Niet-invasieve beeldvorming van Leukocyte Homing en migratie In vivo</em
Summary
We beschrijven hier een niet-invasieve twee-foton (2P) microscopie aanpak om te studeren leukocyten homing in de muis voetzool. We bespreken de technische aspecten van onze weefsels beeldvorming voorbereiding en loopt de lezer door een typisch experiment van de eerste set tot en met uitvoering en het verzamelen van gegevens.
Abstract
Twee-foton (2P) microscopie is een hoge resolutie imaging techniek die heeft over het algemeen aangepast door biologen. De waarde van 2P microscopie is dat het rijk spatiotemporele informatie met betrekking tot het gedrag binnen de cel intact weefsels en in levende muizen biedt. Leukocyten werving speelt een belangrijke rol in de afweer tegen infecties en wanneer aangevinkt, kan bijdragen aan inflammatoire en auto-immuunziekten. Studeren leukocyten rekrutering in vivo is technisch een uitdaging, omdat cellen zijn snel, die zich binnen schepen diep in lichtverstrooiing weefsels. Tot op heden zijn de meeste intravitale imaging studies vereisen chirurgische voorbereiding op de bloedvaten en weefsel bloot te leggen. Om te voorkomen dat de weefselbeschadiging en ontsteking veroorzaakt door een operatie zelf, hier, beschrijven we een niet-invasieve single-cell imaging aanpak die kan worden gebruikt om witte bloedcellen handel in de muis voetzool en vingerkootjes te bestuderen. We bespreken de technische aspecten van onze 2P imaging voorbereiding en loopt de lezer door een typisch experiment van de eerste set tot en met uitvoering en het verzamelen van gegevens.
Protocol
Discussion
In deze video protocol tonen we de procedures voor niet-invasieve beeldvorming van 2P leukocyten rekrutering in reactie op de ontsteking.
De voetzool is een klassieke fysiologische site voor het bestuderen van ontsteking, zoals allergie, infectie en auto-immuunziekte 4-7. 2P beeldvorming geeft een gedetailleerd beeld van de verschillende stappen in leukocyten mensenhandel wegen, uit te rollen en de hechting in de bloedvaten te chemotaxis naar sites van effector functie. We hebben …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie R01-3155 tot 53.502 en de Universiteit van Washington-Pfizer Biomedical Research overeenkomst.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Isoflurane, USP | Butler Animal Health Supply | 029405 | ||
| 655nm non-targeted quantum dots | Invitrogen | Q21021MP | ||
| Tetramathylrhodamine conjugated E. coli BioParticles |
Invitrogen | E2862 | ||
| Listeria monocytogenes (Lm) | Reference 2 | |||
| Quick gel | Duro | |||
| Puralube Vet Ointment | Pharmaderm Animal Health | |||
| Insulin syringes | BD | 08290-3284-38 | ||
| PBS | Thermo Scirntific | SH30256.02 |
References
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96, 719-726 (2000).
- Zinselmeyer, B. H., Lynch, J. N., Zhang, X., Aoshi, T., Miller, M. J. Video-rate two-photon imaging of mouse footpad – a promising model for studying leukocyte recruitment dynamics during inflammation. Inflamm Res. 57, 93-96 (2008).
- Zinselmeyer, B. H., Dempster, J., Wokosin, D. L., Cannon, J. J., Pless, R., Parker, I., Miller, M. J. Chapter 16. Two-photon microscopy and multidimensional analysis of cell dynamics. Methods Enzymol. 461, 349-378 (2009).
- Gray, D. F., Jennings, P. A. Allergy in experimental mouse tuberculosis. Am Rev Tuberc. 72, 171-195 (1955).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect Immun. 77, 5190-5201 (2009).
- Smith, C. J., Zhang, Y., Koboldt, C. M., Muhammad, J., Zweifel, B. S., Shaffer, A., Talley, J. J., Masferrer, J. L., Seibert, K., Isakson, P. C. Pharmacological analysis of cyclooxygenase-1 in inflammation. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13313-13318 (1998).
- Wipke, B. T., Allen, P. M. Essential role of neutrophils in the initiation and progression of a murine model of rheumatoid arthritis. J Immunol. 167, 1601-1608 (2001).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc Res. 5, 384-394 (1973).
- Mempel, T. R., Scimone, M. L., Mora, J. R., von Andrian, U. H. in vivo imaging of leukocyte trafficking in blood vessels and tissues. Curr Opin Immunol. 16, 406-417 (2004).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2604-2609 (2003).
