Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación
Summary
En el útero de la electroporación permite la entrega rápida de genes en un espacio-temporal y controlado de manera en el desarrollo del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe una muy adaptable en el protocolo de electroporación in utero que puede ser utilizado para entregar las construcciones de expresión en múltiples dominios del SNC embrionario, incluyendo el telencéfalo, diencéfalo y la retina.
Abstract
La capacidad de manipular la expresión génica es la piedra angular de la moderna embriología experimental, lo que lleva al esclarecimiento de múltiples vías de desarrollo. Varias tecnologías transgénicas potente y bien establecidas están disponibles para manipular los niveles de expresión de genes en el ratón, lo que permite la generación de los modelos de la pérdida y ganancia de función. Sin embargo, la generación de ratones transgénicos resulta costoso y el tiempo. Métodos alternativos de la manipulación genética han sido ampliamente tratado por lo tanto. En el útero de la electroporación es un método de entrega de genes en ratones vivos 1,2 embriones que se han adaptado con éxito 3,4. Se basa principalmente en el éxito de las tecnologías de la electroporación in ovo que se utilizan comúnmente en chica 5. En pocas palabras, el ADN es inyectado en los ventrículos abierta del cerebro en desarrollo y la aplicación de una corriente eléctrica provoca la formación de poros transitorios en las membranas celulares, lo que permite la absorción de ADN en la célula. En nuestras manos, los embriones pueden ser eficientemente electroporated a partir del día embrionario (E) 11,5, mientras que la focalización de los embriones más jóvenes que requieren una guiada por ultrasonido protocolo microinyección, como se describió anteriormente 6. Por el contrario, E15.5 es la última etapa que puede electroporar, debido a la aparición de los parietales y la diferenciación de hueso frontal, lo que dificulta la microinyección en el cerebro. Por el contrario, la retina se puede acceder a través del final de la embriogénesis. Los embriones se pueden recoger en cualquier punto durante todo el período postnatal embrionario o temprano. La inyección de un reportero construir facilita la identificación de las células transfectadas.
Hasta la fecha, en la electroporación in utero ha sido más utilizado para el análisis del desarrollo neocortical 1,2,3,4. Los estudios más recientes se han centrado en el embrión de la retina y el tálamo 7,8,9 10,11,12. A continuación, presentamos una modificación en el protocolo de electroporación in utero que puede ser fácilmente adaptada a los diferentes dominios de destino del sistema nervioso central embrionario. Aportar pruebas de que mediante el uso de esta técnica, podemos apuntar el telencéfalo diencéfalo embrionario, y la retina. Los resultados representativos se presentan, en primer lugar que muestra el uso de esta técnica para introducir las construcciones de expresión de ADN en los ventrículos laterales, lo que nos permite controlar la maduración progenitor, diferenciación y migración en el telencéfalo embrionario. También muestran que esta técnica puede ser utilizada para combatir el ADN de los territorios que rodean el ventrículo diencefálico 3 º, lo que permite las rutas migratorias de diferenciar las neuronas en los núcleos diencefálicos a ser monitoreados. Por último, se muestra que el uso de micromanipuladores nos permite introducir con precisión construcciones de ADN en las áreas objetivo pequeño, como el espacio subretiniano, lo que nos permite analizar los efectos de la manipulación de la expresión de genes en el desarrollo de la retina.
Protocol
Discussion
En el útero de la electroporación se puede utilizar para analizar una amplia variedad de procesos de desarrollo. Por ejemplo, la transfección de genes reporteros, como las buenas prácticas agrarias, mCherry o fosfatasa alcalina puede ser utilizado para llevar a cabo el linaje de búsqueda y experimentos de migración neuronal. Por otra parte, la recombinasa Cre puede ser transitoriamente expresó que la eliminación selectiva de un alelo floxed en un espacio y / o de manera temporal controlada. Además, shR…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a Eva Hadzimova, Mattar Pierre y Kovach Christopher por su trabajo inicial en el establecimiento en la tecnología de electroporación in utero en el laboratorio de CS. Este trabajo fue financiado por el Instituto Canadiense de Investigación en Salud (CIHR) subvención (44.094 MOP) y CIHR / Fundación Fighting Blindness (FFB) Nuevas equipo de Grant (00933-000) a CS y el Hospital de Niños de Alberta una beca de la Fundación de Investigación de DMK. RD fue apoyado por una beca HOPE CIHR Canadá, RC se apoya en una Beca FFB y LML fue apoyado por una beca de formación CIHR en Genética y Desarrollo Infantil.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Category |
|---|---|---|---|
| Fine scissors | Fine Science Tools Inc. | 14078-10 | Surgical Tools |
| Iris scissors, curved | Fine Science Tools Inc. | 14061-10 | Surgical Tools |
| Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder | Fine Science Tools Inc. | 12002-12 | Surgical Tools |
| Ring forceps, 9mm | Fine Science Tools Inc. | 11103-09 | Surgical Tools |
| Eye dressing Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11051-10 | Surgical Tools |
| Dumont #7 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont #5 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11251-30 | Surgical Tools |
| Tissue forcep-Adson | Fine Science Tools Inc. | 11027-12 | Surgical Tools |
| Reflex Clip Applier | World Precision Instrument | 500343 | Surgical Tools |
| Perforated Spoon, 15 mm diameter | Fine Science Tools Inc. | 10370-18 | Surgical Tools |
| Autoclip Remover | Mikron | 427637 | Surgical Tools |
| Silk Black Braided Suture | Ethicon Inc. | K871 | Surgical Tools |
| Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips | World Precision Instruments | 500346 | Surgical Tools |
| ECM 830 Square Wave Electroporation System | VWR-CanLab | 58018-004 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P5 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P7 | Instruments |
| Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CA62111-488 | Instruments |
| Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CAACCESS (misc.) | Instruments |
| Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH | VWR CanLab | CA33995-534 CPN-952-118 | Instruments |
| Sutter P97 Micropipet Puller | Sutter Instrument, Carsen Group Inc. | P-97 | Instruments |
| Micropipettes – Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-78-10 | Instruments |
| 3-Axis Coarse Manipulator | Carl Zeiss Canada Inc. | M-152 | Instruments |
| Magnetic Holding Device for micromanipulator | World Precision Instruments | M1 | Instruments |
| Steel Base Plate for micromanipulator | World Precision Instruments | 5052 | Instruments |
| Micropipette Holder | World Precision Instruments | MPH3 | Instruments |
| Micropipette Handle | World Precision Instruments | 5444 | Instruments |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | Instruments |
| Vaporizer for isoflurane anesthetic | Porter Instruments Company | MODEL 100-F | Instruments |
| Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools | Metrex Research Corporation | 10-8100 | Surgical Reagents |
| Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing | Sigma Aldrich | G1264 | Surgical Reagents |
| Germex for sterilizing surgical tools | Vétoquinol | DIN# 00141569 | Surgical Reagents |
| BNP ophthalmic ointment | Vétoquinol | DIN# 00516414 | Surgical Reagents |
| Nair® | Distributed by Church & Dwight Co., Inc. | commercially available | Surgical Reagents |
| Stanhexidine 4% w/v skin cleaner | Omega Laboratories Inc. | 01938983 | Surgical Reagents |
| Buprenorphine (Temgesic) analgesic | Schering-Plough | 531-535 | Surgical Reagents |
| Sulpha “25” sulphamethazine oral antibiotic | Professional Veterinary Laboratories | DIN# 00308218 | Surgical Reagents |
| Lactated Ringer Solution | Baxter Corporation | DIN# 0061085 | Surgical Reagents |
| Saline – 0.9% sodium chloride | B-Braun Medical Inc. | DIN# 01924303 | Surgical Reagents |
| Inhalation Anesthetic – Isoflurane USP | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | DIN# 02237518 | Surgical Reagents |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Surgical Reagents |
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