町の西部最速：クラシックウェスタンブロット分析に現代風にアレンジ
Summary
このプロトコルは、ウエスタンブロット分析を行う上での最新の進歩を探る。これらの新規な修飾は、35分間の電気泳動の実行時間を7分乾燥ブロッティング転送システムのBis-Trisゲルシステムを採用して、高解像度、品質、感度、およびウエスタンのデータの精度向上を発生する赤外蛍光タンパク質検出およびイメージング。
Abstract
もともと1970年代後半に設立されたウエスタンブロット法はまだ積極的に、今日利用されている。しかし、ウエスタンブロッティングのこの伝統的な方法は、低品質の解像度、スプリアスバンド、感度が低下し、貧困層のタンパク質の完全性を含むいくつかの欠点がある。最近の進歩は、劇的に高い定性的および定量的データを生成するために標準的なウェスタンブロットプロトコルの多くの側面を改善している。ビス – トリスゲルシステム、従来のLaemmliシステムに代わるものは、良好なタンパク質の分離及び解像度を生成し、タンパク質の完全性を維持し、35分の実行時間電気泳動を低減する。また、iBlotドライブロッティングシステムは、飛躍的に多くの場合、長い転送時間でより多くの非効率的であり、従来のタンパク質導入の方法とは対照的である7分、内膜へのタンパク質導入の有効性と速度を向上させます。これらの非常に革新的な改良、タンパク質Dと組み合わせて、化学発光の標準的なウェスタンブロッティング技術と比較して、より高品質、より正確で一貫性のあるデータにおける赤外蛍光イメージング結果を用いてetection。この技術は、同時に異なる蛍光チャネルで可視化された二色近赤外色素を利用して同じ膜上の2つの異なる抗原を検出することができる。さらに、蛍光イメージングの直線性と広いダイナミックレンジは強弱両方のタンパク質バンドの正確な定量が可能になります。したがって、このプロトコルは、大きく、この実験の実行時間を低減しつつ、これらの進歩は著しく、データの質を向上する古典的なウェスタンブロッティング法、カギ改良を記載している。
Introduction
ウエスタンブロッティングの技術は最初の抗体1-3を使用してタンパク質を検出するためのより良い方法を作成するために、1977年と1979年の間に開発されました。この手順では、二次抗体を用いて可視化し、オートラジオグラフィー、UV光、又はペルオキシダーゼ反応生成物3により検出された標的タンパク質とSDS-PAGEゲルからメンブレンへのタンパク質の電気泳動転写を利用した。したがって、これらの同じ基本原理が依然として広く、今日のウエスタンブロットプロトコルで使用される。しかし、この古典的なウェスタンブロッティング技術は、低速の電気泳動の実行時 間、低い解像度と人工タンパク質バンド、タンパク質分解に対する感受性、および限定された感度だけでなく、データ品質4として存在する多くの欠点を行います。したがって、このプロトコルは、より正確な定性および定量的データを生成し、標準的なウェスタンブロット手順に大きな進歩と改善について説明します。
"> SDS-PAGEを用いてタンパク質の広い範囲を分離するためのLaemmliシステムがこのウェスタンブロッティングシステムの人気にもかかわらず。ウェスタンブロッティング5に最も広く使用されているゲルシステムであり、この方法は、バンド歪み、解像度の損失、およびもたらし得るこれは、分離ゲルの高pH（9.5）に起因するタンパク質の脱アミノ化およびアルキル化の結果、ゲルの様々な酸化還元状態による減少ジスルフィド結合の再酸化、およびアスパ-プロリルの切断であるスプリアスバンド4。 Laemmli緩衝液（pH 5.2）、4,6タンパク質を加熱することによるペプチド結合、中性pH（7.0）で動作Lamemmliシステムよりも有意な利点を提供するのBis-Trisゲルシステム、このシステムは、タンパク質安定性、最小限を改善するタンパク質修飾は、その縮小状態でタンパク質を維持する電気泳動中アスパルチル-プロリル切断を防止し、より重要なことに、電気泳動実行時 間tは、さらに35分間4,6,7ある彼のBis-Trisゲルシステムはまた、シャープなバンドは、高解像度化、分離、およびより信頼性の高いデータが得られる増大した感度を生成する4。ビス-Trisゲルシステムと共に、iBlotドライブロッティングシステムは、著しく7分以内膜上にゲルからのタンパク質の転送時間を減らすために高い電界強度および電流を使用する。この搬送システムは、タンパク質8のより効率的で信頼性の高い転写を生成するドライブロッティング法に基づいている。従来の転写システムにiBlot転送システムの有効性の詳細な比較については、次のWebサイトを参照してください。 http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html .これは、イオンリザーバ8として作用する適切な転写緩衝液を含有するゲルマトリックスから構成され、アノードとカソードのスタックを利用する。転送中に、水の電気分解は、バンド8歪みを引き起こすことなく、より一貫性のタンパク質転写を生じる銅アノードからの酸素の発生を防止するのに役立つ。また、この転写システムはまた、電極8間の距離を減少させることによって転送速度を増加させる。
化学発光ウェスタンブロットのタンパク質検出のための最も一般的かつ伝統的な技法であるが解析し、二色赤外蛍光検出感度が大きく、品質、およびウェスタンブロットデータの精度を向上させることができる。この検出方法は、2つの最適な波長700nmの赤外線レーザー励起を使用しておよび800 nmの最大の信号対雑音比及び最高感度9鮮明な画像データを生成する。従って、2つの標的タンパク質は700 nmおよび800 nmの蛍光検出チャネルを使用して、同じ膜上で同時に可視化することができる。より重要なことには、赤外蛍光の線形性およびダイナミックレンジは強弱両方のタンパク質バンド9の正確な定量分析を可能にする。さらに、このプロトコルは、これらのプロセスの有効性を損なう、より大きな定性的および定量的ウェスタンブロットデータを生成するために赤外蛍光タンパク質検出を利用せずにこの実験の電気泳動および転写回数を減少させることによって、古典的なウェスタンブロッティング技術を超える多大な利点および改善を提供する。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルによれば、高品質の定量的なウエスタンブロットを生成する際の重要なステップは以下の通りである：1）タンパク質濃度を測定するステップと、2）試料調製、3）膜をブロッキングし、4）一次抗体の品質および口径。
総タンパク質濃度の測定精度は、赤外蛍光検出の感度は例外的なサンプルのタンパク質濃度で検出されたわずかな違いを増幅するので、?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は彼らの支援とサポートのためのマクマホン研究室のすべてのメンバーに感謝したいと思います。この研究は、NIH / NCI R01 CA176839-01（MM）と制度研究学問的なキャリア開発賞（JSへIRACDA）からの補助金によって支えられている。
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific/Pierce | 23225 |
| 4x NuPAGE® LDS Sample Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 |
| 10x NuPAGE® Sample Reducing Agent | Invitrogen/Life Technologies | NP0004 |
| 20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0002 |
| 20x NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0001 |
| NuPAGE® Antioxidant | Invitrogen/Life Technologies | NP0005 |
| NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well | Invitrogen/Life Technologies | NP0335BOX |
| NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well | Invitrogen/Life Technologies | NP0336BOX |
| SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5925 |
| XCell SureLock® Mini-Cell | Invitrogen/Life Technologies | EI0001 |
| iBlot® Transfer Stack, PVDF Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-01 |
| iBlot®Transfer Stack, PVDF Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-02 |
| iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-01 |
| iBlot®Transfer Stack, Nitrocellulose Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-02 |
| iBlot® Gel Transfer Device | Invitrogen/Life Technologies | IB1001 |
| β-Actin | Sigma | A2228 |
| Phospho-BIM (S69) | BD Biosciences | N/A |
| Total BIM | Epitomics | 1036-1 |
| Phospho-ERK1/2 (T202/Y204) | Cell Signaling Technology | 4370 |
| Total ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 9107 |
| Odyssey® Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32211 |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-68020 |
| Western Incubation Box, Medium | LI-COR Biosciences | 929-97205 |
| Odyssey® Classic Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A |
| Odyssey® Application Software V3.0.30 | LI-COR Biosciences | N/A |
References
- Burnette, W. N. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).
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- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
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