ג'ין אספקה יעילה לתוך השטחים CNS מרובים באמצעות בתוך הרחם Electroporation
Summary
ב electroporation ברחם מאפשר למסירה גן מהירה באופן מרחבית, ובזמן שבשליטת במערכת לפתח את העצבים המרכזית (CNS). כאן אנו מתארים וישימה מאוד בפרוטוקול electroporation ברחם, שניתן להשתמש בהם כדי לספק בונה ביטוי עובריים לתוך מערכת העצבים המרכזית מספר תחומים, כולל diencephalon telencephalon, ואת הרשתית.
Abstract
היכולת לתפעל ביטוי גנים היא אבן הפינה של אמבריולוגיה מודרני יום הניסוי, מוביל להבהרת מסלולים התפתחותיים מרובים. מספר טכנולוגיות מהונדס עוצמה מבוססת היטב זמינים כדי לתפעל ביטוי גנים רמות עכבר, המאפשר לדור של אובדן ושניהם לזכות-of-פונקציה מודלים. אולם, את הדור של העכבר transgenics הוא גם יקר וגם גוזל זמן. שיטות חלופיות של מניפולציה גנטי ולכן כבר ביקשו נרחב. ברחם electroporation היא שיטה של משלוח הגן לתוך 1,2 העכבר עוברים לחיות כי יש לנו להתאים בהצלחה 3,4. היא מבוססת במידה רבה על ההצלחה של בטכנולוגיות electroporation אובו זה משמשים בדרך כלל חומוס 5. בקצרה, ה-DNA מוזרק לתוך החדרים הפתוחים של המוח המתפתח ואת היישום של זרם חשמלי גורם להיווצרות נקבוביות חולף בתוך קרום התא, דבר שמאפשר את ספיגת של דנ"א לתוך התא. בידיים שלנו, עוברים ניתן electroporated ביעילות כבר ביום עובריים (E) 11.5, בעוד המיקוד של עוברים צעירים ידרוש אולטרסאונד מונחה פרוטוקול microinjection, כפי שתואר לעיל 6. לעומת זאת, E15.5 הוא השלב האחרון אנחנו יכולים בקלות electroporate, עקב תחילת הקודקודית והבחנה העצם הפרונטלית, אשר פוגעת microinjection לתוך המוח. לעומת זאת, הרשתית נגיש עד סוף embryogenesis. עוברים ניתן לאסוף בכל נקודת זמן במהלך התקופה העוברית או אחרי לידה מוקדמת. הזרקת לבנות כתב מקלה על הזיהוי של תאים transfected.
עד כה, ב electroporation ברחם כבר בשימוש נרחב ביותר לניתוח ופיתוח neocortical 1,2,3,4. מחקרים מאוחרים יותר ממוקדים על הרשתית 7,8,9 עובריים התלמוס 10,11,12. כאן, אנו מציגים שונה בפרוטוקול electroporation ברחם כי ניתן להתאים בקלות למקד תחומים שונים של מערכת העצבים העוברית. אנו מספקים ראיות לכך על ידי שימוש בטכניקה זו, אנחנו יכולים למקד את telencephalon עובריים, diencephalon ואת הרשתית. תוצאות נציג מוצגים, הראשון מראה את השימוש בטכניקה זו כדי להציג את בונה ביטוי ה-DNA לתוך החדרים לרוחב, מה שמאפשר לנו לעקוב אחר ההבשלה אבי, בידול הגירה telencephalon העוברית. כמו כן, אנו מראים כי טכניקה זו יכולה לשמש יעד DNA לשטחים diencephalic סביב החדר 3 rd, המאפשר את נתיבי הנדידה של הבחנה נוירונים לתוך הגרעינים diencephalic להיות במעקב. לבסוף, אנו מראים כי השימוש micromanipulators מאפשר לנו להציג במדויק את ה-DNA בונה לאזורים יעד קטן, כולל שטח subretinal, ומאפשר לנו לנתח את ההשפעות של מניפולציות ביטוי גנים על התפתחות הרשתית.
Protocol
Discussion
ברחם electroporation ניתן להשתמש כדי לנתח מגוון רחב של תהליכים התפתחותיים. לדוגמה, transfection של גנים הכתב כגון GFP, mCherry או phosphatase אלקליין ניתן להשתמש כדי לנהל מעקב אחר השושלת וניסויים נדידת נוירונים. לחלופין, Cre recombinase ניתן לבטא transiently סלקטיבי לחסל אלל floxed ב מרחבית, ו / או temporall…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות אווה Hadzimova, פייר Mattar וכריסטופר Kovach לעבודה הראשונית בהקמת בטכנולוגיה electroporation ברחם במעבדה CS. עבודה זו מומנה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) מענק (MOP 44,094) ו CIHR / קרן עיוורון לחימה (FFB) מתעוררים צוות גרנט (00933-000) ל CS החולים לילדים של אלברטה Research Foundation מענק DMK. RD נתמכה על ידי מלגה התקווה CIHR קנדה, RC נתמך על ידי מלגת הלימודים FFB ו LML נתמך על ידי מענק הדרכה CIHR בגנטיקה והתפתחות הילד.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Category |
|---|---|---|---|
| Fine scissors | Fine Science Tools Inc. | 14078-10 | Surgical Tools |
| Iris scissors, curved | Fine Science Tools Inc. | 14061-10 | Surgical Tools |
| Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder | Fine Science Tools Inc. | 12002-12 | Surgical Tools |
| Ring forceps, 9mm | Fine Science Tools Inc. | 11103-09 | Surgical Tools |
| Eye dressing Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11051-10 | Surgical Tools |
| Dumont #7 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont #5 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11251-30 | Surgical Tools |
| Tissue forcep-Adson | Fine Science Tools Inc. | 11027-12 | Surgical Tools |
| Reflex Clip Applier | World Precision Instrument | 500343 | Surgical Tools |
| Perforated Spoon, 15 mm diameter | Fine Science Tools Inc. | 10370-18 | Surgical Tools |
| Autoclip Remover | Mikron | 427637 | Surgical Tools |
| Silk Black Braided Suture | Ethicon Inc. | K871 | Surgical Tools |
| Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips | World Precision Instruments | 500346 | Surgical Tools |
| ECM 830 Square Wave Electroporation System | VWR-CanLab | 58018-004 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P5 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P7 | Instruments |
| Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CA62111-488 | Instruments |
| Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CAACCESS (misc.) | Instruments |
| Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH | VWR CanLab | CA33995-534 CPN-952-118 | Instruments |
| Sutter P97 Micropipet Puller | Sutter Instrument, Carsen Group Inc. | P-97 | Instruments |
| Micropipettes – Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-78-10 | Instruments |
| 3-Axis Coarse Manipulator | Carl Zeiss Canada Inc. | M-152 | Instruments |
| Magnetic Holding Device for micromanipulator | World Precision Instruments | M1 | Instruments |
| Steel Base Plate for micromanipulator | World Precision Instruments | 5052 | Instruments |
| Micropipette Holder | World Precision Instruments | MPH3 | Instruments |
| Micropipette Handle | World Precision Instruments | 5444 | Instruments |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | Instruments |
| Vaporizer for isoflurane anesthetic | Porter Instruments Company | MODEL 100-F | Instruments |
| Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools | Metrex Research Corporation | 10-8100 | Surgical Reagents |
| Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing | Sigma Aldrich | G1264 | Surgical Reagents |
| Germex for sterilizing surgical tools | Vétoquinol | DIN# 00141569 | Surgical Reagents |
| BNP ophthalmic ointment | Vétoquinol | DIN# 00516414 | Surgical Reagents |
| Nair® | Distributed by Church & Dwight Co., Inc. | commercially available | Surgical Reagents |
| Stanhexidine 4% w/v skin cleaner | Omega Laboratories Inc. | 01938983 | Surgical Reagents |
| Buprenorphine (Temgesic) analgesic | Schering-Plough | 531-535 | Surgical Reagents |
| Sulpha “25” sulphamethazine oral antibiotic | Professional Veterinary Laboratories | DIN# 00308218 | Surgical Reagents |
| Lactated Ringer Solution | Baxter Corporation | DIN# 0061085 | Surgical Reagents |
| Saline – 0.9% sodium chloride | B-Braun Medical Inc. | DIN# 01924303 | Surgical Reagents |
| Inhalation Anesthetic – Isoflurane USP | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | DIN# 02237518 | Surgical Reagents |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Surgical Reagents |
References
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240, 237-246 (2001).
- Takahashi, M., Sato, K., Nomura, T., Osumi, N. Manipulating gene expressions by electroporation in the developing brain of mammalian embryos. Differentiation. 70, 155-162 (2002).
- Langevin, L. M. Validating in utero electroporation for the rapid analysis of gene regulatory elements in the murine telencephalon. Dev Dyn 236. , 1273-1286 (2007).
- Mattar, P. Basic helix-loop-helix transcription factors cooperate to specify a cortical projection neuron identity. Mol Cell Biol. 28, 1456-1469 (2008).
- Nakamura, H., Katahira, T., Sato, T., Watanabe, Y., Funahashi, J. Gain- and loss-of-function in chick embryos by electroporation. Mech Dev. 121, 1137-1143 (2004).
- Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system. Nat Neurosci. 2, 812-819 (1999).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16-22 (2004).
- Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. In utero and ex vivo electroporation for gene expression in mouse retinal ganglion cells. J Vis Exp. , (2009).
- Garcia-Frigola, C., Carreres, M. I., Vegar, C., Herrera, E. Gene delivery into mouse retinal ganglion cells by in utero electroporation. BMC Dev Biol. 7, 103-103 (2007).
- Kataoka, A., Shimogori, T. Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus. Development. 135, 2873-2881 (2008).
- Vue, T. Y. Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice. J Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).
- Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections. J Neurosci Res. 87, 1620-1633 (2009).
- Buffo, A. Expression pattern of the transcription factor Olig2 in response to brain injuries: implications for neuronal repair. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 18183-18188 (2005).
