axis: A narrative review. J Clin Lab Anal. 36 (5), e24420 (2022).
  13. Mlynarska, E., et al. The role of the microbiome-brain-gut axis in the pathogenesis of depressive disorder. Nutrients. 14 (9), 1921 (2022).
  14. Yu, Y. J., Raka, F., Adeli, K. The role of the gut microbiota in lipid and lipoprotein metabolism. J Clin Med. 8 (12), 2227 (2019).
  15. Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. J Microbiol Biotechnol. 25 (10), 1583-1588 (2015).
  16. Melancon, E., et al. Best practices for germ-free derivation and gnotobiotic zebrafish husbandry. Methods Cell Biol. 138, 61-100 (2017).
  17. Bhattarai, Y., Kashyap, P. C. Germ-free mice model for studying host-microbial interactions. Methods Mol Biol. 1438, 123-135 (2016).
  18. Wang, X. N., Wu, C. W., Wei, H. Humanized germ-free mice for investigating the intervention effect of commensal microbiome on cancer immunotherapy. Antioxid Redox Signal. 37 (16), 1291-1302 (2022).
  19. Jia, P. P., et al. Role of germ-free animal models in understanding interactions of gut microbiota to host and environmental health: A special reference to zebrafish. Environ Pollut. 279, 116925 (2021).
  20. Gootenberg, D. B., Turnbaugh, P. J. Companion animals symposium: Humanized animal models of the microbiome. J Anim Sci. 89 (5), 1531-1537 (2011).
  21. Hintze, K. J., et al. Broad scope method for creating humanized animal models for animal health and disease research through antibiotic treatment and human fecal transfer. Gut Microbes. 5 (2), 183-191 (2014).
  22. Kamareddine, L., Najjar, H., Sohail, M. U., Abdulkader, H., Al-Asmakh, M. The microbiota and gut-related disorders: Insights from animal models. Cells. 9 (11), 2401 (2020).
  23. Rogala, A. R., Oka, A., Sartor, R. B. Strategies to dissect host-microbial immune interactions that determine mucosal homeostasis vs. Intestinal inflammation in gnotobiotic mice. Front Immunol. 11, 214 (2020).
  24. Rawls, J. F., Samuel, B. S., Gordon, J. I. Gnotobiotic zebrafish reveal evolutionarily conserved responses to the gut microbiota. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (13), 4596-4601 (2004).
  25. Bates, J. M., et al. Distinct signals from the microbiota promote different aspects of zebrafish gut differentiation. Dev Biol. 297 (2), 374-386 (2006).
  26. Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
  27. Xia, H., et al. Zebrafish: An efficient vertebrate model for understanding role of gut microbiota. Mol Med. 28 (1), 161 (2022).
  28. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: Staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  29. Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nat Protoc. 3 (12), 1862-1875 (2008).
  30. Shan, Y., et al. Immersion infection of germ-free zebrafish with listeria monocytogenes induces transient expression of innate immune response genes. Front Microbiol. 6, 373 (2015).
  31. Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. A. Zebrafish axenic larvae colonization with human intestinal microbiota. Zebrafish. 15 (2), 96-106 (2018).
  32. Singleman, C., Holtzman, N. G. Growth and maturation in the zebrafish, danio rerio: A staging tool for teaching and research. Zebrafish. 11 (4), 396-406 (2014).
  33. Clift, D., Richendrfer, H., Thorn, R. J., Colwill, R. M., Creton, R. High-throughput analysis of behavior in zebrafish larvae: Effects of feeding. Zebrafish. 11 (5), 455-461 (2014).
  34. Nascimento, M. D., Schorer, M., Dos Santos, J. C. E., Rocha, M. S. A., Pedreira, M. M. Live and frozen Artemia nauplii for catfish (steindachner, 1876) larvae in different salinities. Trop Anim Health Prod. 52 (2), 653-659 (2020).
  35. Jia, P. P., et al. Breaking the mold: The first report on germ-free adult marine medaka (oryzias melastigma) models. bioRxiv. , (2023).
  36. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. JoVE. (69), e4196 (2012).
  37. Wilson, C. Aspects of larval rearing. ILAR J. 53 (2), 169-178 (2012).
  38. Aleström, P. a-O., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2020).
  39. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish. , (2002).
  40. Nursyirwani, N., et al. Phenotype and genotype of lactic acid bacteria (lab) isolated from the tiger grouper Epinephelus fuscoguttatus alimentary tract. F1000Res. 6, 1984 (2017).
  41. Karolenko, C., Desilva, U., Muriana, P. M. Microbial profiling of biltong processing using culture-dependent and culture-independent microbiome analysis. Foods. 12 (4), 844 (2023).
  42. Jia, P. P., et al. Chronic exposure to graphene oxide (go) induced inflammation and differentially disturbed the intestinal microbiota in zebrafish. Environ Sci Nano. 6 (8), 2452-2469 (2019).
  43. Sun, B. L., et al. Probiotic supplementation mitigates the developmental toxicity of perfluorobutanesulfonate in zebrafish larvae. Sci Total Environ. 799, 149458 (2021).
  44. Qian, H. F., Liu, G. F., Lu, T., Sun, L. W. Developmental neurotoxicity of microcystis aeruginosa in the early life stages of zebrafish. Ecotoxicol Environ Saf. 151, 35-41 (2018).
  45. Bertotto, L. B., Catron, T. R., Tal, T. Exploring interactions between xenobiotics, microbiota, and neurotoxicity in zebrafish. Neurotoxicology. 76, 235-244 (2020).
  46. Jia, P. P., et al. Bacteriophage-based techniques for elucidating the function of zebrafish gut microbiota. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (7-8), 2039-2059 (2023).
  47. Xin, G. Y., et al. Gut bacteria vibrio sp. And aeromonas sp. Trigger the expression levels of proinflammatory cytokine: First evidence from the germ-free zebrafish. Fish Shellfish Immunol. 106, 518-525 (2020).
  48. Dremova, O., et al. Sterility testing of germ-free mouse colonies. Front Immunol. 14, 1275109 (2023).
  49. Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, danio rerio: A gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
  50. Rolig, A. S., Parthasarathy, R., Burns, A. R., Bohannan, B. J. M., Guillemin, K. Individual members of the microbiota disproportionately modulate host innate immune responses. Cell Host Microbe. 18 (5), 613-620 (2015).
  51. Stressmann, F. A., et al. Mining zebrafish microbiota reveals key community-level resistance against fish pathogen infection. ISME J. 15 (3), 702-719 (2021).
  52. Guitton, E., et al. Production of germ-free fast-growing broilers from a commercial line for microbiota studies. JoVE. (160), e61148 (2020).
  53. Rea, V., Bell, I., Ball, T., Van Raay, T. Gut-derived metabolites influence neurodevelopmental gene expression and wnt signaling events in a germ-free zebrafish model. Microbiome. 10 (1), 132 (2022).
  54. Russo, P., et al. Zebrafish gut colonization by mcherry-labelled lactic acid bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 99 (8), 3479-3490 (2015).
  55. Rawls, J. F., Mahowald, M. A., Ley, R. E., Gordon, J. I. Reciprocal gut microbiota transplants from zebrafish and mice to germ-free recipients reveal host habitat selection. Cell. 127 (2), 423-433 (2006).

Tags

Denna månad i JoVE utgåva 206 Germ-free (GF) zebrafisk Artemia mat Embryo-larver-juvenila modeller Tarmbakterier Optimerat protokoll
Generering, underhåll och identifiering av bakteriefria zebrafiskmodeller från larver till juvenila stadier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jia, P. P., Liu, X. R., Wu, M. F.,… More

Jia, P. P., Liu, X. R., Wu, M. F., Li, Y., Zhang, L. C., Pei, D. S. Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages. J. Vis. Exp. (206), e66512, doi:10.3791/66512 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter