Le plus rapide de l'Ouest dans la ville: une touche contemporaine sur l'analyse classique western blot

Summary

Ce protocole explore les dernières avancées dans l'exécution des analyses Western blot. Ces nouvelles modifications utilisent un système de gel Bis-Tris avec une électrophorèse temps de fonctionnement de 35 min, un système de transfert de buvard sec 7 min, et la détection de la protéine fluorescente infrarouge et l'imagerie qui génère de plus haute résolution, la qualité, la sensibilité et l'amélioration de la précision des données occidentaux.

Abstract

Les techniques de Western blot qui ont été initialement établis dans les années 1970 sont encore utilisés activement aujourd'hui. Cependant, ce procédé traditionnel de transfert de Western présente plusieurs inconvénients qui comprennent une faible résolution de la qualité, les bandes parasites, diminution de la sensibilité, et l'intégrité de la protéine pauvre. Des progrès récents ont considérablement amélioré de nombreux aspects du protocole de Western blot standard pour produire des données qualitatives et quantitatives plus élevés. Le système de gel Bis-Tris, une alternative au système classique de Laemmli, génère une meilleure séparation et résolution de protéines, maintient l'intégrité de la protéine, et permet de réduire l'électrophorèse à un moment de l'exécution de 35 min. En outre, le système de blotting sec iBlot, améliore considérablement l'efficacité et la vitesse de transfert de la protéine à la membrane en 7 min, ce qui est en contraste avec les méthodes de transfert de protéines traditionnelles qui sont souvent moins efficace avec de longs temps de transfert. En combinaison avec ces modifications très innovants, des protéines détection en utilisant les résultats d'imagerie de fluorescence infrarouge dans de meilleure qualité, plus précis et des données cohérentes par rapport à la technique de Western blot niveau de chimioluminescence. Cette technologie permet de détecter simultanément deux antigènes différents sur la même membrane en utilisant deux couleurs des colorants proches de l'infrarouge qui sont visualisées dans les différents canaux fluorescents. En outre, la linéarité et la gamme dynamique de l'imagerie de fluorescence permet la quantification précise des bandes de protéines à la fois forts et faibles. Ainsi, ce protocole décrit les améliorations importantes de la méthode Western Blot classique, dans lequel ces avancées augmentent de manière significative la qualité des données, tout en réduisant considérablement le temps d'exécution de cette expérience.

Introduction

La technique de Western blot a été développé entre 1977 et 1979 afin de créer une meilleure méthode pour détecter des protéines en utilisant des anticorps ^1-3. Cette procédure utilise un transfert électrophorétique des protéines de membranes à partir de gels SDS-PAGE avec des protéines cibles visualisés en utilisant des anticorps secondaires et détectés par autoradiographie, la lumière UV, ou un produit de réaction de la peroxydase ^3. Ainsi, ces mêmes principes de base sont encore largement utilisés dans les protocoles de transfert de Western d'aujourd'hui. Cependant, cette technique de Western blot classique ne présentent de nombreux inconvénients, tels que la lenteur électrophorèse en exclusivité basse résolution et des bandes de protéines artificielles, sensibilité à la dégradation des protéines, et sensibilité limitée ainsi que la mauvaise qualité des données ^4. Par conséquent, ce protocole décrit les avancées et des améliorations significatives à la procédure de transfert de Western norme qui génère des données quantitatives et qualitatives plus précises.

"> Le système de Laemmli pour séparer une large gamme de protéines en utilisant SDS-PAGE est le système de gel le plus largement utilisé pour Western blot ^5. Malgré la popularité de ce système Western blot, cette méthode peut entraîner une distorsion de la bande, la perte de la résolution, et bandes parasites ^4. Ceci peut être une conséquence de la désamination et l'alkylation des protéines en raison du pH élevé (9,5) du gel de séparation, la réoxydation des liaisons disulfure réduites en raison de l'état d'oxydo-réduction variable du gel, et le clivage de l'aspartyl-prolyl des liaisons produites par le chauffage de la protéine dans du tampon de Laemmli (pH 5,2) ^4,6 peptidiques. Le système de gel Bis-Tris, qui fonctionne à un pH neutre (7,0), fournit des avantages significatifs par rapport au système Lamemmli. Ce système améliore la stabilité de la protéine, minimise modifications des protéines, maintient les protéines dans leur état ​​réduit, empêche aspartyl-prolyl clivage pendant l'électrophorèse, et plus important encore, le temps d'électrophorèse de fonctionner est de 35 min ^4,6,7. De plus, tsystème de gel es Bis-Tris produit également plus nettes bandes, une résolution plus élevée et la séparation, et une sensibilité accrue résultant des données plus fiables ^4.

En conjonction avec le système de gel Bis-Tris, le système buvard sec iBlot utilise la force de champ élevée et courants de réduire considérablement le temps de transfert des protéines à partir de gels sur des membranes dans 7 min ^8. Ce système de transfert est basée sur la méthode de buvardage à sec qui génère un transfert plus efficace et plus fiable des protéines ^8. Pour une comparaison détaillée de l'efficacité du système de transfert iBlot aux systèmes de transfert classiques s'il vous plaît consulter le site Web suivant: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Il utilise une anode et cathode pile, qui sont constituées d'une matrice de gel qui contient les tampons de transfert appropriées, qui agissent en tant que réservoirs d'ions ^8. Pendant le transfert, l'électrolyse de l'eau permet d'éviter la production d'oxygène à partir de l'anode en cuivre résultant en un transfert plus uniforme de la protéine sans provoquer de distorsion de la bande ^8. De plus, ce système de transfert augmente également la vitesse de transfert en réduisant la distance entre les électrodes ^8.

Bien chimiluminescence est la technique la plus commune et traditionnelle pour la détection de la protéine de transfert de Western analyses, deux couleurs infrarouge de détection fluorescente améliore considérablement la sensibilité, la qualité et l'exactitude des données de Western blot. Cette méthode de détection infrarouge utilise une excitation laser à deux longueurs d'onde optimales, 700 nmet 800 nm, pour générer une image claire de données avec le plus grand rapport signal sur bruit le plus élevé et la sensibilité ^9. Ainsi, les deux protéines cibles peuvent être visualisées simultanément sur la même membrane à l'aide de 700 nm et 800 nm fluorescentes canaux de détection. Plus important encore, la linéarité et la gamme dynamique de la fluorescence infrarouge permet une analyse quantitative précise de bandes de protéines à la fois forts et faibles ^9. En outre, ce protocole offre des avantages énormes et des améliorations sur la technique du Western blot classique en diminuant la électrophorèse et les temps de transfert de cette expérience sans compromettre l'efficacité de ces processus et en utilisant la détection infrarouge de la protéine fluorescente à produire plus de données de Western blot qualitatives et quantitatives.

Protocol

Une. Préparation des lysats cellulaires de culture cellulaire Placez des boîtes de culture de cellules sur la glace et ajouter du PBS froid avec 5 mM d'EDTA (de par exemple 5 ml de PBS avec 5 mM EDTA/10 cm 2 plaque). Éliminer les cellules adhérentes de la boîte à l'aide d'un grattoir à cellules et ensuite transférer la suspension cellulaire à un tube de 15 ml conique froid. Pellet les suspensions cellulaires par centrifugation à basse vitesse à 1000 rpm (23…

Representative Results

Deux couleurs de fluorescence infrarouge détecte les bandes à la fois forts et faibles sur la même membrane avec une sensibilité accrue et le meilleur rapport signal-sur-bruit pour produire des images claires Western blot. Des résultats typiques générés par la détection de transfert de Western de deux couleurs visualisées à la fois dans les 700 nm et 800 nm canaux fluorescents sont illustrés sur les figures 1 et 2. Le Western blot supérieure de la figure 1 …

Discussion

Les étapes essentielles de la génération de haute qualité, des taches quantitatives occidentaux selon ce protocole sont les suivants: 1) la mesure des concentrations de protéines, 2) la préparation des échantillons, 3) le blocage de la membrane et 4) la qualité et le calibre de l'anticorps primaire.

La précision de la mesure des concentrations de protéines totales peut avoir un impact majeur sur la quantification des bandes de protéines car la sensibilité exceptionnelle de d?…

Materials

BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE® LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE® Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE® Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock® Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot® Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot®Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot®Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot® Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey® Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey® Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey® Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A