بسيط وبروتوكول السريع لقياس الدهون في خلايا الطحالب المحايدة عن طريق الإسفار
Summary
يوصف بروتوكول بسيط لتحديد محتوى الدهن محايدة من خلايا الطحالب باستخدام إجراء تلطيخ النيل الأحمر. هذه التقنية لتوفير الوقت يوفر بديلا للدهون البروتوكولات التقليدية الكمي القائم على الجاذبية. وقد تم تصميمه لتطبيق معين من الأداء رصد العمليات الحيوية.
Abstract
وتعتبر الطحالب المرشحين ممتازة لمصادر الوقود المتجددة بسبب قدرات التخزين الدهون الطبيعية. مراقبة قوية من عمليات التخمير الطحالب والكشف عن سلالات الغنية بالنفط الجديد يتطلب بروتوكول سريعة وموثوق بها لتحديد محتوى الدهون داخل الخلايا. الممارسات الحالية تعتمد إلى حد كبير على أساليب الجاذبية لتحديد نسبة الزيت، وضعت التقنيات منذ عقود التي هي مضيعة للوقت وتتطلب كميات عينة كبيرة. في هذه الورقة، يتم تضمينها النيل الأحمر، صبغة الفلورسنت التي تم استخدامها لتحديد وجود هيئات الدهون في أنواع عديدة من الكائنات الحية، إلى بروتوكول بسيطة وسريعة، وموثوقة لقياس المحتوى الدهني محايدة من protothecoides Auxenochlorella، خضراء الطحالب. يستخدم الأسلوب الإيثانول، مذيب خفيف نسبيا، لpermeabilize غشاء الخلية قبل تلطيخ و96 جيدا لوحة صغيرة لزيادة القدرة عينة خلال قياسات كثافة مضان. فقد كان تصميمإد مع تطبيق معين من الأداء رصد العمليات الحيوية. عينات المجففة سابقا أو عينات حية من ثقافة متنامية يمكن أن تستخدم في الفحص.
Introduction
نظرا لقدرتها على تخزين الدهون تحت بعض الهيئات ظروف الإجهاد، تلقى الطحالب قدرا كبيرا من الاهتمام في السنوات الأخيرة كمصدر للوقود المتجددة المحتملة 1،2. يمكن أن الدهون محايدة تمثل أكثر من 60٪ من الوزن الجاف خلية في ظل ظروف النمو المناسبة 3. بعد صناعة لايوجد بروتوكول موحد بسيطة ونظيفة وسريعة، وموثوق بها ل quantitate المحتوى الدهني للخلايا الطحالب من أجل رصد أداء العمليات الحيوية بشكل صحيح وتحليل الثقافات، وشاشة لسلالات جديدة.
تطوير أسلوب بليغ-داير الجاذبية منذ نحو 50 عاما لا تزال من بين الأساليب الأكثر شيوعا المستخدمة اليوم 4،5. في حين أن هذا الإجراء هو بسيط وموثوق بها، ويسهل حملها خارج، وأنها تستغرق وقتا طويلا، يتطلب حجم العينة كبير، ويجعل من استخدام المذيبات السامة. أنه ليس من العملي لتحليل العديد من العينات من شوط التخمير أو الكشف عن سلالات جديدة الغنية بالنفط. أساليب أخرى قد بالتابعين المتقدمة، ولكن عادة ما تتطلب المعدات المتطورة والتي لم يتم توحيدها 6.
البديل الذي قد حصل قدرا كبيرا من الاهتمام هو وصمة عار النيل الأحمر. وقد النيل الأحمر، وهي الصبغة التي تتفلور تفضيلي في بيئات غير القطبية، وتستخدم لتحديد أو تقدير الهيئات الدهون في الكائنات المختلفة بما في ذلك الديدان الخيطية 7، 8 الخميرة والبكتيريا 9، والطحالب 10-19. كانت التقنيات الأولية التي تنطوي على النيل الأحمر الغالب النوعي أو شبه الكمي، والجمع بين وصمة عار مع واحد أو القياس الطيفي كفيت التدفق الخلوي. بالإضافة إلى ذلك، بعض الفئات من الطحالب مثل الطحالب الخضراء لديهم آبار الخلية سميكة التي هي غير منفذة في الغالب إلى الصبغة، والتي تقتصر على مجموعة من تقنية 10.
وقد تم الإبلاغ عن التحسينات الأخيرة إلى أسلوب تلطيخ النيل الأحمر أن تجاوز أوجه القصور الأولي للبروتوكول 10،11. تلطيخ الخلايا في وجود كارهيئة الإنصاف والمصالحة المذيبات مثل DMSO 10 أو الإيثانول 10،11 linearizes العلاقة بين محتوى الزيت والامتصاصية، والسماح لقياسات كمية موثوق بها. المذيب يساعد permeabilize غشاء الخلية بحيث تكون جزيئات النيل الأحمر يمكن أن تمر من خلال. بالإضافة إلى ذلك، يشتمل على معمل مع قدرات القراءة لوحة صغيرة تمكن بروتوكولات إنتاجية عالية مناسبة للتحليل الكمي.
في هذه المادة ونحن من التفصيل طريقة بسيطة لقياس نسبة الزيت من الخلايا الطحلبية التي كتبها تلطيخ الثقافات مع النيل الأحمر في حضور الإيثانول، مذيب خفيف. من أجل معظم بدقة تمثل الضوضاء الخلفية في القياسات، تم تطوير منحنى القياسية ربط كثافة مضان لمحتوى الزيت باستخدام خلايا الطحالب من تكوين النفط المعروفة. ويتم تكييف طريقة من البروتوكولات نشرت سابقا 10،11. باستخدام مطياف 96 جيدا، هو واحد قادرا على تحليل نفس الكمية من العينات في ثا ساعةر سيستغرق يوما لمراقبة من قبل وسائل الجاذبية. وعلاوة على ذلك، من خلال معايرة باستخدام عينات تمثيلية من أنواع الطحالب المطلوبة هذه الطريقة تنتج قياسات دقيقة نسبيا التي هي للتفسير مباشرة. توجد العديد من البروتوكولات تحدد أساليب تلطيخ مع الطحالب النيل الأحمر الأمثل لسلالات والتطبيقات المختلفة؛ بروتوكول المعروضة هنا وضعت أصلا من قبل دي لا هوز سيجلر وآخرون 11 لprotothecoides Auxenochlorella، شلوريلا الشائع، Scenedesmus dimorphus، وScenedesmus المائلة، على الرغم من انها مناسبة المرجح لعدد أكبر من الأنواع والطبقات. قد تم تصميمه مع تطبيق معين من رصد الأداء والعمليات الحيوية أنها تعمل بشكل جيد على قدم المساواة للعينات المجففة سابقا وعينات الرطب من ثقافة متنامية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يجب أن تكون الطحالب المستخدمة في منحنى القياسية نفس الأنواع المزروعة تحت نفس الظروف التجريبية مثل تلك التي يجري قياسها. تغييرات كبيرة في تكوين وسائل الإعلام، وتقنية زراعة، وبروتوكول تلطيخ يمكن أن تؤثر على شدة القراءة مضان. وقد استخدم استخراج الهكسان (الموصوفة في ال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا لتوفير الدعم المالي لهذا المشروع.
Materials
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur Glass Pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (Alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
- Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).
- . National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy. U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , (2010).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy. Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Hara, A., Radin, N. S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent. Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).
- Han, Y., et al. Review of methods used for microalgal lipid-content analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
- Pino, E. C., et al. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).
- Izard, J., Limberger, R. J. Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells. J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).
- Chen, W., et al. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures. Algal Res. 1, 176-184 (2012).
- de la Jara, A., et al. Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii. J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).
- Elsey, D., et al. Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids. J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).
- Feng, G. -. D., et al. Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination. Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).
- Guzmán, H., et al. Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions. Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).
- Huang, G. -. H., et al. Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence. Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).
- Lee, S., et al. Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii. Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).
- Montero, M., et al. Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting. J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).
- Vigeolas, H., et al. Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus. J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).
- Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. J. Microbiol. Meth. 87, 17-23 (2011).
- Kou, Z., et al. Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii. J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).
