타운 웨스턴 가장 빠른 : 클래식 웨스턴 블롯 분석에 현대 트위스트
Summary
이 프로토콜은 웨스턴 블롯 분석을 수행의 최신 발전을 탐구한다. 이러한 신규 한 변형은 35 분간 전기 영동 실행 시간, 12 분 건조 블로 팅 전송 시스템, 및 고해상도, 고품질, 감도 및 서부 데이터의 개선 된 정확성을 생성하는 적외선 형광 단백질 감지 및 이미징 비스 – 트리스 겔 시스템을 이용한다.
Abstract
원래 1970 년대 후반에 설립 된 웨스턴 블롯 기술은 여전히 적극적으로 오늘날 사용된다. 그러나, 웨스턴 블로 팅의 전통적인 방법은 낮은 품질의 해상도, 가짜 밴드, 감도를 감소, 불량 단백질의 무결성을 포함 몇 가지 단점이있다. 최근 비약적으로 진보는 더 높은 질적 및 양적 데이터를 생성하기 위하여 표준 웨스턴 블롯 프로토콜의 수많은 양상을 개선했다. 비스 – 트리스 젤 시스템, 종래 램리 시스템에 대한 대안은, 저렴한 단백질 분리 및 해상도가 발생하는 단백질의 무결성을 유지하고, 35 분의 실행 시간에 전기 영동을 감소시킨다. 또한, 건조 iBlot 블롯 시스템이 극적 종종 긴 전송 시간에 더 비효율적 전통적인 단백질 전송 방법 대조적이다 7 분에서 멤브레인 단백질 전달의 효율 및 속도를 개선한다. 이 매우 혁신적인 수정, 단백질 D와 함께금 속 탐, 고품질의 적외선 형광 이미징 결과를 사용하여보다 정확하고 화학 발광의 표준 웨스턴 블로 팅 기술에 비해 데이터의 일관성. 이 기술은 동시에 다른 형광 채널에서 시각화 두 색 근적외선 염료를 이용하여, 동일한 막에 두 가지 항원을 검출 할 수있다. 또한, 형광 촬상의 선형성과 넓은 다이내믹 레인지가 강하고 약한 모두 단백질 밴드의 정확한 정량을 허용한다. 따라서,이 프로토콜은 크게이 실험의 연주 시간을 줄이면서 이러한 진보는 현저 데이터의 품질을 높일 수있는 고전 웨스턴 블랏 방법을 개선 키를 설명한다.
Introduction
웨스턴 블롯의 기술은 제 1-3 항체를 사용하여 단백질을 검출하기위한 더 나은 방법을 만들기 위해 1977 년과 1979 년 사이에 개발되었다. 이 절차는 이차 항체를 사용하여 시각 및 오토 라디오 그래피, UV 광, 또는 퍼 옥시 다제 반응 생성물 (3)에 의해 검출 된 표적 단백질과 함께 SDS-PAGE 젤에서 세포막 단백질의 전기 영동 이동을 이용했다. 따라서, 이와 같은 기본 원칙은 여전히 널리 오늘날의 서양 얼룩 프로토콜에 사용됩니다. 그러나이 고전적인 웨스턴 블로 팅 기술은 저속 전기 실행 시간, 낮은 해상도와 인공 단백질 밴드, 단백질 분해에 대한 감수성, 그리고 감도를 제한뿐만 아니라 가난한 데이터 품질 4로 존재 많은 단점을, 않습니다. 따라서,이 프로토콜은보다 정확한 정성 및 정량 데이터를 생성하는 표준 웨스턴 블롯 절차에 상당한 발전과 개선에 대해 설명합니다.
"> SDS-PAGE를 이용하여 단백질의 광범위한 분리 램리 시스템이 웨스턴 블롯 시스템의 인기에도 불구. 웨스턴 블롯 5 가장 널리 사용되는 겔 시스템이며,이 방법은 대역 왜곡, 해상도의 손실 및 초래할 수 스퓨리어스 대역 4.이 분리 겔 감소 디설파이드 겔의 다른 레 독스 상태에 의한 결합 및 아스 파르 틸-프 롤릴 개열의 재산 화의 높은 pH (9.5)에 의한 단백질의 탈 아미 노화 및 알킬화의 결과 일 수있다 램리 완충액 (pH 5.2) 4,6에서 단백질을 가열에 의한 펩티드 결합., 중성 pH (7.0)로 작동 Lamemmli 시스템에 비해 상당한 이점을 제공 비스 – 트리스 겔 시스템.이 시스템은 단백질 안정성, 최소화 향상 단백질 변형은 그들의 감소 된 상태로 유지하는 단백질을 전기 영동시 아스 파르 틸-프 롤릴 절단을 방지하고,보다 중요하게, 전기 영동 실행 시간은 t, 또. 35 분이다 4,6,7그는 비스 – 트리스 젤 시스템은 더 신뢰할 수있는 데이터 4의 결과로 선명 밴드, 더 높은 해상도와 분리, 증가 감도를 생산하고 있습니다.비스 – 트리스 젤 시스템과 함께, iBlot 드라이 블롯 시스템은 크게 7 분으로 13 시간 이내 막 상 겔로부터 단백질의 전송 시간을 줄이기 위해 높은 전계 강도와 전류를 사용한다. 이 반송 시스템은 단백질 13의보다 효율적이고 신뢰성있는 전송을 생성 건조 블로 팅 방법에 근거한다. : 기존의 전송 시스템에 iBlot 전송 시스템의 효과에 대한 자세한 비교 내용은 다음 웹 사이트를 참조하십시오 http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . 이는 이온 공기통 8 역할 적절한 전송 버퍼를 포함 겔 매트릭스로 구성되는 양극과 음극 스택을 이용한다. 전송 동안, 물 전기 분해 대역 왜곡 8시키지 않고보다 일관된 단백질 전사 초래 구리 양극으로부터 산소의 발생을 방지하는 것을 돕는다. 또한,이 반송 시스템은 또한 전극 (8) 사이의 거리를 줄임으로써 전송 속도를 증가시킨다.
화학 발광은 서양 얼룩의 단백질 검출 분석을위한 가장 일반적이고 전통적인 기법이지만, 두 컬러 적외선 형광 검출이 크게 웨스턴 블롯 데이터의 민감도, 품질과 정확도를 향상시켜줍니다. 이 검출 방법이 최적의 파장 700 nm의 적외선 레이저 여기를 사용800 nm의 최대 신호 대 잡음 비 및 높은 감도를 가진 9 클리어 데이터 이미지를 생성한다. 따라서,이 목적 단백질은 700 nm 내지 800 nm의 형광 검출 채널을 사용하는 동일한 멤브레인 동시에 가시화 될 수있다. 더 중요한 것은, 적외선 형광의 선형성 및 동적 범위는 강하고 약한 두 단백질 밴드 (9)의 정확한 정량 분석을 할 수 있습니다. 또한,이 프로토콜은 이러한 공정의 효능을 손상하고 더 정량적 웨스턴 블롯 데이터를 생성하기 위하여 적외선 형광 단백질 검출을 이용하지 않고 본 실험의 전기 및 전송 시간을 감소시킴으로써 고전 웨스턴 블로 팅 기법을 통해 엄청난 장점 및 개선을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에 따라 고품질, 정량적 웨스턴 말 생성에 중요한 단계는 다음과 같다 : 1) 단백질의 농도를 측정하는 단계 2) 샘플 준비, 3) 멤브레인을 차단하고, 4) 일차 항체의 품질과 그릇.
총 단백질 농도를 측정의 정확도는 적외선 형광 검출의 뛰어난 감도는 샘플의 단백질 농도에서 발견 된 약간의 차이를 증폭 때문에 단백질 밴드를 정량화에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. , ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 그들의 도움과 지원을 맥마흔 연구소의 모든 구성원에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 연구는 NIH / NCI R01 CA176839-01 (MM에) 및 기관 연구 및 학술 경력 개발 상 (JS에 IRACDA)에서 교부금에 의해 지원되었다.
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific/Pierce | 23225 |
| 4x NuPAGE® LDS Sample Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 |
| 10x NuPAGE® Sample Reducing Agent | Invitrogen/Life Technologies | NP0004 |
| 20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0002 |
| 20x NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0001 |
| NuPAGE® Antioxidant | Invitrogen/Life Technologies | NP0005 |
| NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well | Invitrogen/Life Technologies | NP0335BOX |
| NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well | Invitrogen/Life Technologies | NP0336BOX |
| SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5925 |
| XCell SureLock® Mini-Cell | Invitrogen/Life Technologies | EI0001 |
| iBlot® Transfer Stack, PVDF Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-01 |
| iBlot®Transfer Stack, PVDF Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-02 |
| iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-01 |
| iBlot®Transfer Stack, Nitrocellulose Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-02 |
| iBlot® Gel Transfer Device | Invitrogen/Life Technologies | IB1001 |
| β-Actin | Sigma | A2228 |
| Phospho-BIM (S69) | BD Biosciences | N/A |
| Total BIM | Epitomics | 1036-1 |
| Phospho-ERK1/2 (T202/Y204) | Cell Signaling Technology | 4370 |
| Total ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 9107 |
| Odyssey® Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32211 |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-68020 |
| Western Incubation Box, Medium | LI-COR Biosciences | 929-97205 |
| Odyssey® Classic Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A |
| Odyssey® Application Software V3.0.30 | LI-COR Biosciences | N/A |
References
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