使用した複数のCNS準州への効率的な遺伝子送達子宮内でエレクトロポレーション
Summary
子宮内エレクトロポレーションでは発達中の中枢神経系（CNS）における空間的および時間的に制御された方法で迅速な遺伝子デリバリーを可能にする。ここでは、終脳、間脳や網膜など、複数の胚中枢神経系領域、中に発現構築物を提供するために使用することができる子宮内エレクトロポレーションプロトコルにおける適応性の高いを説明します。
Abstract
遺伝子発現を操作する機能は、複数の発達経路の解明につながる、現代の実験発生学の基礎となるものです。いくつかの強力で定評のトランスジェニック技術の喪失と機能獲得型モデルの両方の生成を可能にする、マウスの遺伝子発現レベルを操作するために用意されています。しかし、マウス遺伝子組換えの世代は、コストと時間がかかるものです。遺伝子操作の代替の方法では、広く求められている。 子宮内エレクトロポレーションで、我々は正常に3,4を適応しているライブのマウス胚の1,2への遺伝子送達の方法です。それは、主に一般的にニワトリ5で使用されているOVOエレクトロポレーション技術での成功に基づいています。簡単に言えば、DNAは細胞へのDNAの取り込みを可能にする、脳の発達と電流の原因は細胞膜に一時的な細孔の形成のアプリケーションのオープン脳室に注入されます。若い胚のターゲティングは、超音波ガイド下マイクロインジェクションのプロトコル、前述の6に説明を必要としながら私たちの手では、胚を効率的に、胎生（E）11.5早くも電気穿孔することができます。逆に、E15.5は、脳へのマイクロインジェクションを妨げる頭頂と前頭骨分化の開始、のために我々が簡単にエレクトロできる最新の舞台です。対照的に、網膜は胚発生の終わりを介してアクセス可能です。胚は、胚や初期の産後の全期間を通して、いつの時点で収集することができます。レポーターコンストラクトの注入は、トランスフェクトされた細胞の同定を容易にする。
日付に、子宮内エレクトロポレーションで最も広く新皮質の発達1,2,3,4の分析に使用されています。最近の研究では、胚性網膜7,8,9と視床10,11,12を標的にしている。ここで、我々は簡単胚中枢神経系の別のドメインをターゲットに適応させることができる子宮内エレクトロポレーションプロトコルに変更を提示。我々は、このテクニックを使用することによって、我々は胚の終脳、間脳や網膜をターゲットにできるという証拠を提供する。代表的な結果は、私たちは胚の終脳の前駆細胞の成熟、分化と移行を監視することが、最初の側脳室へのDNAの発現コンストラクトを導入するためにこのテクニックの使用を示す、表示されます。我々はまた、この技術は間脳核に神経細胞を分化回遊経路をモニタすることで、第3脳室周囲の間脳の領域にDNAをターゲットとするために使用することができることを示している。最後に、我々は、マイクロマニピュレータの使用は私たちが網膜の開発に遺伝子発現を操作するの効果を分析できるように、網膜下腔を含め、私たちは正確に小さなターゲットの領域にDNA構築物を導入することができることを示している。
Protocol
Discussion
子宮内エレクトロポレーションは、発生過程の様々な分析に使用することができます。例えば、このようなGFP、mCherryまたはアルカリホスファターゼなどのレポーター遺伝子のトランスフェクションは、系統のトレースとニューロン移動の実験を行うために使用することができます。また、Creリコンビナーゼは、一時的に選択的に空間的および/または時間的に制御された方法でfloxed対?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、CS研究室で子宮内エレクトロポレーション技術の確立に彼らの初期の仕事のためにエヴァHadzimova、ピエールMattarとクリストファーコバックに感謝します。この作品は、カナダ保健研究所（CIHR）助成金（MOP 44094）とDMKにCSとアルバータ州の小児病院研究財団助成するチームグラント（00933から000を）新興CIHR /財団ファイティング失明（FFB）によって賄われていた。 RDがCIHRカナダホープ奨学金によってサポートされていた、RCは、FFBの学生の身分によってサポートされており、LMLは、遺伝学のCIHRトレーニンググラントと子どもの発達によってサポートされていました。
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Category |
|---|---|---|---|
| Fine scissors | Fine Science Tools Inc. | 14078-10 | Surgical Tools |
| Iris scissors, curved | Fine Science Tools Inc. | 14061-10 | Surgical Tools |
| Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder | Fine Science Tools Inc. | 12002-12 | Surgical Tools |
| Ring forceps, 9mm | Fine Science Tools Inc. | 11103-09 | Surgical Tools |
| Eye dressing Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11051-10 | Surgical Tools |
| Dumont #7 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont #5 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11251-30 | Surgical Tools |
| Tissue forcep-Adson | Fine Science Tools Inc. | 11027-12 | Surgical Tools |
| Reflex Clip Applier | World Precision Instrument | 500343 | Surgical Tools |
| Perforated Spoon, 15 mm diameter | Fine Science Tools Inc. | 10370-18 | Surgical Tools |
| Autoclip Remover | Mikron | 427637 | Surgical Tools |
| Silk Black Braided Suture | Ethicon Inc. | K871 | Surgical Tools |
| Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips | World Precision Instruments | 500346 | Surgical Tools |
| ECM 830 Square Wave Electroporation System | VWR-CanLab | 58018-004 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P5 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P7 | Instruments |
| Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CA62111-488 | Instruments |
| Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CAACCESS (misc.) | Instruments |
| Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH | VWR CanLab | CA33995-534 CPN-952-118 | Instruments |
| Sutter P97 Micropipet Puller | Sutter Instrument, Carsen Group Inc. | P-97 | Instruments |
| Micropipettes – Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-78-10 | Instruments |
| 3-Axis Coarse Manipulator | Carl Zeiss Canada Inc. | M-152 | Instruments |
| Magnetic Holding Device for micromanipulator | World Precision Instruments | M1 | Instruments |
| Steel Base Plate for micromanipulator | World Precision Instruments | 5052 | Instruments |
| Micropipette Holder | World Precision Instruments | MPH3 | Instruments |
| Micropipette Handle | World Precision Instruments | 5444 | Instruments |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | Instruments |
| Vaporizer for isoflurane anesthetic | Porter Instruments Company | MODEL 100-F | Instruments |
| Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools | Metrex Research Corporation | 10-8100 | Surgical Reagents |
| Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing | Sigma Aldrich | G1264 | Surgical Reagents |
| Germex for sterilizing surgical tools | Vétoquinol | DIN# 00141569 | Surgical Reagents |
| BNP ophthalmic ointment | Vétoquinol | DIN# 00516414 | Surgical Reagents |
| Nair® | Distributed by Church & Dwight Co., Inc. | commercially available | Surgical Reagents |
| Stanhexidine 4% w/v skin cleaner | Omega Laboratories Inc. | 01938983 | Surgical Reagents |
| Buprenorphine (Temgesic) analgesic | Schering-Plough | 531-535 | Surgical Reagents |
| Sulpha “25” sulphamethazine oral antibiotic | Professional Veterinary Laboratories | DIN# 00308218 | Surgical Reagents |
| Lactated Ringer Solution | Baxter Corporation | DIN# 0061085 | Surgical Reagents |
| Saline – 0.9% sodium chloride | B-Braun Medical Inc. | DIN# 01924303 | Surgical Reagents |
| Inhalation Anesthetic – Isoflurane USP | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | DIN# 02237518 | Surgical Reagents |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Surgical Reagents |
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