يوصف بروتوكول بسيط لتحديد محتوى الدهن محايدة من خلايا الطحالب باستخدام إجراء تلطيخ النيل الأحمر. هذه التقنية لتوفير الوقت يوفر بديلا للدهون البروتوكولات التقليدية الكمي القائم على الجاذبية. وقد تم تصميمه لتطبيق معين من الأداء رصد العمليات الحيوية.
وتعتبر الطحالب المرشحين ممتازة لمصادر الوقود المتجددة بسبب قدرات التخزين الدهون الطبيعية. مراقبة قوية من عمليات التخمير الطحالب والكشف عن سلالات الغنية بالنفط الجديد يتطلب بروتوكول سريعة وموثوق بها لتحديد محتوى الدهون داخل الخلايا. الممارسات الحالية تعتمد إلى حد كبير على أساليب الجاذبية لتحديد نسبة الزيت، وضعت التقنيات منذ عقود التي هي مضيعة للوقت وتتطلب كميات عينة كبيرة. في هذه الورقة، يتم تضمينها النيل الأحمر، صبغة الفلورسنت التي تم استخدامها لتحديد وجود هيئات الدهون في أنواع عديدة من الكائنات الحية، إلى بروتوكول بسيطة وسريعة، وموثوقة لقياس المحتوى الدهني محايدة من protothecoides Auxenochlorella، خضراء الطحالب. يستخدم الأسلوب الإيثانول، مذيب خفيف نسبيا، لpermeabilize غشاء الخلية قبل تلطيخ و96 جيدا لوحة صغيرة لزيادة القدرة عينة خلال قياسات كثافة مضان. فقد كان تصميمإد مع تطبيق معين من الأداء رصد العمليات الحيوية. عينات المجففة سابقا أو عينات حية من ثقافة متنامية يمكن أن تستخدم في الفحص.
نظرا لقدرتها على تخزين الدهون تحت بعض الهيئات ظروف الإجهاد، تلقى الطحالب قدرا كبيرا من الاهتمام في السنوات الأخيرة كمصدر للوقود المتجددة المحتملة 1،2. يمكن أن الدهون محايدة تمثل أكثر من 60٪ من الوزن الجاف خلية في ظل ظروف النمو المناسبة 3. بعد صناعة لايوجد بروتوكول موحد بسيطة ونظيفة وسريعة، وموثوق بها ل quantitate المحتوى الدهني للخلايا الطحالب من أجل رصد أداء العمليات الحيوية بشكل صحيح وتحليل الثقافات، وشاشة لسلالات جديدة.
تطوير أسلوب بليغ-داير الجاذبية منذ نحو 50 عاما لا تزال من بين الأساليب الأكثر شيوعا المستخدمة اليوم 4،5. في حين أن هذا الإجراء هو بسيط وموثوق بها، ويسهل حملها خارج، وأنها تستغرق وقتا طويلا، يتطلب حجم العينة كبير، ويجعل من استخدام المذيبات السامة. أنه ليس من العملي لتحليل العديد من العينات من شوط التخمير أو الكشف عن سلالات جديدة الغنية بالنفط. أساليب أخرى قد بالتابعين المتقدمة، ولكن عادة ما تتطلب المعدات المتطورة والتي لم يتم توحيدها 6.
البديل الذي قد حصل قدرا كبيرا من الاهتمام هو وصمة عار النيل الأحمر. وقد النيل الأحمر، وهي الصبغة التي تتفلور تفضيلي في بيئات غير القطبية، وتستخدم لتحديد أو تقدير الهيئات الدهون في الكائنات المختلفة بما في ذلك الديدان الخيطية 7، 8 الخميرة والبكتيريا 9، والطحالب 10-19. كانت التقنيات الأولية التي تنطوي على النيل الأحمر الغالب النوعي أو شبه الكمي، والجمع بين وصمة عار مع واحد أو القياس الطيفي كفيت التدفق الخلوي. بالإضافة إلى ذلك، بعض الفئات من الطحالب مثل الطحالب الخضراء لديهم آبار الخلية سميكة التي هي غير منفذة في الغالب إلى الصبغة، والتي تقتصر على مجموعة من تقنية 10.
وقد تم الإبلاغ عن التحسينات الأخيرة إلى أسلوب تلطيخ النيل الأحمر أن تجاوز أوجه القصور الأولي للبروتوكول 10،11. تلطيخ الخلايا في وجود كارهيئة الإنصاف والمصالحة المذيبات مثل DMSO 10 أو الإيثانول 10،11 linearizes العلاقة بين محتوى الزيت والامتصاصية، والسماح لقياسات كمية موثوق بها. المذيب يساعد permeabilize غشاء الخلية بحيث تكون جزيئات النيل الأحمر يمكن أن تمر من خلال. بالإضافة إلى ذلك، يشتمل على معمل مع قدرات القراءة لوحة صغيرة تمكن بروتوكولات إنتاجية عالية مناسبة للتحليل الكمي.
في هذه المادة ونحن من التفصيل طريقة بسيطة لقياس نسبة الزيت من الخلايا الطحلبية التي كتبها تلطيخ الثقافات مع النيل الأحمر في حضور الإيثانول، مذيب خفيف. من أجل معظم بدقة تمثل الضوضاء الخلفية في القياسات، تم تطوير منحنى القياسية ربط كثافة مضان لمحتوى الزيت باستخدام خلايا الطحالب من تكوين النفط المعروفة. ويتم تكييف طريقة من البروتوكولات نشرت سابقا 10،11. باستخدام مطياف 96 جيدا، هو واحد قادرا على تحليل نفس الكمية من العينات في ثا ساعةر سيستغرق يوما لمراقبة من قبل وسائل الجاذبية. وعلاوة على ذلك، من خلال معايرة باستخدام عينات تمثيلية من أنواع الطحالب المطلوبة هذه الطريقة تنتج قياسات دقيقة نسبيا التي هي للتفسير مباشرة. توجد العديد من البروتوكولات تحدد أساليب تلطيخ مع الطحالب النيل الأحمر الأمثل لسلالات والتطبيقات المختلفة؛ بروتوكول المعروضة هنا وضعت أصلا من قبل دي لا هوز سيجلر وآخرون 11 لprotothecoides Auxenochlorella، شلوريلا الشائع، Scenedesmus dimorphus، وScenedesmus المائلة، على الرغم من انها مناسبة المرجح لعدد أكبر من الأنواع والطبقات. قد تم تصميمه مع تطبيق معين من رصد الأداء والعمليات الحيوية أنها تعمل بشكل جيد على قدم المساواة للعينات المجففة سابقا وعينات الرطب من ثقافة متنامية.
يجب أن تكون الطحالب المستخدمة في منحنى القياسية نفس الأنواع المزروعة تحت نفس الظروف التجريبية مثل تلك التي يجري قياسها. تغييرات كبيرة في تكوين وسائل الإعلام، وتقنية زراعة، وبروتوكول تلطيخ يمكن أن تؤثر على شدة القراءة مضان. وقد استخدم استخراج الهكسان (الموصوفة في ال?…
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا لتوفير الدعم المالي لهذا المشروع.
Dry Weight | |||
25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
1.5 ml micro-centrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
Gravimetric Quantification | |||
Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
Pasteur Glass Pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
Hexanes | Fisher | H292-4 | |
Fluorometric quantification of oil content | |||
Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
Ethanol (Alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
Imaging Fluorescent cells | |||
Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |