Efficiënte gen delivery in meerdere CNS Gebieden Het gebruik van In Utero Elektroporatie
Summary
In utero elektroporatie zorgt voor een snelle genafgifte in een ruimtelijk-temporeel en gecontroleerde wijze in de zich ontwikkelende centrale zenuwstelsel (CZS). Hier beschrijven we een groot aanpassingsvermogen in utero electroporatie protocol dat gebruikt kan worden om expressie constructen te leveren in meerdere embryonale CNS domeinen, waaronder de telencephalon, diencephalon en netvlies.
Abstract
De mogelijkheid om genexpressie te manipuleren is de hoeksteen van de moderne dag experimentele embryologie, die leidt tot de opheldering van verschillende ontwikkelingstrajecten. Een aantal krachtige en gevestigde transgene technologieën zijn beschikbaar om genexpressie niveaus in muizen te manipuleren, waardoor het genereren van zowel de verlies-en winst-of-function modellen. Echter, de generatie van transgene muis is zowel kostbaar en tijdrovend. Alternatieve methoden van genetische manipulatie zijn dan ook op grote schaal gezocht. In utero elektroporatie is een methode van de genetische levering in levende muis embryo's 1,2, dat we met succes hebben 3,4 aangepast. Het is grotendeels gebaseerd op het succes van de in-ovo elektroporatie technologieën die vaak worden gebruikt in de kuikens 5. In het kort, is DNA geïnjecteerd in de open ventrikels van de zich ontwikkelende hersenen en de toepassing van een elektrische stroom zorgt ervoor dat de vorming van tijdelijke poriën in celmembranen, waardoor de opname van DNA in de cel. In onze handen, kunnen embryo's efficiënt worden geëlektroporeerd zo vroeg embryonale dag (E) 11,5, terwijl de doelgerichtheid van de jongere embryo's zou een echo-geleide microinjectie protocol, zoals eerder beschreven zes vereisen. Omgekeerd, E15.5 is de nieuwste fase kunnen we gemakkelijk electroporate, te wijten aan het begin van de pariëtale en frontale bot-differentiatie, die micro-injectie belemmert in de hersenen. In tegenstelling, het netvlies is toegankelijk via het einde van de embryogenese. Embryo's kunnen worden verzameld op elk tijdstip gedurende de embryonale of vroege postnatale periode. Injectie van een reporter construct vergemakkelijkt de identificatie van de getransfecteerde cellen.
Tot op heden heeft in utero electroporatie het meest grote schaal gebruikt voor de analyse van de neocorticale ontwikkeling 1,2,3,4. Meer recente studies hebben gericht op de embryonale netvlies 7,8,9 en thalamus 10,11,12. Hier presenteren wij een gewijzigd in utero electroporatie protocol dat gemakkelijk kan worden aangepast aan de verschillende domeinen van de embryonale CNS doel. Wij leveren het bewijs dat door het gebruik van deze techniek kunnen we de embryonale telencephalon, diencephalon en netvlies doel. Representatieve resultaten worden gepresenteerd in de eerste tonen van het gebruik van deze techniek om DNA-expressie constructen te introduceren in de laterale ventrikels, waardoor we progenitor rijping, differentiatie en migratie monitor in de embryonale telencephalon. We tonen ook aan dat deze techniek kan worden gebruikt om DNA te richten op de diencephalic gebieden rond de 3 e ventrikel, waardoor de trekroutes van differentiëren neuronen in diencephalic kernen te worden gecontroleerd. Ten slotte hebben we laten zien dat het gebruik van micromanipulators stelt ons in staat om nauwkeurig DNA-constructen te introduceren in kleine doelgebieden, inclusief de subretinale ruimte, waardoor we de effecten van het manipuleren van genexpressie op het netvlies ontwikkeling te analyseren.
Protocol
Discussion
In utero elektroporatie kan gebruikt worden om een breed scala van ontwikkelingsprocessen te analyseren. Zo kan bijvoorbeeld transfectie van reporter genen zoals GFP, mCherry of alkalische fosfatase worden gebruikt om de lineage tracing en neuronale migratie experimenten uit te voeren. Als alternatief kan Cre-recombinase tijdelijk worden uitgedrukt om selectief te elimineren een floxed allel in een ruimtelijk-en / of tijdelijk-gecontroleerde manier. Bovendien kan shRNA of dominant negatieve constructies worden …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Eva Hadzimova, Pierre Mattar en Christopher Kovach bedanken voor hun eerste werk bij het vaststellen van in de baarmoeder elektroporatie technologie in de CS lab. Dit werk werd gefinancierd door een Canadese Institute of Health Research (CIHR) subsidie (MOP 44094) en CIHR / Stichting Fighting Blindness (FFB) Emerging Team Grant (00933-000) om CS en een Alberta Children's Hospital Research Foundation Grant naar DMK. RD werd ondersteund door een CIHR Canada Hope Scholarship, is RC ondersteund door een FFB studententijd en LML werd ondersteund door een CIHR Training Grant in Genetics and Child Development.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Category |
|---|---|---|---|
| Fine scissors | Fine Science Tools Inc. | 14078-10 | Surgical Tools |
| Iris scissors, curved | Fine Science Tools Inc. | 14061-10 | Surgical Tools |
| Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder | Fine Science Tools Inc. | 12002-12 | Surgical Tools |
| Ring forceps, 9mm | Fine Science Tools Inc. | 11103-09 | Surgical Tools |
| Eye dressing Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11051-10 | Surgical Tools |
| Dumont #7 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont #5 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11251-30 | Surgical Tools |
| Tissue forcep-Adson | Fine Science Tools Inc. | 11027-12 | Surgical Tools |
| Reflex Clip Applier | World Precision Instrument | 500343 | Surgical Tools |
| Perforated Spoon, 15 mm diameter | Fine Science Tools Inc. | 10370-18 | Surgical Tools |
| Autoclip Remover | Mikron | 427637 | Surgical Tools |
| Silk Black Braided Suture | Ethicon Inc. | K871 | Surgical Tools |
| Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips | World Precision Instruments | 500346 | Surgical Tools |
| ECM 830 Square Wave Electroporation System | VWR-CanLab | 58018-004 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P5 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P7 | Instruments |
| Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CA62111-488 | Instruments |
| Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CAACCESS (misc.) | Instruments |
| Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH | VWR CanLab | CA33995-534 CPN-952-118 | Instruments |
| Sutter P97 Micropipet Puller | Sutter Instrument, Carsen Group Inc. | P-97 | Instruments |
| Micropipettes – Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-78-10 | Instruments |
| 3-Axis Coarse Manipulator | Carl Zeiss Canada Inc. | M-152 | Instruments |
| Magnetic Holding Device for micromanipulator | World Precision Instruments | M1 | Instruments |
| Steel Base Plate for micromanipulator | World Precision Instruments | 5052 | Instruments |
| Micropipette Holder | World Precision Instruments | MPH3 | Instruments |
| Micropipette Handle | World Precision Instruments | 5444 | Instruments |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | Instruments |
| Vaporizer for isoflurane anesthetic | Porter Instruments Company | MODEL 100-F | Instruments |
| Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools | Metrex Research Corporation | 10-8100 | Surgical Reagents |
| Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing | Sigma Aldrich | G1264 | Surgical Reagents |
| Germex for sterilizing surgical tools | Vétoquinol | DIN# 00141569 | Surgical Reagents |
| BNP ophthalmic ointment | Vétoquinol | DIN# 00516414 | Surgical Reagents |
| Nair® | Distributed by Church & Dwight Co., Inc. | commercially available | Surgical Reagents |
| Stanhexidine 4% w/v skin cleaner | Omega Laboratories Inc. | 01938983 | Surgical Reagents |
| Buprenorphine (Temgesic) analgesic | Schering-Plough | 531-535 | Surgical Reagents |
| Sulpha “25” sulphamethazine oral antibiotic | Professional Veterinary Laboratories | DIN# 00308218 | Surgical Reagents |
| Lactated Ringer Solution | Baxter Corporation | DIN# 0061085 | Surgical Reagents |
| Saline – 0.9% sodium chloride | B-Braun Medical Inc. | DIN# 01924303 | Surgical Reagents |
| Inhalation Anesthetic – Isoflurane USP | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | DIN# 02237518 | Surgical Reagents |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Surgical Reagents |
References
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Langevin, L. M. Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236. , 1273-1286 (2007).
- Mattar, P. Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity. Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Vue, T. Y. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
- Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).
- Buffo, A. Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).
