פשוט ומהיר פרוטוקול למדידת שומנים ניטרלי בתאי אצות באמצעות הקרינה
Summary
פרוטוקול פשוט כדי לקבוע את תוכן שומנים הניטרלי של תאי אצות באמצעות הליך מכתים הנילוס אדום מתואר. טכניקה לחיסכון בזמן זה מציעה אלטרנטיבה לפרוטוקולי כימות מסורתיים מבוסס gravimetric שומנים בדם. זה תוכנן עבור היישום הספציפי של ביצועי Bioprocess הניטור.
Abstract
אצות נחשבות מועמדים מצוינים למקורות דלק מתחדשים בשל יכולות אחסון שומנים הטבעיים שלהם. ניטור חזק של תהליכי תסיסה של אצות והקרנה לזנים עשירים בנפט חדש מחייב פרוטוקול מהיר ואמין לקביעת תוכן שומנים תאיים. שיטות קיימות כיום מסתמכות במידה רבה על שיטות gravimetric כדי לקבוע תכולת שמן, טכניקות שפותחו לפני עשרות שנים, כי הם זמן רב ודורשות כמויות מדגם גדולות. במאמר זה, הנילוס האדום, צבע פלואורסצנטי שכבר נעשה שימוש כדי לזהות את נוכחותם של גופי שומנים בסוגים רבים של אורגניזמים, הוא שולב בפרוטוקול פשוט, מהיר, ואמין למדידת התוכן הניטרלי שומנים של protothecoides Auxenochlorella, ירוק אצה. השיטה משתמשת אתנול, ממס מתון יחסית, לpermeabilize קרום התא לפני הצביעה ו96 גם מיקרו צלחת כדי להגדיל את קיבולת המדגם במהלך מדידות עוצמת הקרינה. זה כבר עיצובאד עם היישום הספציפי של ביצועי Bioprocess הניטור. דגימות מיובשות בעבר או דוגמאות חיות מתרבות הולך וגדל ניתן להשתמש בassay.
Introduction
בשל יכולתם כדי לאחסן גופי שומנים בדם בתנאי לחץ מסוימים, אצות קיבלו תשומת לב רבה בשנים האחרונות כמקור דלק מתחדש פוטנציאל 1,2. שומנים ניטראליים יכולים להסביר מעל 60% מהמשקל היבש של התאים בתנאי גידול מתאימים 3. עם זאת, התעשייה אין פרוטוקול סטנדרטי פשוט, נקי, מהיר, אמין ולכמת תוכן שומנים של תאי אצות על מנת לפקח כראוי ביצועי Bioprocess, לנתח תרבויות, ומסך לזנים חדשים.
שיטת gravimetric בליי-דייר שפותחה לפני כמה שנים 50 נותרת בין הטכניקות הנפוצות ביותר בשימוש כיום 4,5. בעוד הליך זה הוא פשוט, אמין, וקל לביצוע, זה זמן רב, מחייב כרכי מדגם גדולים, ועושה שימוש בחומרים רעילים. זה לא מעשי לניתוח דגימות רבות מריצת תסיסה או הקרנה לזנים עשיר בנפט חדש. בשיטות אחרות יש בeen מפותח, אבל בדרך כלל דורש ציוד מתקדם ולא תוקננו 6.
אלטרנטיבה שצברה עניין רב היא כתם הנילוס האדום. הנילוס האדום, צבע שהמאיר מעדיף בסביבות שאינן קוטביות, בו נעשה שימוש כדי לזהות או לכמת גופי שומנים באורגניזמים שונים, כולל נמטודות 7, 8 שמרים, חיידקים 9, ואצות 10-19. טכניקות ראשוניות מעורבת הנילוס האדום היו בעיקר איכותיות או חצי כמותית, המשלבות את הכתם עם spectrophotometry היחיד קובט או cytometry זרימה. בנוסף, יש כמה סוגים של אצות כגון אצות ירוקות בארות תא עבות המכילות בעיקר בלתי חדירים לצבע, שהגביל את הטווח של הטכניקה 10.
השיפורים אחרונים בשיטת צביעת הנילוס האדומה כבר דיווחו העוקפים את החסרונות הראשוניים של הפרוטוקול 10,11. מכתים את התאים בנוכחות קארier ממס כגון DMSO 10 או 10,11 אתנול linearizes הקשר בין תכולת שמן וספיג, המאפשר מדידות כמותיות אמינות. הממס עוזר permeabilize קרום התא, כך שמולקולות הנילוס האדומים יכולות לעבור דרכו. בנוסף, שילוב ספקטרופוטומטר עם יכולות קריאת מיקרו צלחת מאפשר פרוטוקולי תפוקה גבוהים המתאימים לניתוח כמוני.
בפירוט שמאמר זה שיטה פשוטה למדידת תכולת שמן של תאי אצות על ידי צביעת תרבויות עם הנילוס האדום בנוכחות של אתנול, ממס מתון. על מנת אופן מדויק ביותר להסביר את רעש רקע במדידות, עקומת סטנדרט מקשרת עוצמת הקרינה לתוכן שמן היא פותח באמצעות תאי אצות של הרכב נפט ידוע. השיטה מותאמת מפרוטוקולים שפורסמו בעבר 10,11. באמצעות ספקטרופוטומטר 96 היטב, אחד הוא מסוגל לנתח את אותה הכמות של דגימות בשעה thaלא היה לוקח ימים כדי לפקח על ידי שיטות gravimetric. יתר על כן, על ידי כיול באמצעות מדגמים מייצגים של מיני אצות הרצויים בשיטה זו מייצרת מדידות מדויקות יחסית אשר מתייחסות ישירות לפירוש. קיימים פרוטוקולים רבים מתאר שיטות של מכתים את האצות עם הנילוס האדום מותאמים לזנים ויישומים שונים; הפרוטוקול המובא כאן פותח במקור על ידי דה לה הוז סיגלר ואח'. 11 לprotothecoides Auxenochlorella, vulgaris כלורלה, dimorphus Scenedesmus, וobliquus Scenedesmus, למרות שסביר להניח מתאים למינים רבים נוספים וכיתות. זה תוכנן עם היישום הספציפי של ביצועי Bioprocess ניטור וזה עובד באותה המידה גם עבור דגימות מיובשות בעבר ודגימות רטובות מתרבות הולך וגדל.
Protocol
Representative Results
Discussion
האצות המשמשות בעקומה סטנדרטית חייבים להיות אותו המין טיפח באותם תנאים ניסיוניים כמו אלה שנמדדו. שינויים משמעותיים בהרכב תקשורת, טכניקת טיפוח, ופרוטוקול מכתים יכולים להשפיע על עוצמת קריאת הקרינה. חילוץ הקסאן (המתואר בסעיפי 1 ו -2) שימש כדי לקבוע את תוכן שומנים הניטרלי ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות למדעי הטבע והנדסת מועצת מחקר של קנדה למתן תמיכה כספית לפרויקט זה.
Materials
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur Glass Pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (Alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
- Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).
- . National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy. U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , (2010).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy. Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Hara, A., Radin, N. S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent. Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).
- Han, Y., et al. Review of methods used for microalgal lipid-content analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
- Pino, E. C., et al. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).
- Izard, J., Limberger, R. J. Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells. J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).
- Chen, W., et al. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures. Algal Res. 1, 176-184 (2012).
- de la Jara, A., et al. Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii. J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).
- Elsey, D., et al. Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids. J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).
- Feng, G. -. D., et al. Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination. Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).
- Guzmán, H., et al. Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions. Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).
- Huang, G. -. H., et al. Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence. Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).
- Lee, S., et al. Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii. Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).
- Montero, M., et al. Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting. J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).
- Vigeolas, H., et al. Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus. J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).
- Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. J. Microbiol. Meth. 87, 17-23 (2011).
- Kou, Z., et al. Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii. J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).
