Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Culturing ויישומים של סיבוב bioreactor וול כלי נגזר מודלים 3D תא אפיתל

Published: April 3, 2012 doi: 10.3791/3868
Automatic Translation
1, 1
1Basic Medical Sciences, University of Arizona College of Medicine - Phoenix

Summary

תרבות מסתובב בתא מערכת המאפשר לתאי האפיתל לצמוח בתנאים פיסיולוגיים וכתוצאה מכך היווצרות 3 D-המצרפי הסלולרי המתואר. מצרפים את התצוגה באופן

Abstract

תאים ורקמות של הגוף את הניסיון תנאים סביבתיים המשפיעים על הארכיטקטורה שלהם, תקשורת אינטר, פונקציות הכוללות. עבור בתרבות מודלים חוץ גופית סלולריים לחקות במדויק את הרקמה של עניין, את הסביבה הצמיחה של התרבות היא היבט חשוב לשקול. נפוץ קונבנציונאלי תרבות להפיץ מערכות תא מתאי אפיתל שטוחים על משטחים בלתי חדירים דו מימדי (2-D). למרות שדברים רבים נלמדו ממערכות התרבות תאים רגילים, ממצאים רבים אינם לשחזור ניסויים קליניים בבני אדם או explants רקמות, פוטנציאל כתוצאה מחוסר microenvironment רלוונטי מבחינה פיזיולוגית.

כאן אנו מתארים מערכת תרבות מתגבר רבים של מצב גבולות התרבות של 2-D בתרביות תאים, באמצעות כלי חדשני מסתובב הקיר (RWV) טכנולוגיה bioreactor. אנחנו ואחרים הראו כי organotypic RWV הנגזרות מודלים יכול לסכם structur, פונקציה E, תגובות אנושי אמיתי לגירויים חיצוניים דומה לרקמות explant אדם 1-6. Bioreactor RWV היא תרבות ההשעיה מערכת המאפשרת צמיחה של תאים אפיתל תחת תנאים גזירה נמוכים פיסיולוגיות נוזל. Bioreactors מגיעים בשני פורמטים שונים, כלי גבוהה היבט מסתובב (הארוו) או כלי שיט איטי מפנה לרוחב (STLV), שבו הם נבדלים זה מזה על ידי מקור אוורור שלהם. בתאי אפיתל מתווספים bioreactor הבחירה בשילוב עם נקבוביים, קולגן מצופים חרוזים microcarrier (איור 1 א). התאים לנצל את החרוזים כמו צמיחה פיגום בסתיו חינם קבוע bioreactor (1B איור). Microenvironment מסופק על ידי bioreactor מאפשר לתאים כדי ליצור אגרגטים תלת ממדי (3-D) הצגת in vivo, כמו מאפיינים בדרך כלל לא נצפתה על פי תקן 2-D התנאים תרבות 1D (איור). מאפיינים אלה כוללים צמתים הדוקים, MUCלנו ייצור, הפסגה / הבסיס אוריינטציה, בלוקליזציה חלבון vivo, וגם נוספות אפיתל לתא מסוג מאפיינים ספציפיים.

התקדמות מ monolayer של תאים אפיתל לצבור 3-D הבדיל באופן מלא משתנה בהתאם לסוג התא 1, 7-13. הדגימה מעת לעת bioreactor מאפשרת ניטור של היווצרות המצרפי אפיתל, סמנים התמיינות ועל הכדאיות (1D איור). לאחר התמיינות היווצרות המצרפי הוא הוקם, התאים נקצרים מן bioreactor, ואת מבחני דומה שבוצעה על 2-D תאים יכול להיות מיושם על המצרפים 3-D עם כמה שיקולים (איור 1E-G). בעבודה זו אנו מתארים שלבים מפורטים של איך תרבות 3-D אגרגטים תא אפיתל במערכת bioreactor RWV ועוד מגוון של מבחני וניתוחים פוטנציאליים כי ניתן לבצע עם 3-D אגרגטים. ניתוחים אלה כוללים, אך לא רק, מבני / מ 'ניתוח orphological (confocal, סריקה מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים), ציטוקינים / chemokine הפרשת ו איתות תא (מערך חרוז cytometric וניתוח כתם המערבי), ביטוי גנים ניתוח (בזמן אמת PCR), טוקסיקולוגית / סמים או ניתוח אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן. ניצול של מבחני אלה להגדיר את הבסיס מחקרים מפורטים יותר ורחבה כמו metabolomics, transcriptomics, proteomics ועוד מגוון יישומים מבוססי. המטרה שלנו היא להציג לא קונבנציונאלי באמצעות תאים אנושיים culturing אפיתל לייצר organotypic 3-D מודלים לשחזר האנושי ברקמה vivo, במערכת קליל וחזק לשימוש על ידי חוקרים בעלי אינטרסים מדעיים שונים.

Protocol

כל הפעולות יש לבצע על פי BSL-2 תנאי מכסה המנוע זרימה למינרית.

1. הכנת bioreactor STLV

  1. להרכיב את bioreactor STLV פי פרוטוקול של היצרן ולבצע פרוטוקול הטיהור על מנת להבטיח סטריליות של bioreactor. מכסים יציאות פתוחות עם כמוסות luer ולמלא STLV עם אתנול 95% עבור 24 שעות.
  2. הסר אתנול ולמלא STLV עם מים מזוקקים מעוקרים על 24 שעות.
  3. חזור על שלב 1.2 עם מים מזוקקים מעוקרים בלבד.
  4. בעזרת הכלי מסופק על ידי הספק, לשחרר את כל הברגים, כובעים וחבר המרכז של STLV ו החיטוי ב 110 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות בכיס עיקור.
  5. לאחר STLV הוא מקורר, להדק ברגים וחזור על שלבים 1.1-1.4 כדי להבטיח עקרות דטוקסיפיקציה מלאה.
  6. להדק את הברגים של מקורר STLV ו בורג ב מראש מעוקרות בכיוון אחד והברזים למיניהם על כל יציאה.
  7. שסתום פתח ידי מיקום הכפתורים אנכית.
  8. הסר את בוכנות מתוך מזרק 10 מ"ל ו 5 מ"ל luer נעילת מחדש שרוול בוכנות חזרה עטיפות לשמור על סטריליות. לדפוק על גבי המזרקים והברזים למיניהם (luer נעילת מזרקים קצה נדרשים בשלב זה).
  9. הוספה של Dulbecco פוספט שנאגרו מלוחים (DPBS) כדי מזרק 10 מ"ל עד STLV מלא ומתחיל למלא מזרק 5 מ"ל.
  10. החלף את בוכנות סטריליים לתוך מזרק אחד ולהסיר בועות שיורית המתרחשים bioreactor לסירוגין בין נהיגה בוכנות של המזרקים.
  11. השאירו את מזרקים המחוברים bioreactor לאחר הסרת כל הבועות. והברזים למיניהם הקרובים ולצרף STLV לפלטפורמה אנכי סיבוב וסיבוב על מינימום של 24 שעות כדי לפקח על הדלפות.

2. הכנת חרוזי Microcarrier

  1. הוסף 15 מ"ל DPBS ל ~ 250 מ"ג חרוזים cytodex microcarrier של צינור חרוטי 50 מ"ל ו החיטוי בתנאים זהים לאלה STLV (1.4).
  2. לאחר הקירור, הסירו DPBS, להוסיף התקשורת המשמשים לגדול epitheliהתא אל העניין, ועל צינור מערבולת כדי resuspend חרוזים.
  3. חזור על צעדים לשטוף עם התקשורת עוד פעמיים. לאחר שטיפת הסופי להוסיף 15 מ"ל צמיחה התקשורת כדי חרוזים.

3. זריעת לתאי האפיתל וחרוזים אל bioreactor STLV

  1. לגדול לתאי האפיתל של עניין כמו monolayers ב צלוחיות תרבית הרקמה עד לקבלת ≥ 1x10 -7 תאים. הסרה של תאים מן הבקבוק (trypinsization כלומר, EDTA), לספור תאים להקים ריכוז הסלולר, ולקבוע כדאיות הסלולר על ידי צביעה הדרה trypan כחול 1.
  2. כדי צינור חרוטי המכילה חרוזים מוכנים (ראו 2.3), להוסיף הריכוז הרצוי של תאים (2x10 1x10 5-7 בתאי אפיתל) 2, 8, בהתאם לסוג תא אפיתל שלך כוונות (איור 1 א). להבטיח את כל התאים מועברים על ידי שטיפת צינור חרוטי.
  3. הסר DPBS מזרקים מ STLV.
  4. נתקו מנמל במרכז ומוסיפים את ג אפיתלell / השעיית חרוז לתוך STLV בעזרת פיפטה 10 מ"ל סרולוגית. יש לשטוף את צינור חרוטי על מנת להבטיח את כל התאים / חרוזים מועברים STLV ולהחליף תקע במרכז הנמל.
  5. הסר בוכנות ממספר 5 ל 10 מזרקים מ"ל ו מחדש שרוול המתערבים חזרה ב עטיפות לשמור על סטריליות. לדפוק מזרקים לתוך יציאות עם והברזים למיניהם פתוחים. מלאו את STLV עם התקשורת, להחליף בוכנות, והברזים למיניהם קרובים.
  6. מניחים את STLV שנשתל מחדש לאחרונה ב 37 ° C החממה למשך 30 דקות עם סיבוב לא.
  7. והברזים למיניהם פתוחים, להסיר בועות באמצעות בוכנות, ולאחר מכן והברזים למיניהם קרובים.
  8. מניחים את STLV ב 37 מעלות צלזיוס, 5% 2 CO humidified חממה מסתובב בסל"ד 20 (1B איור). תרבויות חייב לסובב ברציפות 24 יום חה למעט כאשר הדגימה, התקשורת המשתנים, או אגרגטים קציר (ראה סעיף הבא).

4. , דגימה culturing, צילום ותיעוד של תרבויות

  1. לאחר שעות 96-120 הראשונית של התאים culturing ב דוoreactor, מדיה שינוי ידי STLV הטיה המאפשר לתאים / חרוזים להתיישב. הסר מזרקים, פתח את שתי והברזים למיניהם, ויוצקים מעל ~ 75% של התקשורת מהנמל בצד (איור 1 ג). בהתבסס על חילוף החומרים התאי של התקשורת, לשנות את התקשורת בכל יום או כל יומיים לאחר זריעת ראשוני 96-120 זמן של שעתיים התרבות.
  2. לדפוק על 5 ו - 10 מ"ל של חלל מזרקים בוכנות ופעל פרוטוקול refeeding כמתואר לעיל (1.7-1.11), ואז לדפוק סגר את הגב STLV במקום על פלטפורמה מסתובבת.
  3. מעקב אחר הצמיחה הכדאיות של אגרגטים כל 5-7 ימים אחרי זריעת אל STLV בקפידה על ידי הסרת חלק קטן של אגרגטים (~ 200 μL) מהנמל למרכז לשני צינורות 1.5 מ"ל. כדי למנוע הגז במצטבר, עבור כל העברות צבירה משתמש קצה 1000 פיפטה μL כי נחתך ~ 2 ס"מ מנקודת ו מעוקרים.
  4. החלפת תקע במרכז, חילופי עם מזרקים חדשים, להוסיף מדיה טריים STLV כמתואר לעיל (1.7-1.11), ומניחים חזרה STLV בחממה עם סיבוב (ראה 3.8).
  5. לניטור הכדאיות הסלולר, השתמש באחד משני 1.5 צינור אגרגטים מ"ל aliquoted בשלב 4.3, ולהסיר תאים חרוזים באותו אופן את לתאי האפיתל יוסרו תרבות צלוחיות רקמות (trypsinization IE). לפקח הכדאיות של הדרה כחול trypan מכתים 1.
  6. על אגרגטים הדמיה הסלולר, להוסיף 0.5-1 מ"ל של התקשורת aliquot 1.5 2 מ"ל המצרפי והעברה צלחת פטרי קטנה באמצעות חתך 1000 עצה פיפטה μL. תמונה אגרגטים באמצעות מיקרוסקופ אור הפוכה (1D איור).

5. העברת והקציר מצרפי

  1. במשך כמה דגמים סלולריים אפיתל יש צורך להעביר את אגרגטים כדי הארוו הפנויה להגדיל אוורור התרבות 2. כשבוע לפני הקטיף אגרגטים לניתוח, הסר מזרקים והברזים למיניהם מ STLV ויוצקים מעל ~ 50% של התקשורת מהנמל לצד.
  2. ראםאובה חבר מרכז של STLV ובזהירות לשפוך את כל התוכן לתוך צינור מ"ל 50 חרוטי ממרכז הנמל (איור 1E). שוטפים את STLV פעמיים עם 5 מ"ל התקשורת ולשלב לשטוף עם שאר אגרגטים.
  3. המשך העברת אגרגטים כמתואר 5.2, אבל אגרגטים העברת מהצינור מ"ל 50 חרוטי עד הארוו.
  4. בזהירות אגרגטים האסיף הארוו לאחר שבוע 1 ~ או STLV (בהתאם לסוג התא) כפי שבוצעה לעיל (5.2). ראה להלן פורמטים assay, מבחני פוטנציאליים וניתוח לאחר הקציר המצרפי.

6. ניתוח הפוטנציאל, יישומים מבחני שנערכו עם המצרפים

  1. אגרגטים זריעת עבור פורמטים ניסיוניים שונים. העברת הסכום הרצוי של אגרגטים מהצינור חרוטי 50 מ"ל למבחנה 1.5 מ"ל, 24 צלחת יפה, או 96 צלחת גם באמצעות ניתוק עיקור עצה 1000 פיפטה μL (איור 1F).
  2. כביסה ו preparלאינג אגרגטים לניתוח. הסר התקשורת לאחר אגרגטים התיישבו. לוותר DPBS ישירות למרכז הצינור או גם כך כל המצרפים הם עוררו. לאחר אגרגטים התיישבו למטה, להסיר DPBS וחזור כמה פעמים לפי הצורך.
  3. אגרגטים משלוח לניסויים מחוץ לאתר וניתוח. הוסף הסכום הרצוי של אגרגטים לצינור 50 מ"ל ולשטוף אגרגטים כמו 6.2. לחלוטין למלא צינורית 50 מ"ל עם התקשורת, כובע, ו parafilm סביב שווי כדי למנוע דליפה. מאובטח הספינה אגרגטים למיקום הרצוי לילה בטמפרטורת הסביבה.
  4. אגרגטים תיקון עבור במיקרוסקופ אלקטרונים (איור 2). סריקה, שידור או חיסונית במיקרוסקופ אלקטרונים ניתן לבצע באמצעות העברת אגרגטים 150-300 μL לצינור 1.5 מ"ל ו שטיפת אגרגטים 3 פעמים עם DPBS (6.2). הוספת 200 μL של יישום ספציפי מקבע (SEM, TEM, חיסוני EM וכו ') אלקטרונים מיקרוסקופית לתקופה הדגירה הרצויה. הסר לתקן, לשטוף aggregatהגזע 2 פעמים עם DPBS, והמשך כפי שמתואר Hjelm et al. 2010 עבור סריקה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים 2.
  5. מיקרוסקופיה הדמיה immunofluorescence (איור 3). העברה ~ 100 אגרגטים μL לצינור 1.5 מ"ל ו אגרגטים כביסה (6.2). תיקון ו אגרגטים תווית עם נוגדנים בתנאים דומים כמו עם monolayers, למעט צינור 1.5 מ"ל. לעלות, הצב 1 טיפה של התקשורת גובר על שקופיות מיקרוסקופ, העברת אגרגטים המסומנים על גבי מדיה גובר עם קצה 1000 חתוכים פיפטה μL, coverslip מקום על אגרגטים, חותם coverslip עם לק, והחלק יבש בן לילה 2.
  6. מדידת כדאיות נייד / התפשטות השימוש assay MTT (איור 4). אגרגטים העברה לצלחת גם 24 ולהחליף התקשורת עם 625 Media פנול μL חינם אדומים. הוסף 62.5 μL של 5 מ"ג / מ"ל ​​Thiazolyl כחול Tetrazolium ברומיד (MTT) זה טוב דגירה של 4 שעות ב 37 ° C. הוספת 625 μL של 100 מ"ג / מ"ל ​​SDS-0.01M HCl זה טוב דגירה בן לילה. קרא את ספיגת ב 570 ננומטר ולקבל תא% הכדאיות באמצעות המשוואה:

משוואה 1

  1. מחקרים הרעלים. העברת אגרגטים לצלחת 24 גם ולבצע הדרה trypan כחול על ≥ 2 בארות של כדאיות התא ריכוז ראשוני /. הוסף מתחם מבחן החל על ריכוזי לשכפל וולס. עבור כדאיות התא (איור 5 א), לשטוף אגרגטים ולבצע הדרה כחול trypan לאחר הטיפול. עבור TC 50 (5 ב איור), לקחת את הכדאיות הסלולר בארות כפולים על ריכוז כל הזמן ולהשתמש בשיטה ריד Muench כדי לקבוע ריכוז רעיל 50% 2, 15.
  2. מערך חרוז Cytometric (CBA) או ELISA. Supernatants סלולריים ניתן לקחת לאחר זריעת התאים בכל פורמט ניסיוני ניתח. לעורר אגרגטים זרע כמו תאים שגודלו כmonolayers, לאסוף supernatants (≥ 120 μL), וכן חנות ב -80 ° C לניתוח על ידי ELISA או CBA (איור 6).
  3. ניתוח RNA. העברת ≥ 500 μL של אגרגטים על צינור 1.5 מ"ל ו אגרגטים לשטוף עם DPBS. המשך מיצוי באמצעות Qiagen ערכת RNAeasy ופרוטוקול עבור תאים של בעלי חיים עם homogenization של lysate באמצעות 20-מד המחט. ודא לתת חרוזים להתיישב בחלק התחתון של הצינור, לפני העברת supernatant, ואל להעביר חרוזים ריקות לעמודה ספין (חרוזים יהיה להדביק קרום טור וכתוצאה מכך התשואה רנ"א נמוכה) (איור 7).
  4. ניתוח חלבון. אגרגטים קציר תחת באותה השיטה עם monolayers באמצעות צינור 1.5 מ"ל או בפורמט ניסיוני יותר. עם זאת, לאחר תמוגה של אגרגטים, להתיר החרוזים להתיישב ולהעביר lysate לצינור נפרד לפני הפעלת חלבון ג'ל או צורה אחרת של ניתוח חלבון (איור 8).
  5. זיהוםמחקרים. אגרגטים זרעים לפורמט ניסיוני הרצוי. השתמש לפחות שתי בארות / דגימות תאים trypsinizing חרוזים למנות מספר הנייד ולכמת כדאיות התא. להדביק אגרגטים עם הפתוגן של ריבית ריבוי הנבחר של זיהום כמו הופיע עם תאים שגודלו כמו monolayers (איור 9). צעדים שטפי יש לבצע כמו 6.2.
  6. Cytometry זרימה: אגרגטים זרעים של צינור 50 מ"ל, לשטוף אגרגטים (6.2), ומוסיפים 2 מ"מ EDTA למשך 5-10 דקות ב 37 ° C. הוסף מדיה 5-10 מ"ל לתאים תאים ולהעביר דרך מסננת התא. 1x10 aliquot 6 תאים לתוך צינור פוליפרופילן ותאי לשטוף בתמיסה חסימת קר (1% FBS ב PBS). Resuspend התאים עם הנוגדנים ו דגירה על פי היצרן. לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה, resuspend ב PBS, ותאי העברת לסנן צינור לניתוח (איור 10).

7. נציג תוצאות

דוגמההמצרפי הבדיל אפיתל האדם גדל במערכת bioreactor STLV ניתן לראות באיור 2. התמונות SEM ו TEM נאספים מתאי הנרתיק אדם הגדלים STLV במשך 39 ימים, שבהם microridges, invaginations, שלפוחית ​​הפרשה תאיים, וכן על microvilli למשטח הפסגה ניתן לצפות. הפגנה נוספת in vivo, כמו מאפיינים של תאים אפיתל הגדלים bioreactor ניתן לצפות על ידי confocal תמונות מיקרוסקופיה immunofluorescence (איור 3) של 3-D בתאי הנרתיק המבטאים mucin (MUC1) סמנים ספציפיים עבור תאים אפיתל (ESA) והתמיינות בטרמינל (Involucrin; INV).

כפי שניתן לראות, 3-D אגרגטים להציג תכונות דומות ultrastructural לרקמות, לעומת זאת פנוטיפים יותר רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית שלהם גם לשמש פלטפורמה מצוינת להערכת הרעילות של תרכובות. Assay MTT, assay נפוץ למדוד כדאיות התא, מטבוליזם או proliferation, ניתן להשתמש בהם כדי למדוד רעילות חומרים כימיים שונים ותרכובות (איור 4). טריטון X-100, חומרי ניקוי שהורס קרומים תאיים, שימש שליטה חיובית אימות assay MTT. שיטה נוספת למדידת רעילות עקב טיפול עם תרכובות הבדיקה היא trypan הדרה כחול (איור 5). בעקבות טיפול nonoxynol-9 (N-9), המצרפים הנרתיק הוכיח תגובה רעילות דומה לזה של דגמי explant צוואר הרחם, אבל על פרופיל שונה לעומת 2 monolayers, 16.

מחקרים נוספים הממחישים את היכולת של תאים אפיתל, גדל bioreactor, לתפקד לאותת בדומה רקמות in vivo, ניתן לראות באיור 6. לאחר גירוי עם מולקולות הנגזרות חיידקים המוכרים על ידי חיוג כמו רצפטורים (TLR), אגרגטים את להגיב מפרישים ציטוקינים דלקתיים בעד, כולל IL-6 1.הביטוי של הקולטן ופרוגסטרון (PR), רצפטור שמגיב לגירוי הורמונלי, ניתן גם לצפות בתאי הנרתיק הן ב RNA רמות חלבון (איור 7 ואיור 8, בהתאמה). את 3-D אגרגטים לא רק יש את היכולת להגיב על מולקולות הפתוגן ההורמון, אך יכולים גם מבחינה תפקודית לתמוך הרפס סימפלקס סוג וירוס 2 (HSV-2) זיהום. תמונת מיקרוסקופ confocal של HSV-2 אגרגטים נגועים הנרתיק 3-D (איור 9) מדגים זיהום. מקבילים 2-D הנרתיק בתרביות תאים אפיתל לא הוצגו כתוצאה של הרס הסלולר חמורה הנגרמת על ידי נגיף HSV-2. RWV הנגזרות 3-D אגרגטים יש גם שימש לכמת שכפול חיידקים ווירוסים באמצעות עקומות גדילה תאיים מבחני פלאק, בהתאמה 8, 9. לבסוף, המאפיינים הפיזיים תפקודית של תאים בודדים בתוך אגרגטים ניתן גם לכמת ידי cytometry הזרימה. עבור exampלה, אנחנו עובדים cytometry זרימת assay למדוד MUC1 ביטוי פני השטח על תאים בודדים הנרתיק (איור 10). אגרגטים 3-D הנרתיק הביע שיעור נמוך יותר של MUC1 (27.7%) לעומת monolayers (67.2%). שיעור נמוך יותר של MUC1 על משטח אגרגטים 3-D לעומת monolayers עשוי להיות תוצאה של רוב MUC1 להיות מופרש מתאי כפי שנצפה בדרכי הנרתיק 17, 18.

איור 1
באיור 1. סכמטי של תאים אנושיים culturing אפיתל ב RWV ויישומים פוטנציאליים באמצעות RWV הנגזרות אגרגטים.) לתאי האפיתל גדלים בתחילה monolayers ב הבקבוק בתרבית רקמה. Confluent פעם, תאים יוסרו מן הבקבוק בשילוב עם חרוזים microcarrier ב bioreactor STLV. סרגל קנה מידה:. 80 מיקרומטר ב ') STLV מסתובב על פלטפורמה ליצירת סביבה קבועה נפילה חופשית של F נמוךגזירה luid, המאפשר לתאים לצרף לגדול על חרוזים ובכך יוצרים אגרגטים הסלולר גלויים. ג) לאחר 96 שעות, התקשורת ב STLV יש לשנות כדי להתאים את חילוף החומרים התאי. התקשורת שפכה את נמל הצד, התקשורת טריים מוחלף באמצעות המזרק המצורף מ"ל 10 (הבוכנה הסיר), ו בוכנות המזרק מוחלפים ומשמש בועות extrude. ד ') אחרי ~ 5 ימים (ד) אגרגטים מתחילים ליצור . המצרפים נדגמים כל 7 ימים צילמו על ידי מיקרוסקופ אור לעקוב אחר התקדמות התפתחותית שלהם (20x הגדלה של 3-D בתאי אדם הנרתיק אפיתל). ה) לאחר היווצרות צבירה שלם התמיינות קרה, אגרגטים את נקצרים מן bioreactor ו שהועברו לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל). מצרפי פריץ ניתן זרע לתוך צינור 1.5 מ"ל או בפורמט רב גם הצלחת לבצע ניתוח ניסיוני מבחני. G) מתאר של שורר מבחני ntial וניתוחים שניתן שנערכו על המצרפים את. ברשימה זו נציג ניתוח לא אמור להיות קטלוג מקיף של כל היישומים במורד הזרם פוטנציאליים.

איור 2
איור 2. בחינת מאפיינים מורפולוגיים ומבניים של 3-D אגרגטים תא אפיתל באמצעות מיקרוסקופית אלקטרונים. () סריקה במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) תמונה של המצרף 3-D תא אפיתל הנרתיק האנושי. ברים בקנה מידה: 200 מיקרומטר (100x), 100 מיקרומטר (200x), 50 מיקרומטר (500X). במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) תמונה של המצרף 3-D תא אפיתל הנרתיק האנושי עם חצים המצביעים (ב ') שלפוחיות הפרשה ואת microvilli תאיים או (ג) "תהליכים cytoplasmic". ברים בקנה מידה: 2 מיקרומטר (שונה מ Hjelm et al 2010). 2.

g3.jpg "/>
איור 3. מיקרוסקופיה immunofluorescence confocal המשמש לזיהוי בידול junctional וטושים חלבון ב 3-D אגרגטים תא אפיתל. בתאי הנרתיק 3-D שנקטפו מן bioreactor לאחר 32 ימים, קבועים, ומוכתמים נוגדנים () mucin MUC1, (ב) נוגדן ספציפי בתאי אפיתל, ESA, או (ג) נגד Involucrin (INV) נוגדן מזהה תאים אפיתל המבדילות סופני. אגרגטים תויגו בעקיפין עם נוגדנים 488 Alexa משני (ירוק). סרגל קנה מידה: 60 מיקרומטר (שונה מ Hjelm et al 2010). 2.

איור 4
באיור 4. Assay MTT משמש למדידת כדאיות הסלולר. אדם צובר הנרתיק 3-D היו זרע בצלחת 24 מטופלים היטב עם התקשורת לבדה (ללא טיפול) או 0.01%, 0.1% או 1.0% טריטון X-100 חומר ניקוי על 1 ח ב 37 ° ג Followin הטיפול גרם, התקשורת הוסר assay MTT בוצעה למדוד כדאיות הסלולר. מייצג ** p <0.001; 1 זנב של סטודנטים מבחן t השוואת טריטון X-100 תאים שטופלו לשליטה מטופל.

איור 5
איור 5. ניצול 3-D אגרגטים תא אפיתל רעילות מתחם המסך. (א) nonoxynol-9 (N-9) תלויה במינון עקומת הכדאיות 24 שעות שלאחר הטיפול של מודל 3-D תא אפיתל הנרתיק האנושי (קו אדום / פסים) לעומת סוג התא אותו גדל כמו monolayers confluent (קו שחור / פסים). (ב) N-9 TC 50 רמות של הנרתיק בתרביות תאים אפיתל ב (א) 1.5 שעות, 4 שעות, 8 שעות ו -24 שעות שלאחר הטיפול. * מייצג p <0.05, 1 זנב של סטודנטים מבחן t השוואת monolayers לתאים 3-D בזמן כל חשיפה. (שונה מ Hjelm et al. 2010) 2.

/ Files/ftp_upload/3868/3868fig6.jpg "/>
איור 6. ניתוח של ייצור ציטוקינים בתאי אפיתל 3-D בתגובה הקולטן כמו חיוג (TLR) גירוי אגוניסט. תלת ממד תאים בנרתיק אדם היו מגורה עם FSL-1 (TLR2 / 6), PIC (TLR3), דגל (TLR5) ו CL097 (TLR7 / 8) עבור 24 שעות ו ציטוקינים המופרשים נמדדו על ידי מערך חרוז cytometric. IL-6 מוצג ציטוקינים מעודדי דלקת נציג הפיק הנמדד. * מייצג p <0.05, 1 זנב של סטודנטים מבחן t השוואת דגימות מגורה PBS הקבוצה. (שונה מ Hjelm et al. 2010) 2.

איור 7
איור 7. הגן ניטור ביטוי בתאי אפיתל 3-D. חצי כמותית RT-PCR ניתוח של קולטני פרוגסטרון (PR) ביטוי בשכבה (ML) או 3-D בתאי אדם אפיתל הנרתיק. GAPDH מוצג פקד הטעינה. הגברה מוצריםהמוצגים הם תוצאה של ביטוי בפרוטוקול המתרחשים לאחר 30 מחזורי ה-PCR. חץ עומד בראש הצבע על להקות יחסי ציבור בלבד המתרחשים מדגם 3-D.

איור 8
איור 8. ביטוי חלבון ניתוח של 3-D בתאי אפיתל. ניתוח כתם המערבי של monolayer ו 3-D אדם אפיתל הנרתיק שלמות התא התא lysates (30μg) נחקר עם הקולטן אנטי פרוגסטרון (PR) נוגדנים. β-טובולין שימש בדיקה לטעינת שליטה.

איור 9
איור 9. שלוש D התא האנושי מודל אפיתל תומך זיהום ויראלי יעיל. מיקרוסקופיה Confocal התמונה immunofluorescence המצרפי של 3-D תא אפיתל הנרתיק האנושי נגוע HSV-2. התאים נדבקו ב משרד הפנים של 1.0 למשך שעתיים, לשטוף, זיהום קבוע 24 שעות הודעה (4% PFA), ו מוכתם HSV-2 ספציפי VP5 גapsid נוגדנים (ירוק) ו DAPI כתם גרעינית (כחול). סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר.

איור 10
איור 10. התא ניתוח הפרט במודל התא האנושי 3-D אפיתל על ידי cytometry הזרימה. (א) monolayer או (ב) 3-D אגרגטים אדם אפיתל הנרתיק היו ניתק עם EDTA, שכותרתו עם נוגדנים MUC1 FITC מצומדות (כחול), בקרת isotype (ירוק), או PBS (אדום), והביטוי FITC היה לכמת ידי זרימת cytometry. המספרים מייצגים את אחוז התאים מוכתם חיובית נוגדנים mucin שנותרו לאחר gating את הקרינה רקע מתוך שליטה תאים isotype מוכתמים. לא אחידה פסגות הם תוצאה של מספר רב של דפוסי glycosolation ורמות שונות של MUC1 על פני השטח של תאים אלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניצול הטכנולוגיה bioreactor RWV המוצג כאן עשוי לספק לחוקרים את היכולת לקדם את התרבות המערכת הנוכחית שלהם התא מודל רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית תא organotypic התרבות. תא bioreactor RWV מערכת התרבות מספקת microenvironment גזירה נמוך המאפשר לתאים ליצירת אגרגטים הסלולר 3-D עם in vivo, כמו מאפיינים, כולל צמתים הדוקים, ייצור mucin, תהליכים תאיים (כלומר microvilli) ו קוטביות הסלולר. רוב הנתונים ודוגמאות שהוצגו כאן שימוש בתאי אפיתל הנרתיק גדל במערכת RWV, לעומת זאת מערכת RWV גם שימש אחרים תרבות סוגי תאים אפיתל במעי כולל קטנים וגדולים, ריאות, שלפוחית ​​השתן, הכבד, ותאי אפיתל שקדים כדי ליצור 3-D מודלים organotypic 1, 7-13, 18. בנוסף, מערכת זו הייתה בשימוש לתא סוגי תרבות אחרים מאשר תאי אפיתל, וכיום הפיתוח של המתחם, multicellular מודלים תרבות organotypic נערכים 2, 18.

הפרוטוקולים המפורטים כאן נועדו לשמש מדריך, ואולי צריך להיות שונה בהתבסס על סוג התא של עניין. השינויים הנפוצים ביותר לפרוטוקול עבור תאים culturing אפיתל במערכת RWV כוללים את משך הזמן של תאים בתרבית STLV, ההחלטה והעיתוי של העברת המצרפי מ STLV כדי הארוו, והיחס תא / חרוז עבור ראשוני זריעת ב STLV. שינוי התמחות יותר שעשויה להיחשב ליצירת צבירה מוצלח הם המאפיינים של חרוז microcarrier או פיגום, כגון שטח, קוטר, צורה, ציפוי פני השטח, צפיפות, אין כסף, חומר הליבה, נקבוביות. בנוסף, התאמות עד בינוני בבסיס התרבות, ניסוח, או תוספי מזון, עשוי להיות נחוץ כדי לייעל את התנאים תרבות למקסם במבנה הצבירה. התאמות אפשר גם למערכת bioreactor ומרכיביו, בובהם גודלו של כלי bioreactor ואת מהירות הסיבוב. הערכה משופרת של microenvironment בתוך bioreactor, מערכת התרבות perfused זמינה גם המאפשר ניטור רציף של רמות ה-pH, חמצן, גלוקוז בתוך כלי התרבות להבטיח סביבה פורה להיווצרות המצרפי. זמן ארוך שעלול לבצע אופטימיזציה התנאים תרבות, היווצרות במצטבר, התמיינות תאית לאפיין כל מערכת הדגם החדש, כמו גם חשבון הראשונית של מערכת bioreactor, חסרונות בולטים במערכת זו. עם זאת, כל מערכת התרבות החדש מיושם במעבדה יהיו חסרונות דומים.

אנחנו ואחרים הראו כי RWV הנגזרות מודלים ניצול תאים אנושיים עשוי להיות כלי רב ערך לחיזוי, יעילות ורעילות והפרמקוקינטיקה של חיסונים, microbicides, ביולוגי ותרופות באופן רלוונטי 1 בני אדם, 2, 18. עם ההצלחה של ההיא תרבות bioreactor המערכת לייצר מענה אנושי אמיתי, יחד עם הגמישות שלה, יישומים של המערכת bioreactor RWV בימים אלה להרחיב בתחומים כמו דוגמנות הגידול, רפואה רגנרטיבית, הנדסת רקמות 2, 18-23. כדי לקדם מודלים RWV שנוצר שלנו ברירית אנחנו עובדים כדי ליצור מערכת תאיים מורכבים יותר, כי הן משכפל את המבנה והתפקוד של רקמת הרירית האדם. עם זאת, החוקרים מודים כי ייתכן שיהיה צורך להשתמש או לשלב מספר רב של מערכות מודל לשחזר את יחסי הגומלין המורכבים כי תרופות או חיסונים שיש להם עם מערכות פיזיולוגיות אדם. בסך הכל, המטרה שלנו באמצעות bioreactor RWV ויישומים הניסוי שלה היא להבין טוב יותר את הביולוגיה הרקמה הרירית ואת התגובות הסלולר עלבונות סביבתיים מודלים organotypic אדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות ברוק Hjelm עבור המומחיות הטכנית שלה, אנדרו לארסן לניתוח החלבון שלו. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי חלופות מחקר ופיתוח (MMHK) גרנט NIH מחלות המועברות במגע מיני NIAID ו microbicides מקומיים שיתופית מרכז המחקר IU19 AI062150-01 (MMHK). אנו בתודה להכיר ביולוגיה של רבייה לשימוש חוזר של דמויות.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 Invitrogen A21131 Used at 1:500 dilution
FACSDiva BD Biosciences Flow cytometer
β-tublin antibody Calbiochem 654162 Used at 1:5000 dilution
Bio-Plex 2000 Bio-Rad 171-000205 v5 software
Bioreactor and components Synthecon RCCS-4
Cell strainer BD Biosciences 352340 40μm pore size
Conical tube (50mL) Corning 5-538-60
Coverslips VWR international 48366067
Cytokine bead array kits Bio-Rad Custom human kit
Cytodex beads Sigma-Aldrich C3275
DPBS GIBCO, by Life Technologies 14190
EDTA Sigma-Aldrich ED-500G Ethylenediaminetetraacetic acid
Epithelial specific antibody (ESA) Chemicon International CBL251 Used at 1:50 dilution
Fetal Bovine Serum (FBS) GIBCO, by Life Technologies 10438 Heat inactivated
HARV (Disposable) Synthecon D-405
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148 37%
Involucrin antibody Sigma-Aldrich I 9018
Microscope slides VWR international 16004-368
MTT reagent MP Biomedicals 194592 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide
MUC1 antibody (microscopy) Santa Cruz Biotechnology, Inc. Sc-7313 Used at 1:50 dilution
MUC1 antibody (flow cytometry) BD Biosciences 559774 Also called CD227, use 20μL per test
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710 Diluted to 4% in DPBS
Petri dish (small) BD Biosciences 353002
Polystyrene tube with filter BD Biosciences 352235
Polystyrene flow tube BD Biosciences 352058
PR antibody Dako M3569 Used at 1:100 dilution
ProLong Gold Invitrogen P36931 Mounting media with DAPI
RNeasy Mini Kit Qiagen 74903
Sodium dodecyl sulfate Sigma-Aldrich 71725
Sterilization pouch VWR international 11213-035
Stopcocks (one-way) MedexSupply MX5061L
Syringe (10mL) BD Biosciences 309604 Luer-lock tip
Syringe (5mL) BD Biosciences 309603 Luer-lock tip
Trypan Blue Invitrogen T10282
Vp5 antibody Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-13525 HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
  2. Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-627 (2009).
  3. Bibliography of Research Publications [Internet]. , Synthecon. Houston, Texas. Available from: http://www.synthecon.com/bibliography.html (2012).
  4. Khaoustov, V. I., et al. Induction of three-dimensional assembly of human liver cells by simulated microgravity. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 35, 501-509 (1999).
  5. Papadaki, M., et al. Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, 168-178 (2001).
  6. Ishikawa, M., et al. Reconstitution of hepatic tissue architectures from fetal liver cells obtained from a three-dimensional culture with a rotating wall vessel bioreactor. J. Biosci. Bioeng. 111, 711-718 (2011).
  7. Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
  8. Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infection and Immunity. 69, 7106-7120 (2001).
  9. Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes Infect. 8, 1813-1825 (2006).
  10. Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 73, 1129-1140 (2005).
  11. Smith, Y. C., Grande, K. K., Rasmussen, S. B., O'Brien, A. D. Novel three-dimensional organoid model for evaluation of the interaction of uropathogenic Escherichia coli with terminally differentiated human urothelial cells. Infection and Immunity. 74, 750-757 (2006).
  12. Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol J. 6, 103 (2009).
  13. Duray, P. H., et al. Invasion of human tissue ex vivo by Borrelia burgdorferi. J. Infect Dis. 191, 1747-1754 (2005).
  14. Margolis, L. B., et al. Lymphocyte trafficking and HIV infection of human lymphoid tissue in a rotating wall vessel bioreactor. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 13, 1411-1420 (1997).
  15. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
  16. Beer, B. E., et al. In vitro preclinical testing of nonoxynol-9 as potential anti-human immunodeficiency virus microbicide: a retrospective analysis of results from five laboratories. Antimicrob Agents Chemother. 50, 713-723 (2006).
  17. Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88, 185-194 (2011).
  18. Andersch-Bjorkman, Y., Thomsson, K. A., Holmen Larsson, J. M., Ekerhovd, E., Hansson, G. C. Large scale identification of proteins, mucins, and their O-glycosylation in the endocervical mucus during the menstrual cycle. Mol. Cell Proteomics. 6, 708-716 (2007).
  19. Barrila, J., et al. 3D cell culture models: Innovative platforms for studying host-pathogen interactions. Nature Reviews Microbiology. 8, 791-801 (2010).
  20. Vamvakidou, A. P., et al. Heterogeneous breast tumoroids: An in vitro assay for investigating cellular heterogeneity and drug delivery. J. Biomol Screen. 12, 13-20 (2007).
  21. Jin, F., et al. Establishment of three-dimensional tissue-engineered bone constructs under microgravity-simulated conditions. Artif Organs. 34, 118-125 (2010).
  22. Vertrees, R. A., et al. Development of a three-dimensional model of lung cancer using cultured transformed lung cells. Cancer Biol Ther. 8, 356-365 (2009).
  23. Hwang, Y. S., et al. The use of murine embryonic stem cells, alginate encapsulation, and rotary microgravity bioreactor in bone tissue engineering. Biomaterials. 30, 499-507 (2009).
  24. Pei, M., He, F., Kish, V. L., Vunjak-Novakovic, G. Engineering of functional cartilage tissue using stem cells from synovial lining: a preliminary study. Clin. Orthop Relat. Res. 466, 1880-1889 (2008).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 62 סיבוב bioreactor הקיר כלי מערכת הרבייה הנשית בתאי אפיתל אנושיים תלת מימדי מודלים ברירית organotypic בתאי אפיתל הנרתיק microbicide הרפס סימפלקס וירוס טוקסיקולוגיה בין מאכסן לפתוגן אינטראקציות ההורמונים לקולטנים
Culturing ויישומים של סיבוב bioreactor וול כלי נגזר מודלים 3D תא אפיתל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M.… More

Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. J. Vis. Exp. (62), e3868, doi:10.3791/3868 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter