Livraison efficace de gènes dans les Territoires du SNC multiples à l'aide In Utero L'électroporation
Summary
Électroporation in utero permet la livraison rapide dans un gène spatialement et temporellement contrôlée manière le développement du système nerveux central (SNC). Nous décrivons ici un très adaptables dans le protocole d'électroporation in utero qui peut être utilisé pour livrer des constructions d'expression dans de multiples domaines du SNC embryonnaire, y compris le télencéphale, diencéphale et la rétine.
Abstract
La capacité de manipuler l'expression des gènes est la pierre angulaire de la journée embryologie moderne expérimentale, ce qui conduit à l'élucidation des multiples voies de développement. Plusieurs puissants et bien établis technologies transgéniques sont disponibles pour manipuler les niveaux de l'expression des gènes chez la souris, permettant la génération des deux perte et le gain de fonction des modèles. Cependant, la génération de souris transgéniques est à la fois coûteux et fastidieux. D'autres méthodes de manipulation génétique ont donc été largement sollicités. In utero électroporation est une méthode de transfert de gènes dans les embryons de souris 1,2 que nous avons réussi à adapter 3,4 vivre. Il est largement basé sur le succès de l'électroporation in ovo dans les technologies qui sont couramment utilisés dans chiches 5. Brièvement, l'ADN est injecté dans les ventricules du cerveau ouverte développement et l'application d'un courant électrique provoque la formation de pores transitoires dans les membranes cellulaires, permettant l'absorption de l'ADN dans la cellule. Dans nos mains, les embryons peuvent être efficacement électroporées dès le jour embryonnaire (E) 11,5, tandis que le ciblage des jeunes embryons exigerait une guidée par échographie protocole de micro-injection, comme décrit précédemment 6. Inversement, E15.5 est la dernière étape, nous pouvons facilement électroporation, en raison de l'apparition de la pariétale et la différenciation des os frontal, ce qui entrave la microinjection dans le cerveau. En revanche, la rétine est accessible par la fin de l'embryogenèse. Les embryons peuvent être recueillies à aucun moment pendant toute la période embryonnaire ou postnatale précoce. L'injection d'un journaliste de la construction facilite l'identification des cellules transfectées.
À ce jour, électroporation in utero a été plus largement utilisé pour l'analyse du développement du néocortex 1,2,3,4. Des études plus récentes ont ciblé la rétine et le thalamus embryonnaire 7,8,9 10,11,12. Ici, nous présentons une modification dans le protocole d'électroporation in utero qui peut être facilement adaptée pour cibler les différents domaines du système nerveux central embryonnaire. Nous fournir la preuve que en utilisant cette technique, nous pouvons cibler le télencéphale embryonnaire, diencéphale et la rétine. Les résultats représentatifs sont présentés, montrant d'abord l'utilisation de cette technique pour introduire des constructions d'expression d'ADN dans les ventricules latéraux, nous permettant de suivre la maturation progénitrices, la différenciation et la migration dans le télencéphale embryonnaire. Nous montrons également que cette technique peut être utilisée pour cibler l'ADN dans les territoires environnants diencéphalique le ventricule 3 ème, permettant les routes migratoires de différencier les neurones en noyaux diencéphalique à surveiller. Enfin, nous montrons que l'utilisation de micromanipulateurs nous permet d'introduire précisément constructions d'ADN dans les zones cibles légères, y compris l'espace sous-rétinien, nous permettant d'analyser les effets de la manipulation de l'expression des gènes sur le développement de la rétine.
Protocol
Discussion
In utero électroporation peut être utilisée pour analyser une grande variété de processus de développement. Par exemple, la transfection de gènes rapporteurs tels que la GFP, mCherry ou la phosphatase alcaline peut être utilisé pour effectuer le traçage et la lignée des expériences de la migration neuronale. Alternativement, la recombinase Cre peut être transitoirement exprimé d'éliminer sélectivement un allèle floxés dans un espace et / ou temporellement contrôlée manière. Par ailleurs…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Eva Hadzimova, Pierre Mattar et Christopher Kovach pour leur travail initial dans l'établissement en matière de technologie d'électroporation in utero dans le laboratoire de CS. Ce travail a été financé par un Institut canadien de recherche en santé du Canada (IRSC) subvention (44 094 MOP) et Fighting Blindness IRSC / Fondation (FFB) Subvention d'équipe émergente (00933-000) pour CS et une enfance de l'Alberta Hospital Research Foundation Grant à DMK. RD a été soutenue par une bourse des IRSC Hope Canada, RC est soutenu par une bourse d'études FFB et LML a été soutenu par une subvention de formation des IRSC en génétique et développement de l'enfant.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Category |
|---|---|---|---|
| Fine scissors | Fine Science Tools Inc. | 14078-10 | Surgical Tools |
| Iris scissors, curved | Fine Science Tools Inc. | 14061-10 | Surgical Tools |
| Olsen-Hegar Ex-Delicate Needle Holder | Fine Science Tools Inc. | 12002-12 | Surgical Tools |
| Ring forceps, 9mm | Fine Science Tools Inc. | 11103-09 | Surgical Tools |
| Eye dressing Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11051-10 | Surgical Tools |
| Dumont #7 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11271-30 | Surgical Tools |
| Dumont #5 DMX Forcep | Fine Science Tools Inc. | 11251-30 | Surgical Tools |
| Tissue forcep-Adson | Fine Science Tools Inc. | 11027-12 | Surgical Tools |
| Reflex Clip Applier | World Precision Instrument | 500343 | Surgical Tools |
| Perforated Spoon, 15 mm diameter | Fine Science Tools Inc. | 10370-18 | Surgical Tools |
| Autoclip Remover | Mikron | 427637 | Surgical Tools |
| Silk Black Braided Suture | Ethicon Inc. | K871 | Surgical Tools |
| Reflex Skin Closure Stainless Steel Wound Clips | World Precision Instruments | 500346 | Surgical Tools |
| ECM 830 Square Wave Electroporation System | VWR-CanLab | 58018-004 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 5mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P5 | Instruments |
| Tweezers w/Variable Gap 2 Round 7mm Platinum Plate Electrode | Protech International Inc. | CUY650P7 | Instruments |
| Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CA62111-488 | Instruments |
| Foot Control for Eppendorf Femtojet Microinjector | VWR CanLab | CAACCESS (misc.) | Instruments |
| Bransonic Ultrasonic Cleaner Model 1510R-DTH | VWR CanLab | CA33995-534 CPN-952-118 | Instruments |
| Sutter P97 Micropipet Puller | Sutter Instrument, Carsen Group Inc. | P-97 | Instruments |
| Micropipettes – Borosilicate with filament O.D.: 1mm, I.D.: 0.78 mm, 10 cm length | Sutter Instrument | BF100-78-10 | Instruments |
| 3-Axis Coarse Manipulator | Carl Zeiss Canada Inc. | M-152 | Instruments |
| Magnetic Holding Device for micromanipulator | World Precision Instruments | M1 | Instruments |
| Steel Base Plate for micromanipulator | World Precision Instruments | 5052 | Instruments |
| Micropipette Holder | World Precision Instruments | MPH3 | Instruments |
| Micropipette Handle | World Precision Instruments | 5444 | Instruments |
| Stereomicroscope | Leica | MZ6 | Instruments |
| Vaporizer for isoflurane anesthetic | Porter Instruments Company | MODEL 100-F | Instruments |
| Metriclean2 Low foaming solution for sonicating surgical tools | Metrex Research Corporation | 10-8100 | Surgical Reagents |
| Gentamicin 40mg/ml in 0.2 g methylene blue antibiotic spray after suturing | Sigma Aldrich | G1264 | Surgical Reagents |
| Germex for sterilizing surgical tools | Vétoquinol | DIN# 00141569 | Surgical Reagents |
| BNP ophthalmic ointment | Vétoquinol | DIN# 00516414 | Surgical Reagents |
| Nair® | Distributed by Church & Dwight Co., Inc. | commercially available | Surgical Reagents |
| Stanhexidine 4% w/v skin cleaner | Omega Laboratories Inc. | 01938983 | Surgical Reagents |
| Buprenorphine (Temgesic) analgesic | Schering-Plough | 531-535 | Surgical Reagents |
| Sulpha “25” sulphamethazine oral antibiotic | Professional Veterinary Laboratories | DIN# 00308218 | Surgical Reagents |
| Lactated Ringer Solution | Baxter Corporation | DIN# 0061085 | Surgical Reagents |
| Saline – 0.9% sodium chloride | B-Braun Medical Inc. | DIN# 01924303 | Surgical Reagents |
| Inhalation Anesthetic – Isoflurane USP | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | DIN# 02237518 | Surgical Reagents |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | Surgical Reagents |
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