Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation
Summary
In utero Elektroporation ermöglicht eine schnelle Gentransfer in eine räumlich-und zeitlich kontrollierten Art und Weise in den Entwicklungsländern das zentrale Nervensystem (ZNS). Hier beschreiben wir eine sehr anpassungsfähig in utero Elektroporation Protokoll, mit dem Ausdruck Konstrukte in mehreren embryonalen ZNS-Domänen, einschließlich der Telencephalon, Diencephalon und der Netzhaut liefern können.
Abstract
Die Fähigkeit, die Genexpression zu manipulieren ist der Grundstein der modernen experimentellen Embryologie, was zur Aufklärung von mehreren Entwicklungspfaden. Verschiedene leistungsfähige und gut etablierten transgenen Technologien zur Verfügung, um Genexpression in der Maus zu manipulieren, so dass für die Erzeugung sowohl Verlust-und Gain-of-function-Modelle. Allerdings ist die Erzeugung von Maus Transgenik sowohl kosten-und zeitaufwendig. Alternative Methoden der Gen-Manipulation wurden daher häufig gesucht. In utero Elektroporation eine Methode der Gentransfer in die Live-Maus-Embryonen 1,2, dass es uns gelungen, 3,4 angepasst ist. Er basiert weitgehend auf den Erfolg der in ovo Elektroporation Technologien, die häufig in Küken 5 zum Einsatz kommen. Kurz gesagt, ist die DNA in die offenen Kammern des sich entwickelnden Gehirns und die Anwendung eines elektrischen Stromes bewirkt die Bildung von transienten Poren in Zellmembranen injiziert, so dass für die Aufnahme von DNA in die Zelle. In unseren Händen, können Embryonen effizient so früh wie embryonale Tag (E) 11,5 elektroporiert werden, während die Ausrichtung der jüngeren Embryonen eine Ultraschall-geführte Mikroinjektion Protokoll, wie zuvor 6 beschrieben erfordern würde. Umgekehrt ist E15.5 dem neuesten Stand wir leicht elektroporieren kann, aufgrund der Beginn der parietalen und frontalen Knochen Differenzierung, die Mikroinjektion behindert in das Gehirn. Im Gegensatz dazu ist die Netzhaut zugänglich über das Ende der Embryogenese. Embryonen können zu jedem Zeitpunkt während der embryonalen oder frühen postnatalen Phase gesammelt werden. Die Injektion eines Reporter-Konstrukt ermöglicht die Identifizierung von transfizierten Zellen.
Bis heute hat in utero Elektroporation wurde am häufigsten für die Analyse der Neokortex Entwicklung 1,2,3,4 verwendet. Neuere Studien haben die embryonalen Netzhaut 7,8,9 und Thalamus 10,11,12 ausgerichtet. Hier präsentieren wir eine in utero Elektroporation Protokoll, das leicht angepasst werden kann, um verschiedene Bereiche des embryonalen ZNS Ziel geändert. Wir beweisen, dass mit Hilfe dieser Technik können wir die embryonalen Telencephalon, Diencephalon und Netzhaut Ziel. Repräsentative Ergebnisse vorgestellt werden, erste, welche die Anwendung dieser Technik, um DNA-Expressionskonstrukte in den Seitenventrikel eingeführt, so dass wir Vorläuferzellen Reifung, Differenzierung und Migration in der embryonalen Telencephalon überwachen. Wir zeigen auch, dass diese Technik verwendet werden, um DNA, die Zwischenhirn Gebiete rund um den 3. Ventrikel Ziel sein, so dass die Flugrouten der differenzierenden Neuronen in Zwischenhirn Kerne überwacht werden. Schließlich zeigen wir, dass die Verwendung von Mikromanipulatoren uns genau vorstellen DNA-Konstrukte in kleine Zielgebiete, einschließlich der subretinalen Raum ermöglicht, so dass wir den Einfluss der Manipulation der Genexpression auf der Netzhaut Entwicklung zu analysieren.
Protocol
Discussion
In utero Elektroporation kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Entwicklungs-Prozesse analysiert werden. Zum Beispiel kann die Transfektion von Reportergen wie GFP, mCherry oder alkalische Phosphatase verwendet werden, um Abstammung Tracing und neuronalen Migration Experimente durchzuführen. Alternativ kann die Rekombinase Cre transient exprimiert werden, um selektiv beseitigen eine floxed Allel in einem räumlich-und / oder zeitlich gesteuert. Darüber hinaus können shRNA oder dominant negative Konstruk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten sich bei Eva Hadzimova, Pierre Mattar und Christopher Kovach für ihre ersten Arbeit danken in Gründung in utero Elektroporation Technologie in der CS-Labor. Diese Arbeit wurde von einem kanadischen Institute of Health Research (CIHR) zu gewähren (MOP 44094) und CIHR / Foundation Fighting Blindness (FFB) Emerging-Team Grant (00933-000) zur CS und Alberta Kinderkrankenhaus Research Foundation Grant DMK finanziert. RD von einem CIHR Kanada Hoffnung Stipendium unterstützt wurde, ist RC durch einen FFB Studentship unterstützt und LML wurde von einem CIHR Training Grant in der Genetik und Entwicklung des Kindes unterstützt.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Category |
|---|---|---|---|
| Fine scissors | Fine Science Tools Inc. | 14078-10 | Surgical Tools |
| Iris scissors, curved | Fine Science Tools Inc. | 14061-10 | Surgical Tools |
| Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder | Fine Science Tools Inc. | 12002-12 | Surgical Tools |
| Ring forceps, 9mm | Fine Science Tools Inc. | 11103-09 | Surgical Tools |
| Eye dressing Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11051-10 | Surgical Tools |
| Dumont #7 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont #5 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11251-30 | Surgical Tools |
| Tissue forcep-Adson | Fine Science Tools Inc. | 11027-12 | Surgical Tools |
| Reflex Clip Applier | World Precision Instrument | 500343 | Surgical Tools |
| Perforated Spoon, 15 mm diameter | Fine Science Tools Inc. | 10370-18 | Surgical Tools |
| Autoclip Remover | Mikron | 427637 | Surgical Tools |
| Silk Black Braided Suture | Ethicon Inc. | K871 | Surgical Tools |
| Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips | World Precision Instruments | 500346 | Surgical Tools |
| ECM 830 Square Wave Electroporation System | VWR-CanLab | 58018-004 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P5 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P7 | Instruments |
| Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CA62111-488 | Instruments |
| Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CAACCESS (misc.) | Instruments |
| Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH | VWR CanLab | CA33995-534 CPN-952-118 | Instruments |
| Sutter P97 Micropipet Puller | Sutter Instrument, Carsen Group Inc. | P-97 | Instruments |
| Micropipettes – Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-78-10 | Instruments |
| 3-Axis Coarse Manipulator | Carl Zeiss Canada Inc. | M-152 | Instruments |
| Magnetic Holding Device for micromanipulator | World Precision Instruments | M1 | Instruments |
| Steel Base Plate for micromanipulator | World Precision Instruments | 5052 | Instruments |
| Micropipette Holder | World Precision Instruments | MPH3 | Instruments |
| Micropipette Handle | World Precision Instruments | 5444 | Instruments |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | Instruments |
| Vaporizer for isoflurane anesthetic | Porter Instruments Company | MODEL 100-F | Instruments |
| Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools | Metrex Research Corporation | 10-8100 | Surgical Reagents |
| Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing | Sigma Aldrich | G1264 | Surgical Reagents |
| Germex for sterilizing surgical tools | Vétoquinol | DIN# 00141569 | Surgical Reagents |
| BNP ophthalmic ointment | Vétoquinol | DIN# 00516414 | Surgical Reagents |
| Nair® | Distributed by Church & Dwight Co., Inc. | commercially available | Surgical Reagents |
| Stanhexidine 4% w/v skin cleaner | Omega Laboratories Inc. | 01938983 | Surgical Reagents |
| Buprenorphine (Temgesic) analgesic | Schering-Plough | 531-535 | Surgical Reagents |
| Sulpha “25” sulphamethazine oral antibiotic | Professional Veterinary Laboratories | DIN# 00308218 | Surgical Reagents |
| Lactated Ringer Solution | Baxter Corporation | DIN# 0061085 | Surgical Reagents |
| Saline – 0.9% sodium chloride | B-Braun Medical Inc. | DIN# 01924303 | Surgical Reagents |
| Inhalation Anesthetic – Isoflurane USP | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | DIN# 02237518 | Surgical Reagents |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Surgical Reagents |
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