형광을 사용하여 조류 세포에서 중성 지질을 측정하기위한 간단하고 빠른 프로토콜
Summary
나일 레드 염색 절차를 사용하여 조류 세포의 중성 지질 함량을 결정하기위한 간단한 프로토콜을 설명한다. 이 시간을 절약 할 수있는 기술은 기존의 중량 측정 기반 지질 정량 프로토콜에 대한 대안을 제공합니다. 그것은 모니터링 생물 공정 성능의 특정 애플리케이션을 위해 설계되었다.
Abstract
조류는 자연 지질 저장 기능으로 인해 신 재생 연료 원에 대한 우수한 후보로 간주됩니다. 조류 발효 공정과 새로운 석유가 풍부한 균주에 대한 심사의 강력한 모니터링은 세포 내 지질 함량의 측정을위한 빠르고 신뢰할 수있는 프로토콜을 필요로한다. 현재 관행이 기름 내용을 결정하기 위해 크게 중량 측정 방법에 의존, 기술은 시간이 소요되며 많은 양의 샘플을 필요로 수십 년 전에 개발. 본 논문에서는, 나일 레드, 생물의 다양한 종류의 지질 기관의 존재를 식별하는 데 사용 된 형광 염료는 Auxenochlorella의 protothecoides의 중성 지질 함량, 녹색을 측정하기위한, 간단하고, 빠르고, 믿을 수있는 프로토콜에 통합 조류. 방법은 염색 전에 세포막 및 형광 세기 측정 중에 샘플 용량을 증가 96 웰 마이크로 플레이트를 투과하는, 에탄올, 비교적 온화한 용매를 사용한다. 그것은 설계되었습니다모니터링 생물 공정 성능의 특정 응용 프로그램과 ED. 성장 배양 물로부터 샘플을 건조 또는 살아있는 샘플 분석에 사용될 수있다.
Introduction
인해 특정 스트레스 조건하에 지질 체를 저장할 수있는 능력으로, 조류 전위 재생 연료 원 1,2로서 최근 주목을 받아왔다. 중성 지질은 적절한 성장 조건 3에서 세포 건조 중량의 60 %를 차지하고 있습니다. 그러나 업계는 제대로, 생물 공정의 성능을 모니터링 문화를 분석하고, 새로운 변종에 대한 화면을 위해 조류 세포의 지질 함량을 정량하는, 간단한 청소, 신속하고 신뢰할 수있는 표준화 된 프로토콜을 가지고 있지 않습니다.
Bligh 고 – 다이어 중량 측정 방법은 약 50 년 전에 개발 된 오늘날 4,5 가장 일반적으로 사용되는 기술 중 하나 남아있다. 이 절차는, 간단하고 안정적이며 수행하기 쉬운 반면, 시간 소모적 인 큰 양의 샘플을 필요로하고, 독성 용매를 사용한다. 그것은 발효 실행에서 많은 샘플을 분석하거나 새로운 석유가 풍부한 균주 선별을위한 실용적되지 않습니다. 다른 방법은 ㄱ있다EEN 개발 만, 통상 첨단 장비가 필요하고 6 표준화되지 않았다.
관심의 큰 거래를 얻고있다 대체 나일 레드 얼룩입니다. 나일 레드, 비극성 환경에서 우선적으로 형광 염료, 선충 7, 효모 8, 9 박테리아, 조류 10-19 등 다양한 생물 지질 시체의 신원을 확인하거나 정량하는 데 사용되었습니다. 나일 레드를 포함하는 초기 기술은 단일 베트 광도법 또는 유동 세포 계측법 얼룩을 결합, 주로 정성 또는 반 정량적이었다. 또, 녹조류와 같은 조류의 일부 클래스는 기술 (10)의 범위를 한정 염료에 주로 불 투과성이다 두꺼운 셀 웰있다.
나일 레드 염색법에 최근 개선은 프로토콜 10, 11의 초기 단점을 무시하는보고되었습니다. 카의 존재하에 세포를 염색IER은 DMSO (10)로서 용매 또는 에탄올 10,11 안심 정량적 측정을 허용 유분와 흡광도 사이의 관계를 선형화한다. 용매 나일 레드 분자가 통과 할 수 있도록 세포막을 투과 돕는다. 또한, 마이크로 플레이트 판독 기능을 분광 광도계를 통합하는 것은 정량 분석에 적합한 높은 처리량 프로토콜을 가능하게한다.
이 문서에서 우리는 세부 사항에있는 에탄올, 중성 용매의 존재 나일 레드와 문화를 염색하여 조류 세포의 오일 함량을 측정하는 간단한 방법. 가장 정확하게하기 위해 측정에서 배경 노이즈를 차지하고, 유분으로 형광 강도를 상관 표준 곡선은 공지 된 오일 조성물의 조류 세포를 사용하여 개발된다. 이 방법은 이전에 발행 된 프로토콜 10, 11에서 적응됩니다. 96 – 웰 분광 광도계를 사용하여, 하나는 시간 그쪽에서 샘플의 동일한 양을 분석 할 수있다t는 중량 측정 방법으로 모니터링 할 수 일이 걸릴 것입니다. 또한, 원하는 조류 종의 대표 샘플을 사용하여 교정하여이 방법은 직접 해석 비교적 정확한 측정을 생산하고 있습니다. 다른 긴장과 애플리케이션에 최적화 나일 레드와 조류를 염색하는 방법을 요약 많은 프로토콜이 존재한다; 그것은 더 많은 종과 클래스에 대한 가능성이 적합하지만 여기에 제시된 프로토콜은 원래, Auxenochlorella의 protothecoides에 드 라 Hoz라고 Siegler 등. (11)에 의해 클로렐라 심상 성, Scenedesmus의 dimorphus 및 Scenedesmus의 obliquus을 개발했다. 이 모니터링 생물 공정 성능의 특정 응용 프로그램으로 설계되고있어 성장 문화에서 이전에 건조 된 샘플 및 젖은 샘플 동일하게 작동합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
표준 곡선에 사용 된 조류는 그 측정되는 것과 같은 실험 조건에서 재배 같은 종해야합니다. 미디어 구성, 재배 기술 및 염색 프로토콜의 중요한 변화는 형광 독서의 강도에 영향을 줄 수 있습니다. (섹션 1 및 2에 기재되어 있음)의 헥산 추출에 사용되는 표준 곡선 샘플의 중성 지질 함량을 결정하는 데 사용되었다. 정확한 형광 강도 측정의 경우, 모든 샘플은 같은 미생물 농도 (5g / L이 연구에 사?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는이 프로젝트에 대한 재정 지원을 제공하기 위해 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur Glass Pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (Alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
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