המהיר ביותר במערב בעיר: טוויסט עכשווי על ניתוח הקלאסי הכתם המערבי
Summary
פרוטוקול זה בוחן את הפיתוחים האחרונים בביצוע ניתוחי כתם מערבי. שינויים אלה רומן להעסיק מערכת ג'ל Bis-טריס עם אלקטרופורזה לרוץ זמן 35 דקות, מערכת העברה הסופג יבשה 7 דק ', וזיהוי אינפרא אדום חלבון פלואורסצנטי והדמיה שיוצר ברזולוציה גבוהה יותר, איכות, רגישות ודיוק משופר של נתונים מערביים.
Abstract
טכניקות הכתם המערביות שהוקמו במקור בסוף 1970s עדיין מנוצלים באופן פעיל היום. עם זאת, יש שיטה מסורתית זו מערבית סופג כמה חסרונות הכוללים ברזולוציה נמוכה איכות, להקות מזויפות, ירידה ברגישות, וביושר חלבון עני. ההתקדמות שחלה באחרונה השתפרה באופן דרסטי היבטים רבים של פרוטוקול הכתם המערבי הסטנדרטי כדי לייצר מידע איכותי וכמות גבוהה יותר. מערכת ג'ל Bis-טריס, אלטרנטיבה למערכת Laemmli הקונבנציונלית, יוצרת הפרדת חלבון טובה יותר ורזולוציה, שומרת על שלמות חלבון, ומפחיתה אלקטרופורזה לזמן ריצת 35 דקות. יתר על כן, המערכת הסופג היבשה iBlot, משפרת באופן דרמטי את היעילות ומהירות של העברת חלבון על הקרום ב -7 דקות, שזה בניגוד לשיטות העברת חלבון המסורתיות, כי הם לעתים קרובות יעילים יותר עם זמני העברה ארוכים. בשילוב עם שינויים מאוד חדשניים אלה, ד החלבוןetection באמצעות תוצאות הדמיה ניאון אינפרא אדום באיכות גבוהה יותר, מדויקים יותר ונתונים עקביים בהשוואה לטכניקה המערבית סופג סטנדרטית של chemiluminescence. טכנולוגיה זו יכולה בו זמנית לזהות שני אנטיגנים שונים על אותו הקרום על ידי ניצול צבעים קרוב אינפרא אדום בשני צבעים שהם דמיינו בערוצי ניאון שונים. יתר על כן, את הליניאריות והטווח דינמי רחב של דימות פלואורסצנטי מאפשר לכימות המדויק של להקות חלבון גם חזקות וגם חלשות. לפיכך, פרוטוקול זה מתאר את שיפורי מפתח לשיטה הקלאסית המערבית סופג, שבו הפיתוחים האלה להגדיל באופן משמעותי את איכות הנתונים, תוך צמצום זמן ביצוע ניסוי זה באופן משמעותי.
Introduction
הטכניקה של מערבי סופג פותחה לראשונה בין 1977 ו -1979 כדי ליצור שיטה טובה יותר לאיתור חלבונים באמצעות נוגדני 1-3. הליך זה מנוצל העברת electrophoretic של חלבונים לממברנות מג'לי-SDS עם חלבוני היעד דמיינו באמצעות נוגדנים משני וזוהו על ידי autoradiography, אור UV, או מוצר תגובת peroxidase 3. לכן, אותם עקרונות בסיסיים אלה עדיין בשימוש נרחב בפרוטוקולי הכתם המערביים של היום. עם זאת, הטכניקה המערבית סופג הקלאסית הזה עושה חסרונות רבים בהווה, כגון פעמים איטיות ריצת אלקטרופורזה, ברזולוציה נמוכה ולהקות חלבון מלאכותיות, את רגישות לפירוק חלבונים, ורגישות מוגבלת, כמו גם איכות נתונים ירודה 4. לכן, פרוטוקול זה מתאר התקדמות ושיפורים משמעותיות להליך הכתם המערבי הסטנדרטי שמייצר נתונים איכותיים וכמותיים מדויקים יותר.
"> מערכת Laemmli להפרדת מגוון רחב של חלבונים באמצעות SDS-PAGE היא מערכת ג'ל הנפוצה ביותר למערבי סופג 5. למרות הפופולריות של מערכת מערבית סופג את זה, שיטה זו יכולה לגרום לעיוות להקה, אובדן של רזולוציה, ו להקות מזויפות 4. זה עשויה להיות תוצאה של deamination ואלקילציה של חלבונים בשל pH הגבוה (9.5) של ג'ל המפריד, reoxidation של אגרות חוב מופחתים דיסולפיד בשל מצב חיזור השונים של ג'ל, ומחשוף של aspartyl-prolyl איגרות חוב בשל חימום החלבון במאגר Laemmli (pH 5.2) 4,6 פפטיד. מערכת ג'ל Bis-טריס, הפועלת ב-pH ניטראלי (7.0), מספקת יתרונות משמעותיים על פני מערכת Lamemmli. מערכת זו משפרת את יציבות חלבון, ממזערת שינויי חלבון, שומר על חלבונים במדינות מופחתות שלהם, מונעים מחשוף aspartyl-prolyl במהלך אלקטרופורזה, ויותר חשוב מכך, בפעם אלקטרופורזה להפעיל היא 35 4,6,7 דקות. בנוסף, לאמערכת ג'ל הוא Bis-טריס גם מייצרת להקות חדות יותר, רזולוציה והפרדה גבוהות יותר, ורגישות מוגברת וכתוצאה מכך הנתונים אמינים יותר 4.בשיתוף עם מערכת הג'ל Bis-טריס, המערכת הסופג היבשה iBlot משתמשת בעוצמת שדה גבוהה וזרמים כדי להפחית באופן משמעותי את זמן ההעברה של חלבונים מן ג'לים על גבי קרומים תוך 7 דקות 8. מערכת העברה זו מבוססת על השיטה הסופג היבשה שיוצרת העברה יותר יעילה ואמינה של חלבונים 8. להשוואה מפורטת של היעילות של מערכת העברת iBlot למערכות העברה הקונבנציונלית עיינו באתר האינטרנט הבא: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . הוא מנצל ערימת האנודה וקתודה, אשר מורכבות ממטריצת ג'ל המכילה מאגרי ההעברה המתאימים, המשמשים כמאגרי יון 8. במהלך ההעברה, אלקטרוליזה של מים מסייעת במניעת הדור של חמצן מן האנודה הנחושת וכתוצאה מכך העברת חלבון עקבית יותר מבלי לגרום לעיוות להקת 8. יתר על כן, מערכת העברה זו גם מגדילה את מהירות העברה על ידי צמצום המרחק בין האלקטרודות 8.
למרות chemiluminescence היא הטכניקה הנפוצה והמסורתית ביותר לגילוי חלבון של כתם המערבי מנתח, גילוי ניאון אינפרא אדום בשני צבעים משפר באופן משמעותי את הרגישות, איכות ודיוק נתוני כתם המערביים. שיטת זיהוי זה משתמשת בעירור לייזר אינפרא אדום בשני אורכי גל אופטימליים, 700 ננומטרו800 ננומטר, כדי ליצור תמונת נתונים ברורה עם היחס הגדול ביותר אות לרעש והרגישות הגבוהה ביותר 9. לפיכך, ניתן דמיינו שני חלבוני היעד בו זמנית על אותו הקרום באמצעות ננומטר 700 ו800 ערוצי גילוי ניאון ננומטר. וחשוב יותר, את הליניאריות והטווח דינמי של הקרינה אינפרא אדום מאפשר ניתוח כמות מדויק של להקות חלבון גם חזקות וגם חלשות 9. יתר על כן, פרוטוקול זה מספק יתרונות ושיפורים עצומים על פני הטכניקה מערבית סופג הקלאסית על ידי הפחתת אלקטרופורזה וזמני העברה של ניסוי זה מבלי להתפשר על היעילות של תהליכים אלה וניצול זיהוי חלבון פלואורסצנטי אינפרא אדום כדי לייצר נתונים כתם גדולים יותר איכותיים וכמותית מערביים.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלבים הקריטיים ביצירה באיכות גבוהה, כתמים מערביים כמותיים על פי פרוטוקול זה את הדברים הבאים: 1) מדידת ריכוזי חלבון, 2) הכנת מדגם; 3) חוסמים את הקרום ו; 4) איכות ורמה של הנוגדן הראשוני.
הדיוק של מדידה הכולל ריכוזי חלבון יכול להיות השפע?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לכל חברי המעבדה מקמהון לסיוע והתמיכה שלהם. מחקר זה נתמך על ידי מענקים מR01 CA176839-01 NIH / NCI (לMM) ופרס מחקר מוסדי ואקדמי לפיתוח קריירה (IRACDA לJS).
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific/Pierce | 23225 |
| 4x NuPAGE® LDS Sample Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0007 |
| 10x NuPAGE® Sample Reducing Agent | Invitrogen/Life Technologies | NP0004 |
| 20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0002 |
| 20x NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer | Invitrogen/Life Technologies | NP0001 |
| NuPAGE® Antioxidant | Invitrogen/Life Technologies | NP0005 |
| NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well | Invitrogen/Life Technologies | NP0335BOX |
| NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well | Invitrogen/Life Technologies | NP0336BOX |
| SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard | Invitrogen/Life Technologies | LC5925 |
| XCell SureLock® Mini-Cell | Invitrogen/Life Technologies | EI0001 |
| iBlot® Transfer Stack, PVDF Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-01 |
| iBlot®Transfer Stack, PVDF Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB4010-02 |
| iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose Regular | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-01 |
| iBlot®Transfer Stack, Nitrocellulose Mini | Invitrogen/Life Technologies | IB3010-02 |
| iBlot® Gel Transfer Device | Invitrogen/Life Technologies | IB1001 |
| β-Actin | Sigma | A2228 |
| Phospho-BIM (S69) | BD Biosciences | N/A |
| Total BIM | Epitomics | 1036-1 |
| Phospho-ERK1/2 (T202/Y204) | Cell Signaling Technology | 4370 |
| Total ERK1/2 | Cell Signaling Technology | 9107 |
| Odyssey® Blocking Buffer | LI-COR Biosciences | 927-40000 |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32211 |
| IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-68020 |
| Western Incubation Box, Medium | LI-COR Biosciences | 929-97205 |
| Odyssey® Classic Imaging System | LI-COR Biosciences | N/A |
| Odyssey® Application Software V3.0.30 | LI-COR Biosciences | N/A |
References
- Burnette, W. N. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal. Biochem. 112, 195-203 (1981).
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 3116-3120 (1979).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).
- . . NuPAGE Technical Guide. Life Technologies Corporation. IM-1001. 60, (2010).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Kubo, K. Effect of incubation of solutions of proteins containing dodecyl sulfate on the cleavage of peptide bonds by boiling. Anal. Biochem. 225, 351-353 (1995).
- Moos, M., Nguyen, N. Y., Liu, T. Y. Reproducible high yield sequencing of proteins electrophoretically separated and transferred to an inert support. J. Biol. Chem. 263, 6005-6008 (1988).
- . iBlot Dry Blotting System. Life Technologies Corporation. 25-0911, 84 (2012).
- . Western Blot Analysis. LI-COR Biosciences. 988-12622, (2012).
- . Odyssey Infrared Imaging System Application Software Version 3.030. LI-COR Biosciences. , (2007).
- Hambaeus, L. Human Milk Composition. Clin. Nutr. 54, 219-236 (1984).
- DenHollander, N., Befus, D. Loss of antigens from immunoblotting membranes. J. Immunol. Methods. 122, 129-135 (1989).
