De snelste West in de stad: Een eigentijdse variant op de klassieke Western Blot analyse

Summary

Dit protocol verkent de nieuwste ontwikkelingen in het uitvoeren van Western blot analyses. Deze nieuwe modificaties maken gebruik van een Bis-Tris gel systeem met een 35 min elektroforese looptijd, een 7 minuten droge blotting transfersysteem en infrarood fluorescerend eiwit en beeldvorming dat hogere resolutie, kwaliteit, gevoeligheid en verbeterde nauwkeurigheid van Western gegevens genereert.

Abstract

De Western blot technieken die oorspronkelijk werden opgericht in de late jaren 1970 zijn nog steeds actief gebruikt vandaag. Echter, deze traditionele methode van Western blotting heeft een aantal nadelen dat lage kwaliteit resolutie, onechte bands, verminderde gevoeligheid, en een slechte eiwit integriteit omvatten. Recente ontwikkelingen zijn drastisch verbeterd tal van aspecten van de standaard Western blot protocol om hogere kwalitatieve en kwantitatieve gegevens te produceren. De Bis-Tris gel systeem, een alternatief voor de conventionele Laemmli systeem, genereert een betere scheiding van eiwitten en resolutie, onderhoudt eiwit integriteit, en vermindert elektroforese een 35 min looptijd. Bovendien is de iBlot droge blotting systeem drastisch verbetert de effectiviteit en de snelheid van eiwit overdracht aan het membraan 7 minuten, dit in tegenstelling tot de traditionele eiwit overdrachtmethoden die vaak meer inefficiënt met lange overstaptijden. In combinatie met deze zeer innovatieve modificaties, eiwit detection met infrarood fluorescerende beeldvorming resulteert in een hogere kwaliteit, meer accurate en consistente gegevens vergeleken met de standaard Western blotting techniek van chemiluminescentie. Deze technologie kan simultaan twee verschillende antigenen op dezelfde membraan door gebruik tweekleurige nabij-infrarode kleurstoffen die worden gevisualiseerd in verschillende fluorescente kanalen. Bovendien zijn de lineariteit en grote dynamiek van fluorescerende beeldvorming maakt de precieze kwantificering van zowel sterke als zwakke eiwitbanden. Dus dit protocol beschrijft de belangrijkste verbeteringen van de klassieke Western blotting methode, waarbij deze ontwikkelingen verhogen de kwaliteit van gegevens tijdens de speeltijd van dit experiment sterk verminderen.

Introduction

De techniek van Western blotting werd ontwikkeld tussen 1977 en 1979 om een betere werkwijze te creëren voor het detecteren van eiwitten met behulp van antilichamen ^1-3. Deze procedure gebruikt elektroforetische overdracht van eiwitten aan membranen van SDS-PAGE gels met doeleiwitten gevisualiseerd met secundaire antilichamen en gedetecteerd door autoradiografie, UV-licht, of een peroxidase reactieproduct ^3. Aldus dezelfde basisprincipes nog steeds veel gebruikt in de huidige Western blot protocollen. Echter, deze klassieke Western blotting techniek biedt wel veel nadelen, zoals langzame elektroforese doorlooptijden, lage resolutie en kunstmatige eiwit bands, gevoeligheid voor afbraak van eiwitten, en beperkte gevoeligheid evenals een slechte kwaliteit van de gegevens ^4. Daarom is dit protocol beschrijft significante vooruitgang en verbeteringen aan de standaard westernblotprocedure dat nauwkeuriger kwalitatieve en kwantitatieve gegevens genereert.

"> Het Laemmli voor het scheiden van een groot aantal eiwitten door SDS-PAGE is de meest gebruikte gel voor Western blotting ^5. Ondanks de populariteit van deze Western blotting systeem kan deze werkwijze leiden band vervorming, verlies van resolutie, en onechte banden ^4. Dit kan een gevolg van de deaminering en alkylering van eiwitten door de hoge pH (9,5) van de scheidende gel, re-oxidatie van gereduceerde disulfidebindingen vanwege de verschillende redox toestand van de gel, en splitsing van aspartyl-prolyl zijn peptidenbindingen vanwege het verwarmen van het eiwit in Laemmli buffer (pH 5,2) ^4,6. De Bis-Tris gel systeem, dat werkt op een neutrale pH (7.0), biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van de Lamemmli systeem. Dit systeem verbetert eiwitstabiliteit, minimaliseert eiwitmodificaties, onderhoudt eiwitten in hun verminderde staten, voorkomt aspartyl-prolyl decollete tijdens de elektroforese, en nog belangrijker, de elektroforese looptijd is 35 min. ^4,6,7. Bovendien, thij Bis-Tris gel systeem produceert ook scherpere bands, hogere resolutie en scheiding, en verhoogde gevoeligheid resulteert in meer betrouwbare gegevens ^4.

In combinatie met de Bis-Tris gelsysteem, de iBlot droge blotting systeem maakt gebruik veldsterkte en stromen aanzienlijk verminderen de transfer van eiwitten uit gelen op membranen binnen 7 min. ^8. Deze overdracht is gebaseerd op het droge blotting methode die een efficiënte en betrouwbare overdracht van eiwitten ⁸ genereert. Voor een gedetailleerde vergelijking van de werkzaamheid van het iBlot transfersysteem met de conventionele overdracht systemen verwijzen wij u naar de volgende website: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Het maakt gebruik van een anode en kathode stack, die bestaan ​​uit een gelmatrix die de passende overdracht buffers, die als ion reservoirs ⁸ bevat. Tijdens de overdracht water elektrolyse helpt voorkomen de vorming van zuurstof uit de koperanode resulteert in een consistentere proteïnetransfer zonder dat vervorming band ^8. Bovendien, deze overdracht verhoogt ook de snelheid van het verminderen van de afstand tussen de elektroden ^8.

Hoewel chemiluminescentie is de meest voorkomende en traditionele techniek voor detectie van eiwit Western blot analyse, twee-kleuren infrarood fluorescerende detectie verbetert de gevoeligheid, kwaliteit en nauwkeurigheid van Western blot data. Deze detectiemethode gebruikt infrarood laser excitatie twee optimale golflengten 700 nmen 800 nm, een duidelijke beeldgegevens met de grootste signaal-ruisverhouding en de hoogste gevoeligheid ⁹ genereren. Aldus kunnen beide doeleiwitten tegelijkertijd gevisualiseerd op hetzelfde membraan met de 700 nm en 800 nm fluorescentiedetectie kanalen. Belangrijker is dat de lineariteit en dynamische bereik van infrarood fluorescentie maakt nauwkeurige kwantitatieve analyse van zowel sterke als zwakke eiwitbanden ^9. Bovendien is dit protocol levert enorme voordelen en verbeteringen ten opzichte van de klassieke Western blotting techniek verlagen de elektroforese en overdrachtstijden van dit experiment zonder de werkzaamheid van deze processen gebruik infrarood fluorescerend eiwit detectie grotere kwalitatieve en kwantitatieve Western blot data produceren.

Protocol

1. Voorbereiding van Whole Cell Lysaten van Cultuur van de Cel Plaats celcultuurschalen op ijs en voeg koude PBS met 5 mM EDTA (bijv. 5 ml PBS met 5 mM EDTA/10 cm 2 plaat). Verwijder hechtende cellen van de schaal met een cel schraper en breng de celsuspensie aan een koude 15 ml conische buis. Pellet de celsuspensies door lage snelheid centrifugatie bij 1000 rpm (230 xg) gedurende 5 min bij 4 ° C. Plaats conische buizen op ijs en het supernatant voorzichtig zuigen zonder verstor…

Representative Results

Twee-kleuren infrarood fluorescentie detecteert zowel sterke als zwakke banden op hetzelfde membraan met verbeterde gevoeligheid en de hoogste signaal-ruisverhouding duidelijke Western blot beelden te produceren. Typische resultaten die door twee kleuren Western blot detectie gevisualiseerd in zowel de 700 nm en 800 nm fluorescentie kanalen worden toegelicht in figuren 1 en 2. De bovenste Western blot in figuur 1 toont de gelijktijdige (overlay) detectie van totaal ERK1…

Discussion

De kritische stappen in het genereren van hoge kwaliteit, kwantitatieve Western blots volgens dit protocol zijn de volgende: 1) het meten proteïneconcentraties; 2) monstervoorbereiding, 3) het blokkeren van het membraan en, 4) kwaliteit en kaliber van het primaire antilichaam.

De nauwkeurigheid van het meten van het totale eiwit-concentraties kan een grote impact hebben op het kwantificeren van eiwit bands sinds de uitzonderlijke gevoeligheid van infrarood fluorescerende detectie eventuele …

Materials

BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE® LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE® Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE® Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock® Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot® Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot®Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot®Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot® Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey® Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey® Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey® Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A