Самый быстрый Западная в городе: современный поворот на анализ Классический вестерн-блоттинга
Summary
Этот протокол исследует новейшие достижения в выполнении Вестерн-блот анализа. Эти новые модификации используют систему гель Bis-Tris с 35 мин электрофореза время выполнения 7 мин системы передачи сухой блоттинг и инфракрасного обнаружения флуоресцентного белка и обработки изображений, который создает высокое разрешение, качество, чувствительность и повышенную точность западных данных.
Abstract
Западные методы блот, которые изначально были созданы в конце 1970-х по-прежнему активно используются сегодня. Впрочем, это традиционный метод вестерн-блоттинга имеет несколько недостатков, которые включают низкое разрешение качества, паразитные полосы, снижение чувствительности, а также плохую целостность белка. Последние достижения резко улучшилось многочисленные аспекты стандартной западной протокола блот производить более качественные и количественные данные. Система гель Bis-Tris, альтернативой традиционной системе Лэммли, генерирует лучшее разделение и разрешение белка, поддерживает целостность белка, а также снижает электрофореза в то время, 35 мин выполнения. Кроме того, iBlot сухой блоттинг система, значительно повышает эффективность и скорость передачи белка на мембрану в 7 мин, что в отличие от традиционных методов переноса белка, которые часто более неэффективными с длительному времени передачи. В сочетании с этими инновационных модификаций, белка Detection помощью инфракрасных результаты визуализации люминесцентных высшего качества, более точным и согласованные данные по сравнению с стандартной западной промокательной техники хемилюминесценции. Эта технология может одновременно обнаруживать двух различных антигенов на той же мембране с использованием двухцветной ближней инфракрасной красители, которые визуализируются в различных флуоресцентных каналов. Кроме того, линейность и широкий динамический диапазон флуоресцентных изображений позволяет точно количественной оценки как сильных и слабых белковых полос. Таким образом, этот протокол описывает ключевые усовершенствования в классической западной блоттинга, в которых эти достижения значительно повысить качество данных в то время как значительно снижает сроки выполнения этого эксперимента.
Introduction
Методика вестерн-блоттинга была впервые разработана между 1977 и 1979, чтобы создать лучший метод для обнаружения белков с использованием антител 1-3. Эта процедура используется электрофоретического переноса белков с мембранами ПААГ с ДСН с белков-мишеней визуализированных с помощью вторичных антител и обнаруженных с помощью авторадиографии, УФ-света, или пероксидазной реакции продукта 3. Таким образом, эти же самые основные принципы все еще широко используются в современных западных протоколов клякс. Тем не менее, это классический вестерн-блоттинга техника действительно представляет много недостатков, таких как медленной электрофорез временем работы, с низким разрешением и искусственных белковых полос, восприимчивости к деградации белков и ограниченной чувствительности, а также низкое качество данных 4. Таким образом, этот протокол описывает значительные успехи и улучшения в стандартной западной процедуры пятно, которое генерирует более точные количественные и качественные данные.
"> Система Laemmli для разделения широкий спектр белков с использованием SDS-PAGE является наиболее широко используемой системой гель для вестерн-блоттинга 5. Несмотря на популярность этого вестерн-блоттинга системы, этот метод может привести к искажению группы, потери разрешения, и паразитные полосы 4. Это может быть следствием дезаминирования и алкилирования белков в связи с высоким рН (9,5) разделительного геля, повторного окисления восстановленных дисульфидных связей из-за различной редокс-состояния геля и расщепления аспартил-пролил пептидные связи при нагревании белка в Laemmli буфера (рН 5,2) 4,6. Система гель Bis-Tris, который работает при нейтральном рН (7,0), обеспечивает значительные преимущества над системой Lamemmli. Эта система улучшает стабильность протеина минимизирует модификации белка, поддерживает белки в их уменьшенными государств, предотвращает аспартил-пролил-расщепление во время электрофореза, и что более важно, электрофорез запустить время 35 мин 4,6,7. Кроме того, тСистема гель он Бис-Трис также производит более четкие полосы, более высокое разрешение и разделение, и повышенную чувствительность в результате чего более надежных данных 4.В сочетании с системой гель Bis-Tris, iBlot сухая система блоттинга использует высокую напряженность поля и токи значительно сократить время передачи белков из гелей на мембранах в течение 7 мин 8. Эта система передачи основан на сухой метод блоттинга, который генерирует более эффективную и надежную передачу белков 8. Для детального сравнения эффективности системы передачи iBlot к обычным систем передачи пожалуйста, обратитесь к веб-сайте: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Он использует стек анод и катод, которые состоят из гелевой матрице, содержащей соответствующие буферы передачи, которые действуют как резервуары ионных 8. Во время передачи, электролиз воды помогает предотвратить образование кислорода из медного анода, что приводит к более последовательного переноса белков без ущерба полосы 8. Кроме того, эта система передачи также увеличивает скорость передачи за счет уменьшения расстояния между электродами 8.
Хотя ХЛ является наиболее распространенным и традиционным методом для обнаружения белка Западной блоттинга, двухцветный обнаружения инфракрасного флуоресцентного значительно улучшает чувствительность, качество и точность западным данным блот. Этот метод обнаружения использует возбуждение инфракрасного лазерного в двух оптимальных длин волн, 700 нми 800 нм, для создания четкого изображения данных с наибольшей отношения сигнал-шум и высокой чувствительностью 9. Таким образом, две целевые белки могут быть визуализированы одновременно на той же мембране с использованием 700 нм и 800 нм флуоресцентных каналов обнаружения. Что еще более важно, линейность и динамический диапазон инфракрасного флуоресценции позволяет точно количественного анализа и сильных и слабых белковых полос 9. Кроме того, этот протокол предоставляет огромные преимущества и улучшений по сравнению с классической западной промокательной техники путем уменьшения электрофорез и время передачи этого эксперимента не ставя под угрозу эффективность этих процессов и использования обнаружения инфракрасного флуоресцентный белок для производства более качественных и количественных данных вестерн-блот.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги в создании высокого качества, количественные вестерн-блот в соответствии с этим протоколом, являются следующие: 1) измерение концентрации белка; 2) подготовка образца; 3) блокирующий мембрану и, 4) качество и калибр первичного антитела.
Точность измерения …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории МакМахон за их помощь и поддержку. Это исследование было поддержано грантами на NIH / NCI R01 CA176839-01 (в мм) и институциональных исследований и академической карьеры развития Award (IRACDA в JS).
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific/Pierce | 23225 |
| 4x NuPAGE® LDS Sample Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 |
| 10x NuPAGE® Sample Reducing Agent | Invitrogen/Life Technologies | NP0004 |
| 20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0002 |
| 20x NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0001 |
| NuPAGE® Antioxidant | Invitrogen/Life Technologies | NP0005 |
| NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well | Invitrogen/Life Technologies | NP0335BOX |
| NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well | Invitrogen/Life Technologies | NP0336BOX |
| SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5925 |
| XCell SureLock® Mini-Cell | Invitrogen/Life Technologies | EI0001 |
| iBlot® Transfer Stack, PVDF Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-01 |
| iBlot®Transfer Stack, PVDF Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-02 |
| iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-01 |
| iBlot®Transfer Stack, Nitrocellulose Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-02 |
| iBlot® Gel Transfer Device | Invitrogen/Life Technologies | IB1001 |
| β-Actin | Sigma | A2228 |
| Phospho-BIM (S69) | BD Biosciences | N/A |
| Total BIM | Epitomics | 1036-1 |
| Phospho-ERK1/2 (T202/Y204) | Cell Signaling Technology | 4370 |
| Total ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 9107 |
| Odyssey® Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32211 |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-68020 |
| Western Incubation Box, Medium | LI-COR Biosciences | 929-97205 |
| Odyssey® Classic Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A |
| Odyssey® Application Software V3.0.30 | LI-COR Biosciences | N/A |
References
- Burnette, W. N. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- . . NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Kubo, K. Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling. Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).
- Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support. J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).
- . iBlot Dry Blotting System. Life Technologies Corporation. 25-0911, 84 (2012).
- . Western Blot Analysis. LI-COR Biosciences. 988-12622, (2012).
- . Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030. LI-COR Biosciences. , (2007).
- Hambaeus, L. Human Milk Composition. Clin. Nutr. 54, 219-236 (1984).
- DenHollander, N., Befus, D. Loss of antigens from immunoblotting membranes. J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).
