Summary
Die
Abstract
Das Facettenauge von Drosophila melanogaster besteht aus etwa 750 Ommatidien (Einheit Augen). Jeder Ommatidium wird von etwa 20 Zellen, einschließlich Objektiv-sezernierenden Zapfenzellen, Pigmentzellen, einer Borste Zelle und acht Photorezeptoren (PRs) R1-R8 2 zusammen. Die PRs spezialisiert haben microvillar Strukturen, die Rhabdomeren, die lichtempfindliche Pigmente, die Rhodopsine (RHS) enthalten. Die Rhabdomere sechs PRs (R1-R6) ein Trapez bilden und enthalten Rh1 3 4. Die Rhabdomere von R7 und R8 im Tandem in die Mitte des Trapezes positioniert und den gleichen Weg des Lichtes. R7 und R8 PRs stochastisch exprimieren verschiedene Kombinationen von Rhs in zwei Subtypen 5: Im 'p' Subtyp, Rh3 in p R7s mit RH5 in p R8S gekoppelt ist, während in der 'y' Subtyp, Rh4 in y R7s zugeordnet ist Rh6 in y R8S 6 7 8.
Frühe Angabe PRs und Entwicklung Ommatidien beginnt in der larvalen Auge antennalen Imaginalscheibe eine Monoschicht von Epithelzellen. Eine Welle der Differenzierung fegt über die Scheibe 9 und initiiert den Aufbau von undifferenzierten Zellen in Ommatidien 10-11. Die Gründer Zelle R8 wird in erster angegebenen rekrutiert R1-6 und dann R7 12-14. Anschließend, während Puppenentwicklung führt PR Differenzierung umfangreiche morphologische Veränderungen 15, einschließlich rhabdomere Bildung, Synaptogenese und schließlich rh Ausdruck.
In diesem Protokoll beschreiben wir Methoden zur Netzhaut Dissektionen und Immunhistochemie an drei definierten Zeiträume der Netzhaut Entwicklung, die Anwendung auf eine Vielzahl von Fragen Netzhaut Bildung und Entwicklungswege angesprochen werden können. Hier verwenden wir diese Methoden, um die schrittweise PR Differenzierung am Ebene einzelner Zellen in whole mount Larven, midpupal und erwachsenen Netzhaut visualisieren (
Protocol
Ein. Einführung
In diesem Video beschreiben wir Methoden zur Netzhaut Dissektionen und Immunhistochemie an drei definierten Entwicklungszeiten: die dritte Larvenstadium Larvenstadium, das midpupal und die erwachsenen Stadium. Obwohl unser Protokoll auch für andere Puppen Stufen (für Details auf die früheren Stadien, siehe 16), wählten wir die midpupal Bühne, wie es optimal für die Bildgebung ist alles PRs in einer Brennebene und ihre Kerne sind leicht zu identifizieren, die erleichtert die Visualisierung von Transkriptionsfaktor Expressionsmuster. Die Dissektion der späten Puppenstadium Netzhaut ist sehr ähnlich zu der Präparation der erwachsenen Netzhaut.
Zuerst zeigen wir, wie man Larven und Puppen an den gewünschten Stufen zu sammeln. Dann erklären wir, wie die optimale Dissektionen der Larven 17-18, midpupal und erwachsenen Netzhaut erhalten. Zweitens zeigen wir, wie man PR Entwicklung in diesen Stadien mittels Immunhistochemie und konfokale Mikroskopie visualisieren.
Die Entwicklungszeit von Insekten ist temperaturabhängig. Um reproduzierbare Inszenierung von Larven und Puppen zu erleichtern, empfehlen wir erhöhen alle fly Aktien bei 25 ° C unter einem 12 hr/12 Stunden Licht / Dunkel-Zyklus.
Third-Larven: Über 96 Stunden nach der Eiablage (bei 25 ° C), späten dritten Larvenstadium Stop Fütterung und wandern an den Wänden der Lebensmittel Fläschchen, wo sie schließlich verpuppen. Verwenden Sie einen weichen Pinsel oder einer Pinzette vorsichtig entfernen wandernden dritten Larvenstadium Larve aus der Wand des Lebensmittel Fläschchen.
50% Puppen ('midpupae') sind etwa 48 Stunden nach der Verpuppung beobachtet. Für exaktes Timing, können Sie einfach geformten weißen Puppen mit einem Marker auf die Lebensmittel Flasche kreisen. Alternativ dazu können Sie alle weißen Puppen zu einem neuen Fläschchen ein Fläschchen einheitlichen Inszenierung (für die Inszenierung der Puppen anhand morphologischer Kriterien, siehe 19) zu erhalten. Nach 48 Stunden, sorgfältig remove der midpupae aus dem Fläschchen mit einer Pinzette.
Erwachsenen Fliegen: Anesthetize jungen erwachsenen Fliegen (2-5 Tage nach Schlüpfen) auf einem CO 2-Pad. Entfernen Kopf mit einer Pinzette und speichern sie in einem Glas gut austeilen mit kaltem 1x PBS.
3. Dissection Procedure (ca. 1-2 h pro Experiment)
Nach dem Sammeln der Probe, legen Sie sie in einem Tropfen kaltem PBS auf einem Sylgard Dissektion Gericht. Dissect etwa 10-15 Netzhaut pro Genotyp.
Bitte beachten Sie die Material Safety Data Sheets sowie Ihre Institution Environmental Health and Safety Office für die richtige Handhabung der Reagenzien und Geräte (siehe Tabellen am Ende dieses Protokolls).
Ein. Larven Eye Imaginalscheiben
- Suchen Sie das vordere Ende der Larve, die die Mundhaken enthält. Verwenden Sie eine Zange, um den mittleren Teil der Larve drücken Sie vorsichtig gegen die Basis des Sylgard Gericht. Verwenden Another Zange, um die Mundhaken packen und ziehen Sie vorsichtig und langsam vom Körper weg. Entsorgen Sie die wichtigsten Teil des Körpers und nutzen Sie die Mundwerkzeuge, um den vorderen Teil halten, um fremde Gewebe aus den Imaginalscheiben die beigefügte an das Gehirn bleibt entfernen.
- Übertragen Gehirn mit Imaginalscheiben durch Greifen die Mundhaken mit einer Pinzette auf 1x PBS in einem Drei-well Glasschale. Führen Fixierung (Schritt 4.1.).
- Nach der Fixierung, entfernen Speicheldrüsen, Fettgewebe und ziehen das Gehirn vom Auge weg-antennalen Imaginalscheibe. Um die Zugänglichkeit zu der "schwierig" Antikörper zu verbessern, kann die peripodial Membran, die auf der Oberfläche des Epithels liegt, durch Halten der antennalen Teil der Scheibe und Ablösung der Membran weg mit einem Präpariermikroskop Stift entfernt werden. Als nächstes führen Immunhistochemie (Schritt 5.1.).
2. 50% Verpuppung / Midpupal Netzhäute
- Halten hinteren Ende des Kokons mit einer Pinzette.Entfernen Sie vorsichtig die vordere Oberfläche des Kokons durch Greifen die Nagelhaut mit einem anderen Pinzette und ziehen weg von der Puparium. Peel entfernt restliche Schuppenschicht, um den Kopf freizulegen.
- Verwenden Sie die Zange "Tipps zum Durchstoßen der zugrunde liegenden, weichen Sack in der dorsalen Frontzahnbereich. Dies ermöglicht den Zugang zum Kopf. Vorsichtig trennen den Kopf aus dem Thorax durch langsames Ansaugen der Kopf mit einem P20 Pipette. Vertreibt Kopf Pipettenspitze in frischem, kaltem 1x PBS und entfernen überschüssiges Gewebe, kaufen Sie den Kopf Nagelhaut und entfernen Rüssel. Gehen Sie zur Fixierung (Schritt 4.1.).
- Pierce die Optik lobe mit einem Sezieren pin zu stabilisieren das Gewebe. Stecken Sie das andere Sezieren Stift zwischen der Lamina und der Retina, um die Netzhaut von der Lamina / optic Lappens trennen. Führen Immunhistochemie (Schritt 5.1.).
3. Adult Augen
- Besorgen Sie sich die Mitte des hinteren Kopfkapsel mit einer Zange und entfernen Mundwerkzeuge (Rüssel), Fett tissue und Tracheen.
- Besorgen Sie sich die dorsale Kopf Nagelhaut mit einer Zange und mit der anderen die Augen aus Hirngewebe durch leichtes Ziehen seitwärts zu trennen. In den meisten Fällen wird die Lamelle eine dünne und transparente Hülle aus Gehirn Neuropil, zur Retina befestigt bleiben. Es ist einfacher, die Lamina nach Fixierung entfernen.
- Entfernen Cuticula am Auge Rand, sondern lassen ein kleines Stück zurück, um die Übertragung der Netzhaut, verschiedene Lösungen zu erleichtern. Führen Fixierung (Schritt 4.1.).
- Entfernen der Lamina durch Greifen es an einer Seite mit einer Pinzette vorsichtig und seitlich mit der anderen Zange ohne Beeinträchtigung der Netzhaut. Rückstände von Nagelhaut, wie es auf die Netzhaut während der Montage klappen könnte. Diese beiden Schritte sind kritisch für die Visualisierung Photorezeptoren, die andernfalls durch die Lamina verdeckt werden würde und bleibt der Kutikula während des bildgebenden Verfahrens. Gehen Sie zur Immunhistochemie (Schritt 5.1.).
4. Fixierung und Washing (ca. 1 Std.)
- Bewahren Sie die seziert Netzhaut in 1x PBS in einem Drei-well Glasschale auf Eis gelegt, während frisch bereitet das Fixiermittel (Verdünnung 40 Mikroliter 37% Formaldehyd-Lösung mit 360 ul 1x PBS, vortexen und auf Eis). Wir empfehlen, mit der Fixierung Protokoll vorzugehen und lange Lagerzeiten auf Eis (> 15 min) zu vermeiden.
- Ersetzen 1x PBS mit 200 ul 3,7% Formaldehyd-Lösung. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe in Fixierlösung eingetaucht ist. Dies ist kritisch, da es sonst nicht richtig befestigt werden. Falls notwendig, entfernen Luftblasen und Tracheen mit der Pinzette.
- Inkubieren am Schüttler für 15 min bei Raumtemperatur.
- Ersetzen Fixiermittel mit 1x PBS und spülen zweimal mit 1x PBS. Weiterhin Waschen in PBS 30 min (auf Schüttelmaschinen, bei Raumtemperatur).
- Ersetzen PBS mit PBST. Spülen zweimal mit PBST.
- Fahren Sie mit dem Entfernen der peripodial Membran von Larven Auge Discs (3.1.3.) Und die Lamellen aus midpupal / Erwachsene Netzhaut <strong> (3.2.3., 3.3.4.).
5. Immunhistochemie
- Sperrung: Ersetzen PBS mit 200 ul 5% normalem Serum in PBST und inkubieren Netzhaut für 20 min auf Schüttler bei Raumtemperatur.
- Ersetzen Blockierungslösung mit primärer Antikörperlösung. Verschließen Sie die Drei-Well-Platte mit Parafilm und über Nacht auf Schüttler bei Raumtemperatur.
- Ersetzen Lösung mit PBST und spülen 3 mal. Weiterhin Waschen mit PBST für mindestens 1 Stunde am Schüttler bei Raumtemperatur.
- Transfer in sekundären Antikörper-Lösung und Inkubation in einem Parafilm verschlossenen Glas gut Schale auf Schüttler über Nacht bei Raumtemperatur.
- Ersetzen Antikörper-Lösung mit PBST und spülen dreimal. Weiterhin Waschen mit PBST für mindestens ein hr am Schüttler bei Raumtemperatur. Die Proben können in PBST für mehrere Tage aufbewahrt werden, aber es ist wichtig, an die frische PBST mindestens einmal pro Tag hinzu, um sie vor dem Austrocknen zu verhindern.
6. Montage
- Für die Montage Larven und midpupal Netzhaut, mit der P20 Netzhaut in die Mitte eines sauberen Glasobjektträger übertragen. Entfernen Sie überschüssiges PBST. Verwenden Sie eine Pinzette Netzhaut auszurichten, um Bildgebung erleichtern.
- Fügen Sie 10 ul Eindeckmedium auf der Netzhaut. Cover sie vorsichtig mit einem 24x40-1 Deckglas und Dichtung mit klarem Nagellack.
- Für die Montage erwachsenen Netzhaut, bereiten "Brücken" 20: In zwei 5 ul Tröpfchen von 50% Glycerin an beiden Enden eines Glases Seite und decken Sie sie mit 22x22-1 Deckgläser (0,13 bis 0,17 mm dick).
- Entfernen Sie die PBST mit einem P20-Pipette, stellen Sie sicher, dass die Netzhaut nicht austrocknen. Fügen Sie 20 ul Eindeckmedium zum Brunnen. Verwenden Eindeckmedium auf Netzhaut mit dem P20 der "Brücke" Glasträger übertragen.
- Verwenden Sie eine Zange zu orientieren (Linsen sollte das Glas Gleitfläche) und richten Netzhaut, um Bildgebung erleichtern. Falls notwendig, entfernen Luftblasen mit dem P20.
- LangsamOrt 24x40-1 Deckglas (0,13 bis 0,17 mm dick) von einer Seite auf die Kanten und dichten mit klarem Nagellack oder Klebeband. Proben bei 4 ° C in einem Objektträger saver box (halten im Dunkeln).
7. Repräsentative Ergebnisse
Als ein Beispiel für die Anwendung dieses Protokolls, zeigen wir repräsentative Ergebnisse zur Visualisierung Photorezeptor Differenzierung bei den drei Entwicklungsstadien in dem Video. Ein larvalen Auge antennalen Scheibe und eine midpupal Netzhaut wurden mit Antikörpern, die verschiedene Typen beschriften Photorezeptor während der Entwicklung (1A, B) und ein Erwachsener Netzhaut wurde mit zwei Rhodopsin-Antikörper angefärbt, um zwei Subtypen Photorezeptor (1C) visualisieren angefärbt.
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Discussion
Ein. Fehlerbehebung
Nach unserer Erfahrung erfordern Dissektionen Praxis (bis zu mehreren Wochen) und werden durch das Erreichen eine bequeme Handhaltung 21 durch ruhen die Ellenbogen und Unterarme auf den Tisch und mit den Fingern in Kontakt mit der Dissektion Gericht erleichtert. Auf diese Weise wird nur der Daumen, Zeigefinger und Mittelfinger durchführen subtilen Bewegungen.
Entfernen der Lamina ohne Beschädigung der Photorezeptoren ist wahrscheinlich der schwierigste Schritt. Praxis mit rotäugige Wildtyp entfernt, bevor Sezieren weißen einäugigen Mutanten, wie die Lamina ist viel einfacher, gegen den roten Augenpigmentierung sehen. Verwenden Sie außerdem Beleuchtung von hinten und einem dunklen Hintergrund unterhalb der Dissektion Gericht einen optimalen Kontrast zu erreichen.
Jedoch ist die Rote-Augen-Pigment fluoreszierend und hohen Hintergrund während des bildgebenden Verfahrens verursachen. Dies kann die Signale von den Sekundärantikörper schwächen. Eine gute Strategie ist es, keep Waschen der erwachsenen Netzhaut für vier bis fünf Tage und die Waschlösung mit frischen PBST mindestens einmal ersetzen pro Tag. Das Pigment wird ausgewaschen werden; sicher sein, Experimental-und Kontrollgruppe Genotypen für den gleichen Zeitraum zu waschen.
2. Anwendungen
Eye-spezifischen Verlust-und Gain-of-function nähert 22 23 machen das Drosophila Auge ein besonders leistungsfähiges System für genetische Manipulationen und Bildschirme. Darüber hinaus ermöglichen neu entwickelte Berechnungsmethoden für Single-Cell-Analyse in 3D-Rekonstruktionen der gesamten Netzhaut die Analyse von mutierten Phänotypen bei hoher Auflösung 24. Dieses Protokoll kann daher auf eine Vielzahl von Fragen der Entwicklung des Auges und die zugrundeliegenden Regulationsmechanismen 16,25-28 aufgebracht werden.
Abbildung 1. Retinale mounts an drei verschiedenen Entwicklungsstadien. A) Larven Auge Imaginalscheibe mit Antikörpern gegen Seven-up (grün) und Runt (magenta) gefärbt. B) Midpupal Netzhaut. Zwei Antikörper wurden verwendet, um alle Photorezeptoren R1-R8 (Elav, blau) und R7 Photorezeptoren (Prospero, cyan) zu visualisieren. C) Adult Netzhaut. Stochastic und sich gegenseitig ausschließende Ausdruck lichtempfindliche Pigmente RH5 (Cyan) und Rh6 (rot) in zwei Subtypen von R8 Photorezeptoren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch ein Ehrman Stipendium für HY unterstützt. H., Jane Coffin Childs Memorial Fund for Medical Research Postdoc-Stipendium, um RJJ, NIH Grant F32EY016309 auf DV, ein New York University Deans Dissertation Fellowship DJ, NIH GrantR01 EY13010 auf CD und ein DFG-Stipendium für JR (RI 2208/1- 1). Wir danken Nina Vogt und Pamela Boodram für Kommentare zum Manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent | |||
| Phosphate-buffered saline (PBS1x, pH 7.4) | Sigma | Prepare 10x stock solution 20. Dilute with distilled water to obtain 1x PBS and store at room temperature. Cool on ice before dissections. | |
| Triton-X 100 | Sigma | 9002-93-1 | Caution: Irritant! Wear gloves. Prepare 50 ml 1xPBS with 0.3% Triton X-100 (PBST). Store at room temperature. |
| 37% formaldehyde solution | Fisher Scientific | F75P1GAL | Caution: Toxic, probable human carcinogen! Wear gloves. Before the fixation step, freshly prepare 3.7% solution in a chemical fume hood by diluting with PBS, store on ice. |
| 5% normal horse serum | Jackson Immuno Research | 008-000-001 | Prepare 5% v/v dilution in PBST. Store at four degrees. |
| Primary and secondary antibodies (e.g. Donkey anti-sheep Alexa Fluor 488, Donkey-anti rabbit Alexa Fluor 555, Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647) | Invitrogen Molecular Probes | A11015 A31572 A31571 |
Dilute secondary antibodies 1:800 in PBST and store at four degrees. |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | A12379 | Dilute 1:100 in secondary antibody solution. | |
| Slowfade Gold Antifade reagent | Invitrogen Molecular Probes | S36936 | Mounting medium. Store at -20 degrees. |
| Glycerol | Fisher Scientific | G31-1 | For mounting. Prepare 10 ml of 50% dilution with distilled water, store at room temp. |
| CO2 | For anesthetizing adult flies. | ||
| Equipment | |||
| Two sharp forceps (Dumont #55) | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Prepare Sylgard dissection dish by filling a plastic Petri dish with Sylgard mixture. | |
| Three-well glass dissection dishes | Fisher Scientific | 21-379 | |
| Two minutien dissecting pins (0.1 mm diameter) and two pinholders (12 cm) | Fine Science tools | 26002-10 | Insert one minutien pin in each of the two pinholders and bend one of the pins to form a hook. |
| Microscope cover slips (22x22-1 and 24x40-1) | Fisher Scientific | 12-542A | |
| Microscope slides (25x75x1.0 mm; precleaned) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | |||
| Clear nail polish or Scotch tape | |||
| Orbital shaker | Bellco | ||
| Slide holder box | Fisher Scientific | ||
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Thin paintbrush | |||
| P20 and P200 micropipettes and tips | |||
| Dissecting microscope | |||
| Small bucket with ice | For cooling the glass well plates, dissected retinas and solutions. |
References
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