Questo protocollo delinea i passaggi principali per ottenere embrioni di pesce privi di germi (GF) e mantenerli dalle larve fino allo stadio giovanile, compreso il campionamento e il rilevamento del loro stato di sterilità. L'uso di modelli GF con infezione è importante per comprendere il ruolo dei microbi nella salute dell'ospite.
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Articolo metodologico
Generazione, manutenzione e identificazione di modelli di zebrafish privi di germi dalle larve agli stadi giovanili
In questo articolo
Sommario
Abstract
I pesci zebra fungono da modelli preziosi per la ricerca sulla crescita, l'immunità e il microbiota intestinale grazie alle loro somiglianze genomiche con i mammiferi, agli embrioni trasparenti sviluppati in un ambiente corionico relativamente pulito e allo sviluppo estremamente rapido delle larve rispetto ai modelli di roditori. Il pesce zebra privo di germi (Danio rerio) è fondamentale per valutare la tossicità degli inquinanti e stabilire modelli di malattie simili a quelle umane correlate alle funzioni microbiche. Rispetto ai modelli allevati in modo convenzionale (CR) (pesci in allevamento comune), il pesce zebra GF consente una manipolazione più accurata del microbiota dell'ospite, aiutando a determinare la relazione causale tra microrganismi e ospiti. Di conseguenza, svolgono un ruolo fondamentale nel far progredire la nostra comprensione di queste relazioni. Tuttavia, i modelli di pesce zebra GF sono tipicamente generati e studiati durante le prime fasi di vita (dagli embrioni alle larve) a causa delle limitazioni nella funzione immunitaria e nell'assorbimento dei nutrienti. Questo studio ottimizza la generazione, il mantenimento e l'identificazione dei primi modelli di pesce zebra GF senza alimentazione e con alimentazione a lungo termine utilizzando alimenti GF (come Artemia sp., artemia salina). Durante tutto il processo, sono stati eseguiti campionamenti e colture giornalieri e identificati attraverso rilevamenti multipli, tra cui piastre e sequenziamento dell'rRNA 16S. Sono stati registrati il tasso asettico, la sopravvivenza e gli indici di sviluppo del pesce zebra GF per garantire la qualità e la quantità dei modelli generati. È importante sottolineare che questo studio fornisce dettagli sull'isolamento batterico e sulle tecniche di infezione per i pesci GF, consentendo la creazione efficiente di modelli di pesci GF dalle larve agli stadi giovanili con supporto alimentare GF. Applicando queste procedure nella ricerca biomedica, gli scienziati possono comprendere meglio le relazioni tra le funzioni batteriche intestinali e la salute dell'ospite.
Introduzione
Il microbiota (cioè Archaea, Batteri, Eucarya e virus) svolge un ruolo cruciale nel mantenimento della salute dell'ospite e contribuisce allo sviluppo di varie malattie influenzando i processi fisiologici e patologici attraverso interazioni simbiotiche all'interno della barriera intestinale, della superficie epiteliale e delle funzioni della mucina negli individui 1,2,3. La composizione del microbiota nelle diverse fasi della vita, dall'infanzia alla giovinezza, all'età adulta e all'invecchiamento, nonché la sua presenza in vari luoghi come narici, ....
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Protocollo
Gli esperimenti sui pesci sono stati condotti in conformità con le linee guida del Comitato per la cura e l'uso degli animali di Chongqing e del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università medica di Chongqing, in Cina, nonché con gli standard per gli animali da esperimento emessi dall'Ufficio statale per la qualità e la supervisione tecnica (ID approvazione: da GB14922-2001 a GBT14927-2001). Il pesce zebra (Danio rerio, wild type, ceppo AB) è stato acquistato dall'Istituto di idrobiologia dell'Accademia cinese delle scienze e mantenuto in laboratorio seguendo le procedure precedentemente riportate36.
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Risultati
I modelli GF zebrafish possono essere prodotti in modo efficiente utilizzando le abbondanti uova deposte dalle coppie di zebrafish, con il protocollo ottimizzato sulla base dei precedenti modelli di pesce GF35. Una singola piastra a 6 pozzetti può coltivare circa 30-48 embrioni/larve, consentendo un'ampia raccolta di dati e analisi statistiche. Dopo il trattamento sterile, gli embrioni GF vengono coltivati in un'incubatrice pulita fino alla schiusa in larve a 48-72 ore e cambiati GZM ogni giorno c.......
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Discussione
Passaggi critici all'interno dei protocolli di GF fish e preparazione del cibo GF
Durante la generazione di modelli di pesci GF, sono state coinvolte diverse fasi critiche, tra cui la preparazione di materiali sterili, la sterilizzazione degli embrioni, il rinnovo giornaliero del GZM, la raccolta di vari campioni e l'esame sterile di ciascun campione utilizzando più metodi. Tra questi passaggi, il trattamento iniziale degli embrioni è fondamentale e decisivo per il successo dei modelli GF. Gli agenti .......
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Dichiarazioni
Il protocollo di GF Artemia è stato concesso come brevetto dalla China National Intellectual Property Administration, che allevierà l'uso limitato del metodo dopo aver ottenuto il permesso degli autori. Gli autori dichiarano di non avere altri interessi concorrenti o finanziari.
Ringraziamenti
Ringraziamo sinceramente il supporto del Chongqing Medical University Talent Project (n. R4014 a DSP e R4020 a PPJ), della National Natural Science Foundation of China (NSFC, n. 32200386 a PPJ), del Chongqing Postdoctoral Innovation Mentor Studio (X7928 DSP) e del Programma del Centro congiunto Cina-Sri Lanka per la ricerca e la dimostrazione sulla tecnologia dell'acqua dell'Accademia cinese delle scienze (CAS) / Centro congiunto Cina-Sri Lanka per l'istruzione e la ricerca di CAS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AB-GZM | Amfotericina:Solarbio; kanamicina:Solarbio; Ampicillina:Solarbio. | Amfotericina:CAS:1397-89-3; kanamicina:CAS: 25380-94-0; Ampicillina: CAS: 69-52-313. | 49,6 mL GZM, 50 &; micro; L. soluzione madre di amfotericina (250 µ g/mL), 25 µ L. kanamicina soluzione madre (10 mg/mL) e 250 µ L. soluzione madre di ampicillina (20 mg/mL). |
| Provette EP da 1,5 mL, 15 mL, 50 mL | biosharp | BS-15-M | Per raccogliere campioni e trattenere agenti |
| 2,4 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Diluito con soluzione acquosa di ipoclorito di sodio all'8%. |
| piastre a 6 pozzetti, piastre a 24, 48 pozzetti | LABSELECT | 11112 | Per allevare pesci |
| Aeronomas | NCBI database | n.MK178499 | 2019-JPP-ESN |
| Piastre TSA anaerobiche | triptone:Ossoide ; peptone di soia:Solarbio ; NaCl:Biosharp; agar in polvere: BioFroxx. | triptone:LP0042B; peptone di soia:Gatto#S9500; NaCl:BS112; POLVERE DI AGAR: 9002-18-0. | Le piastre TSA sono state preparate con 400 ml di terreno contenente 6 g di triptone, 2 g di peptone di soia, 2 g di NaCl e 6 g di polvere di agar sotto il sistema anaerobico. |
| Stazione di lavoro anaerobica | GENE SCIENCE | E200G | Isolamento batterico, test sterili |
| Analisi GraphPad | Prism 5 | v6.07 | Per analizzare i |
| dati API 20 E kits | BioMerieux SA, Francia | No.1005915090 | Ref 20100 Kit per rilevare il metabolismo batterico |
| Artemia (Gamberetti in salamoia) | Shangjia Aquarium Co., Ltd. | di marca Aquamaster | e uova di artemia salina |
| Sistema di ciclo automatico per l'allevamento di pesci | Ningbo Hairui Technology Co., Ltd | No Cat | Mantenere il pesce |
| Autoclave | Zeal Way | G154DWS | Preparare i materiali |
| BHI Aerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | BHI medium è stato preparato, in cui 100 mL di terreno includevano 3,7 g di polvere BHI. |
| BHI Anaerobic | Coolaber | Cat#PM0640 | Il terreno BHI è stato preparato e diviso in tubi anaerobici sotto il sistema anaerobico. |
| Incubatore biochimico | LongYue Co., Ltd | SPX | Per pesci e piatti |
| Armadio di biosicurezza | Haier | HR40-IIA2 | Trattamento e test sterili |
| Agente sbiancante di 0,02 g/L NaClO | XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd. | CAS: 7681-52-9 | Soluzione di lavoro con ipoclorito di sodio (NaClO) concentrazione: diluita con soluzione acquosa di ipoclorito di sodio all'8% o 166,6 uL di ipoclorito di sodio al 6% con 500 mL di acqua distillata. |
| Piastre di sangue | di pecora: Solarbio | N. di cat. TX0030 | Il sangue di pecora defibrinato sterile è stato aggiunto alla TSA per preparare piastre di sangue al 5%. |
| Pallone per colture cellulari | Corning | 430639 | Per la coltura di pesci |
| Coloranti CM-Dil | Sonde molecolari | Cat#C7000 | Per etichettare i batteri |
| Incubatore con agitazione a temperatura costante | Peiving Co., Ltd | HZQ-X100 | Database di colture batteriche |
| NCBI Database di | batteri e archei | Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ Batteri FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/ | |
| Pipetta Pasteur monouso | biosharp | bs-xh-03l | Utilizzato per cambiare l'acqua e trasferire le uova |
| Piastra di Petri monouso | biosharp | BS-90-D | Per la coltura di kit di DNA di pesce |
| Solaribio | Cat#D1600 | Kit di estrazione del DNA genomico batterico... | |
| Pipetta elettrica | SCILOGEX | Levo me | Cambia l'acqua |
| Exiguobacterium | NCBI database | n.MK178504 | 2019-JPP-ESN |
| GZM | Sale marino:LANDEBAO Co., Ltd. | No Cat | Composto da 1 L di acqua e 1,5 mL di soluzione di sale marino (40 g/L), sterilizzato in autoclave. Il contenuto di sale marino nella soluzione di GZM era di 60 mg/L. |
| Sistema di acqua pura da laboratorio | Hitech Co., Ltd | Prima-S15 | Preparare gli agenti |
| Microscopio | Nikon | SMZ18 | Con luce fluorescente per osservare le larve di pesce |
| Kit PCR | TIANGEN | Cat#ET101 | Taq Kit DNA polimerasi |
| Pipetta | LABSELECT | sp-013-10 | Cambia l'acqua |
| : iodio povidone (PVP-I) | Aladdin | Lot#H1217005 | Soluzione acquosa, iodio povidone 0,4 g/L di acqua pura. |
| Convertitore di temporizzazione | PinYi Co., Ltd | AL-06 | Per regolare la luce |
| TSA piastre | triptone: Oxoid ; peptone di soia:Solarbio ; NaCl:Biosharp; agar in polvere: BioFroxx. | triptone:LP0042B; peptone di soia:Gatto#S9500; NaCl:BS112; POLVERE DI AGAR: 9002-18-0. | Le piastre TSA sono state preparate con 400 ml di terreno contenente 6 g di triptone, 2 g di peptone di soia, 2 g di NaCl, 6 g di agar in polvere. |
| TSB Triptone aerobico | :Ossoide ; peptone di soia:Solarbio ; NaCl:Biosharp; | triptone:LP0042B; peptone di soia:Gatto#S9500; NaCl:BS112; | È stato preparato un terreno TSB, in cui 400 ml di terreno includevano 6 g di triptone, 2 g di peptone di soia e 2 g di NaCl. |
| TSB Triptone anaerobico | :Ossoide ; peptone di soia:Solarbio ; NaCl:Biosharp; | triptone:LP0042B; peptone di soia:Gatto#S9500; NaCl:BS112; | Il terreno TSB è stato preparato e diviso nei tubi anaerobici sotto il sistema anaerobico. |
| Banco da lavoro ultra-pulito | Airtech | SW-CJ-2FD | Trattamento e test sterili |
| Sistema di flusso ultrapuro per l'allevamento ittico | Azienda di attrezzature biologiche marine | No Cat | Produce acqua per pesci |
| Vibrio | NCBI database | n.MK178501 | 2019-JPP-ESN |
Riferimenti
- Sieber, M., Traulsen, A., Schulenburg, H., Douglas, A. E. On the evolutionary origins of host-microbe associations. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (9), e2016487118(2021).
- Sommer, F., Backhed, F. The gut microbiota--masters of host development and physiology. Nat Rev Microbio....
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Ristampe e permessi
