Il più veloce occidentale in città: un tocco contemporaneo alla classica analisi Western Blot

Summary

Questo protocollo esplora le ultime innovazioni in esecuzione di analisi di Western Blot. Queste nuove modifiche impiegano un sistema gel Bis-Tris con elettroforesi eseguire tempo 35 min, un sistema di trasferimento blotting secco 7 min, e infrarossi rilevamento proteina fluorescente e di imaging che genera maggiore risoluzione, qualità, sensibilità e maggiore precisione dei dati occidentali.

Abstract

Le tecniche di Western Blot che sono stati originariamente stabiliti alla fine del 1970 sono ancora attivamente utilizzati oggi. Tuttavia, questo metodo tradizionale di Western blotting ha diversi inconvenienti che includono risoluzione bassa qualità, bande spurie, diminuita sensibilità e integrità proteina poveri. I recenti progressi hanno drasticamente migliorato numerosi aspetti del protocollo Western Blot standard per la produzione di dati qualitativi e quantitativi più elevati. Il sistema gel Bis-Tris, in alternativa al sistema Laemmli convenzionale, genera una migliore separazione delle proteine ​​e risoluzione, mantiene l'integrità proteine, e riduce elettroforesi per un tempo di 35 min di esecuzione. Inoltre, il sistema blotting secco iBlot, migliora notevolmente l'efficacia e la velocità di trasferimento proteina alla membrana in 7 min, che è in contrasto con i tradizionali metodi di trasferimento proteine ​​che sono spesso più inefficiente con lunghi tempi di trasferimento. In combinazione con queste modifiche altamente innovative, proteine ​​detection utilizzando risultati di imaging fluorescente infrarosso in qualità superiore, più accurato e dati coerenti rispetto alla tecnica Western blotting tenore di chemiluminescenza. Questa tecnologia può rilevare simultaneamente due antigeni differenti sullo stesso membrana utilizzando due colori coloranti vicino infrarosso che vengono visualizzati in canali fluorescenti differenti. Inoltre, la linearità e la gamma dinamica di immagini fluorescenti consente per la quantificazione precisa di bande proteiche sia forti e deboli. Così, questo protocollo descrive i principali miglioramenti al classico metodo di Western blotting, in cui questi progressi aumentano notevolmente la qualità dei dati riducendo notevolmente il tempo di esecuzione di questo esperimento.

Introduction

La tecnica del Western blotting è stato sviluppato tra il 1977 e il 1979 al fine di creare un metodo migliore per rilevare proteine ​​utilizzando anticorpi ^1-3. Questa procedura utilizzata trasferimento elettroforetico delle proteine ​​di membrane da gel SDS-PAGE con proteine ​​bersaglio visualizzati usando anticorpi secondari e rilevati mediante autoradiografia, luce UV, o un prodotto di reazione perossidasi ^3. Così, questi stessi principi di base sono ancora ampiamente utilizzati in protocolli di Western blot di oggi. Tuttavia, questa tecnica classica Western blotting fa presenti molti svantaggi, quali tempi lenti corsa elettroforetica, bassa risoluzione e bande proteiche artificiali, suscettibilità alla degradazione delle proteine, e limitata sensibilità nonché scarsa qualità dei dati ^4. Pertanto, questo protocollo descrive progressi e miglioramenti significativi alla procedura di Western Blot standard che genera dati qualitativi e quantitativi più precisi.

"> Il sistema di Laemmli per separare una vasta gamma di proteine ​​mediante SDS-PAGE è il sistema gel più utilizzato per Western blotting ^5. Nonostante la popolarità di questo sistema di Western blotting, questo metodo può portare a una distorsione band, perdita di risoluzione, e bande spurie ^4. Questa può essere una conseguenza della deaminazione e alchilazione di proteine ​​a causa del pH elevato (9.5) del gel di separazione, riossidazione di legami disolfuro ridotto grazie alla variabile di stato redox del gel e scissione di aspartil-prolil prestiti stessi al riscaldamento della proteina in tampone Laemmli (pH 5,2) ^4,6 peptidici. Il sistema gel Bis-Tris, che opera ad un pH neutro (7.0), fornisce vantaggi significativi rispetto al sistema Lamemmli. Questo sistema migliora la stabilità della proteina, minimizza modificazioni delle proteine, mantiene le proteine ​​nei loro stati ridotti, impedisce aspartyl-prolyl scissione durante l'elettroforesi, e, soprattutto, il tempo di elettroforesi familiare è 35 min ^4,6,7. Inoltre, tSistema di gel lui Bis-Tris produce anche fasce più nitide, maggiore risoluzione e separazione, e una maggiore sensibilità conseguente dati più affidabili ^4.

In combinazione con il sistema gel Bis-Tris, il sistema blotting secco iBlot utilizza alta intensità di campo e le correnti di ridurre significativamente il tempo di trasferimento delle proteine ​​dal gel su membrane in 7 min ^8. Questo sistema di trasferimento si basa sul metodo blotting secco che genera un trasferimento più efficiente e affidabile di proteine ^​​8. Per un confronto dettagliato dell'efficacia del sistema di trasferimento iBlot ai sistemi di trasferimento convenzionali consultare il seguente sito web: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Protein-Expression-and-Analysis/Western-Blotting/Western-Blot-Transfer/iBlot-Dry-Blotting-System/iBlot-Dry-Blotting-Comparison-to-Semi-Dry-and-Wet.html . Si utilizza uno stack anodo e catodo, che sono costituiti da una matrice di gel contenente i buffer di trasferimento appropriate, che fungono da serbatoi di litio ^8. Durante il trasferimento, elettrolisi dell'acqua aiuta a prevenire la generazione di ossigeno dall'anodo rame conseguente trasferimento proteina più coerente senza causare distorsioni banda ^8. Inoltre, questo sistema di trasferimento aumenta anche la velocità di trasferimento riducendo la distanza tra gli elettrodi ^8.

Anche se chemiluminescenza è la tecnica più comune e tradizionale per la rilevazione della proteina di Western Blot analisi, rilevazione fluorescente a raggi infrarossi a due colori migliora notevolmente la sensibilità, la qualità e l'accuratezza dei dati Western Blot. Questo metodo di rilevamento utilizza infrarossi eccitazione laser in due lunghezze d'onda ottimali, 700 nme 800 nm, per generare un'immagine chiara dati con il massimo rapporto segnale-rumore e massima sensibilità ^9. Così, due proteine ​​bersaglio possono essere visualizzate contemporaneamente sulla stessa membrana utilizzando il 700 nm e 800 nm canali di rilevamento fluorescenti. Ancora più importante, la linearità e la gamma dinamica di fluorescenza a raggi infrarossi permette di precisa analisi quantitativa sia forti e deboli bande proteiche ^9. Inoltre, questo protocollo fornisce enormi vantaggi e miglioramenti rispetto alla classica tecnica Western blotting diminuendo l'elettroforesi e tempi di trasferimento di questo esperimento senza compromettere l'efficacia di questi processi e utilizzando rilevazione proteina fluorescente infrarosso per produrre maggiori dati di Western blot qualitativi e quantitativi.

Protocol

1. Preparazione dei lisati cellulari intero di coltura cellulare Posizionare cellule di coltura piatti su ghiaccio e aggiungere PBS freddo con 5 mM EDTA (es. 5 ml di PBS con 5 EDTA/10 mm cm 2 piastra). Rimuovere le cellule aderenti dal piatto usando un raschietto cellulare e poi trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml freddo. Agglomerare le sospensioni di cellule per centrifugazione a bassa velocità a 1000 rpm (230 xg) per 5 minuti a 4 ° C. Mettere tubi con…

Representative Results

Due colori di fluorescenza a raggi infrarossi rileva bande sia forti e deboli sulla stessa membrana con una maggiore sensibilità e il più alto rapporto segnale-rumore per produrre immagini chiare di Western blot. I risultati tipici generati da due colori rilevamento Western blot visualizzato sia nel 700 nm e 800 nm canali fluorescenti sono esemplificati nelle figure 1 e 2. Il Western blot superiore nella Figura 1 mostra la concomitante (overlay) rivelazione di totale …

Discussion

I passaggi critici nella generazione di alta qualità, macchie occidentali quantitativi in ​​base a questo protocollo sono i seguenti: 1) misurare le concentrazioni di proteine, 2) la preparazione del campione; 3) bloccando la membrana e, 4) qualità e calibro dell'anticorpo primario.

La precisione della misurazione delle concentrazioni di proteine ​​totali può avere un impatto importante sulla quantificazione bande proteiche in quanto la eccezionale sensibilità di rilevazione …

Materials

BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific/Pierce	23225
4x NuPAGE® LDS Sample Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0007
10x NuPAGE® Sample Reducing Agent	Invitrogen/Life Technologies	NP0004
20x NuPAGE® MES SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0002
20x NuPAGE® MOPS SDS Running Buffer	Invitrogen/Life Technologies	NP0001
NuPAGE® Antioxidant	Invitrogen/Life Technologies	NP0005
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 10 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0335BOX
NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris Gel 1.5 mm, 15 well	Invitrogen/Life Technologies	NP0336BOX
SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard	Invitrogen/Life Technologies	LC5925
XCell SureLock® Mini-Cell	Invitrogen/Life Technologies	EI0001
iBlot® Transfer Stack, PVDF Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-01
iBlot®Transfer Stack, PVDF Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB4010-02
iBlot® Transfer Stack, Nitrocellulose Regular	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-01
iBlot®Transfer Stack, Nitrocellulose Mini	Invitrogen/Life Technologies	IB3010-02
iBlot® Gel Transfer Device	Invitrogen/Life Technologies	IB1001
β-Actin	Sigma	A2228
Phospho-BIM (S69)	BD Biosciences	N/A
Total BIM	Epitomics	1036-1
Phospho-ERK1/2 (T202/Y204)	Cell Signaling Technology	4370
Total ERK1/2	Cell Signaling Technology	9107
Odyssey® Blocking Buffer	LI-COR Biosciences	927-40000
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG	LI-COR Biosciences	926-32211
IRDye 680LT Goat anti-Mouse IgG	LI-COR Biosciences	926-68020
Western Incubation Box, Medium	LI-COR Biosciences	929-97205
Odyssey® Classic Imaging System	LI-COR Biosciences	N/A
Odyssey® Application Software V3.0.30	LI-COR Biosciences	N/A